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制备低分子量肝素的方法以及由此获得的低分子量肝素

更新时间:2024-07-13
制备低分子量肝素的方法以及由此获得的低分子量肝素 专利申请类型:发明专利;
源自:西班高价值专利检索信息库;

专利名称:制备低分子量肝素的方法以及由此获得的低分子量肝素

专利类型:发明专利

专利申请号:CN202080100030.3

专利申请(专利权)人:罗维实验室制药股份公司
权利人地址:西班牙,马德里

专利发明(设计)人:G·弗兰科罗德里格斯,I·古铁罗阿杜里兹

专利摘要:本发明涉及一种获取具有高稳定性的低分子量肝素的方法。该方法包括使用H2O2处理解聚肝素,其中每千克解聚肝素使用0.04至1.0升质量浓度为33%的H2O2。本发明还涉及通过该方法获得的肝素。

主权利要求:
1.一种获取平均分子量在3至3.8KDa之间的低分子量肝素的方法,所述方法包括以下步骤:a)制备肝素钠水溶液;
b)向所述步骤a)的溶液中加入苯扎氯铵,获得苯扎氯铵肝素;
c)将所述步骤b)中获得的苯扎氯铵肝素溶于Cl2CH2中,添加TritonB并保持20至40℃的温度,持续24至48小时;
d)使用H2O2对所述步骤c)中获得的解聚肝素进行至少两次处理,每次处理中每千克解聚肝素使用0.04至1.0升质量浓度为33%的H2O2,其中所述步骤d)是在pH值为10.5至11.5之间的条件下进行的,每次使用H2O2处理至少3小时,其中所述低分子量肝素的寡糖链还原端1,6‑脱水残基的含量在1%至15%之间,并且其中1,6‑脱水葡萄糖残基的摩尔比大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基的摩尔比。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤c)中加入TritonB通过最多三次连续加入进行,每次加入TritonB的比例为TritonB与苯扎氯铵肝素重量比0.2:1至0.3:1。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述步骤c)中温度保持在25至35℃。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述步骤c)中温度保持在27至32℃。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述步骤c)包括连续三次加入TritonB,方法是在第一次加入后,维持反应6‑10小时直至第二次加入,在所述第二次加入后,维持反应12‑20小时直至第三次加入,在所述第三次加入后,维持反应6‑10小时。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述步骤d)中每次使用H2O2处理采用的比例为每千克解聚肝素使用0.04至0.5升质量浓度为33%的H2O2。
7.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述步骤d)中每次使用H2O2处理采用的比例为每千克解聚肝素使用0.04至0.3升质量浓度为33%的H2O2。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述步骤d)在20至50℃温度条件下完成。
9.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述步骤d)在25至45℃温度条件下完成。
10.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述步骤d)包括两次处理,第一次处理使用H2O2处理所述步骤c)中获得的解聚肝素,比例为每千克解聚肝素使用0.05至0.25升质量浓度为33%的H2O2,第二次处理使用H2O2的比例为每千克解聚肝素使用0.04至0.25升质量浓度为33%的H2O2。
11.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述每次H2O2处理之间,在甲醇中沉淀解聚肝素。
12.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中通过甲醇沉淀对所获得的低分子量肝素进行纯化。
13.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中对所获得的低分子量肝素进行冻干处理。
14.通过根据权利要求1至13中任一项所述的方法获得的低分子量肝素,其平均分子量在3至3.8KDa之间,其特征在于,其中所述低分子量肝素的寡糖链还原端1,6‑脱水残基的含量在1%至15%之间,并且其中1,6‑脱水葡萄糖残基的摩尔比大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基的摩尔比。
15.根据权利要求14中所述的低分子量肝素,其特征在于,其寡糖链还原端1,6‑脱水残基的含量在4%至11%之间。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的低分子量肝素,其特征在于,其抗FXa活性在
80‑120IU/mg之间,抗FIIa活性在5‑20IU/mg之间。
17.根据权利要求14至15中任一项所述的低分子量肝素,其中所述肝素在室温条件下静置至少24个月,其颜色等级大于或等于《欧洲药典》第2.2.2章方法II中所规定溶液颜色参考范围中的第6级。
18.根据权利要求14至15中任一项所述的低分子量肝素,其中所述肝素在室温条件下静置至少36个月,其颜色等级大于或等于《欧洲药典》第2.2.2章方法II中所规定溶液颜色参考范围中的第6级。 说明书 : 制备低分子量肝素的方法以及由此获得的低分子量肝素技术领域[0001] 本发明涉及一种制备低分子量肝素(LMWH)的方法以及由此获得的低分子量肝素。背景技术[0002] 肝素是糖胺聚糖家族的一种多糖,由糖醛酸(L‑艾杜糖醛酸或D‑葡萄糖醛酸)和D‑葡萄糖胺交替结合而成。L‑艾杜糖醛酸可以被2‑O‑硫酸化,D‑葡萄糖醛酸可以被N‑硫酸化和/或6‑O‑硫酸化,并在较小程度上被N‑乙酰化或3‑O‑硫酸化。肝素在大多数情况下以钠盐形式使用,但也可以其他碱金属或碱土金属盐的形式使用,主要用作抗血栓和抗凝血药物。[0003] 根据分子量,肝素可被分为普通肝素(UFH)、LMWH和极低分子量肝素(VLMWH)。LMWH和VLMWH来自于原始UFH的解聚。[0004] 在现有技术内已描述了多种制备LMWH的方法。其中之一是通过β‑消除机制进行碱解聚。[0005] EP0040144描述了一种通过包含以下步骤的方法获取LMWH的方法:将肝素盐转盐为肝素季铵盐,使肝素季铵盐与苄基氯进行酯化反应,纯化并获取肝素苄酯钠盐,使用氢氧化钠解聚,酯皂化并纯化产物。[0006] EP1070503描述了一种通过包含以下步骤的方法获取LMWH的方法:将肝素盐转盐为苯扎氯铵肝素,在非水介质中使用TritonB解聚并纯化产物。[0007] EP2881404描述了一种获取LMWH的方法,包括转盐,然后用磷苯碱或胍基衍生碱进行解聚,最后进行转盐。[0008] 需要更可重复且更稳定的方法来获取LMWH,特别是稳定性更好的LMWH。发明内容[0009] 本发明的发明人发现了一种制备低分子量肝素(LMWH)的方法,通过该方法制备的产品不仅具备高稳定性,同时还保持了良好的抗FXa和抗FIIa活性。该LMWH的制备方法包括使用H2O2处理解聚肝素粗品,其中每千克解聚肝素中使用0.04至1.0升质量浓度为33%的H2O2。[0010] 因此,在第一方面,本发明涉及一种获取平均分子量在3至3.8KDa之间的低分子量肝素的方法,该方法包括以下步骤:[0011] a)制备肝素钠水溶液;[0012] b)向步骤a)的溶液中加入苯扎氯铵,获得苯扎氯铵肝素;[0013] c)将步骤b)中获得的苯扎氯铵肝素溶于Cl2CH2中,添加TritonB并保持20至40℃的温度,持续24至48小时;[0014] d)使用H2O2对步骤c)中获得的解聚肝素进行至少两次处理,每次处理中每千克解聚肝素使用0.04至1.0升质量浓度为33%的H2O2。[0015] 在第二方面,本发明涉及通过本发明的方法获得的低分子量肝素。[0016] 已发现在所获得的LMWH中,1,6‑脱水残基的含量在1%至15%之间。因此,在第三方面,本发明涉及一种平均分子量在3至3.8KDa之间且寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间的低分子量肝素。[0017] 针对一方面描述的定义和实施方案同样适用于本发明的其他方面。[0018] 在本发明中,“低分子量肝素”或“LMWH”应理解为《欧洲药典》第九版“肝素”下“低分子量肝素专论”0828(Heparins,Low‑Molecular‑Massmonograph,0828,EuropeanPharmacopeia9thEd.)中所述的从肝素获得的多糖混合物,其平均分子量小于8,000道尔顿,且其总质量中至少60%的成分的分子量小于8,000Da。本发明中LMWH的平均分子量按照《欧洲药典》(第九版)中的方法测定。[0019] 在本发明中,“1,6‑脱水残基”应理解为在解聚过程中在LMWH末端产生的各种化学基团。这些基团包括但不仅限于2‑磺胺‑1,6‑脱水‑2‑脱氧‑β‑D‑吡喃葡萄糖(1,6‑脱水葡萄糖胺)和2‑磺胺‑1,6‑脱水‑2‑脱氧‑β‑D‑甘露糖(1,6‑脱水甘露糖胺)。该类残基在LMWH中的数量以还原端存在该类残基的寡糖链的百分比表示。[0020] LMWH中1,6‑脱水残基末端的含量可通过《欧洲药典》第九版“依诺肝素钠专论”1097(EnoxaparinSodiummonograph,1097,EuropeanPharmacopeia9thEd)提及的鉴定方法B中所述分析方法得出。在该方法中,使用肝素酶I、II和III的混合物对分子进行彻底解聚,分离并采用强阴离子交换色谱法(SAX‑HPLC)对产生的残基进行定量。例如,1,6‑脱水残基的含量根据以下公式确定:[0021] %1,6‑脱水残基=Mw·(A1+A2+A3)·100/ΣMwx·Ax[0022] 其中:[0023] ‑Mw表示平均分子量[0024] ‑Mwx表示衍生物x的分子量(参见《欧洲药典》第九版“依诺肝素钠专论”1097表1097‑1(EnoxaparinSodiummonograph,1097,EuropeanPharmacopeia9thEd))[0025] ‑Ax表示衍生物x的峰面积[0026] ‑A1表示1,6‑脱水残基衍生物的峰面积ΔIS[0027] ‑A2表示1,6‑脱水残基衍生物的峰面积ΔIIS[0028] ‑A3表示1,6‑脱水残基衍生物的峰面积ΔIS‑IS[0029] LMWH中1,6‑脱水葡萄糖胺残基和1,6‑脱水甘露糖胺残基的比例可通过核磁共振1 13 1 13(NMR),例如通过H CHSQC确定。这两种残基的比率可通过整合其各自在H CHSQC中相应的信号来确定。[0030] 本发明中LMWH的抗FXa和抗FIIa活性通过《欧洲药典》(第九版专论0828)所述的发色底物法测定,以每毫克国际单位表示。[0031] LMWH的颜色等级可根据《欧洲药典》第2.2.2章中所述的方法II确定。[0032] 术语“室温”是指介于20至25℃之间的温度。[0033] 如本文中所使用的,术语“约”是指给定值的±10%。[0034] 本发明中LMWH的平均分子量(Mw)在3至3.8KDa之间,优选地在3至3.6KDa之间。[0035] 在一个实施方案中,本发明中LMWH在其寡糖链还原端的1,6‑脱水残基含量为1%至15%;优选为2%至13%,更优选为4%至11%。[0036] 优选地,本发明中LMWH的1,6‑脱水葡萄糖胺残基的摩尔比大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基的摩尔比。在一个具体实施方案中,LMWH的1,6‑脱水葡萄糖胺残基与1,6‑脱水甘露糖胺残基的摩尔比为1:1至3:1,优选为1:1至2.5:1或1.05:1至2.5:1。[0037] 在本发明的一个具体实施方案中,LMWH的平均分子量在3至3.8KDa之间,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,二者之比优选为1:1至3:1。[0038] 优选地,本发明中LMWH的抗FXa活性为80‑120IU/mg,抗FIIa活性为5‑20IU/mg。在一个具体实施方案中,抗FXa活性表现为95‑120IU/mg,抗FIIa活性表现为10‑20IU/mg。[0039] 在本发明的一个具体实施方案中,LMWH的平均分子量在3至3.8KDa之间,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量为1%至15%,1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,二者之比优选为1:1至3:1,抗FXa活性为80‑120IU/mg,抗FIIa活性为5‑20IU/mg。[0040] 优选地,本发明中LMWH在室温和60%相对湿度条件下放置至少24个月,优选地至少36个月后,其颜色等级大于或等于《欧洲药典》第2.2.2章(方法II)中所述溶液颜色参考范围中的第6级。颜色等级可按照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中的方法测定,也可以使用比色计自动测定。[0041] 已发现本发明中的LMWH具有高稳定性。具体地,已观察到其在室温和60%相对湿度条件下至少24个月内保持稳定,甚至在至少36个月内保持稳定。[0042] 在一方面,本发明涉及一种获取平均分子量在3至3.8KDa之间的低分子量肝素的方法,该方法包括以下步骤:[0043] a)制备肝素钠水溶液;[0044] b)向步骤a)的溶液中加入苯扎氯铵,获得苯扎氯铵肝素;[0045] c)将步骤b)中获得的苯扎氯铵肝素溶于CH2Cl2中,添加TritonB并保持20至40℃的温度,持续24至48小时;[0046] d)使用H2O2对步骤c)中获得的解聚肝素进行至少两次处理,每次处理中每千克解聚肝素使用0.04至1.0升质量浓度为33%的H2O2。[0047] 低分子量肝素的具体和优选实施方案见本文前文的定义。[0048] 在一个具体实施方案中,步骤a)的肝素钠水溶液由从猪肠粘膜中获得的肝素制备。[0049] 步骤c)中加入TritonB可通过一次或多次连续加入法完成,例如1、2、3或4次连续加入TritonB。[0050] 在一个具体实施方案中,步骤c)中加入TritonB最多通过三次连续加入完成,例如1、2或3次,每次加入TritonB的比例为TritonB与苯扎氯胺肝素重量比0.2:1至0.3:1。优选地,步骤c)中加入TritonB通过三次连续加入完成,每次加入TritonB的比例优选为TritonB与苯扎氯胺肝素重量比0.2:1至0.3:1。[0051] 在本发明的一个实施方案中,步骤c)中加入TritonB通过三次连续加入完成,方法为在第一次加入后,维持反应6‑10小时直至第二次加入,在第二次加入后,维持反应12‑20小时直至第三次加入,在第三次加入后,维持反应6‑10小时。在另一个实施方案中,在第一次加入后,维持反应7‑9小时直至第二次加入,在第二次加入后,维持反应14‑18小时直至第三次加入,在第三次加入后,维持反应7‑9小时。在又一个实施方案中,第一次、第二次和第三次加入后的反应时间分别为约8小时、约16小时和约8小时。[0052] 在一个实施方案中,步骤c)中温度保持在25至35℃,优选地27至32℃。[0053] 在一个优选实施方案中,步骤d)中使用H2O2处理解聚肝素的水溶液。[0054] 优选地,步骤d)中每次使用H2O2处理采用的比例为每千克解聚肝素使用0.04至0.5升质量浓度为33%的H2O2,优选地每千克解聚肝素使用0.04至0.3升质量浓度为33%的H2O2。在一个具体实施方案中,步骤d)中每次使用H2O2处理采用的比例为每千克解聚肝素使用0.04至0.2升质量浓度为33%的H2O2。在一个优选实施方案中,步骤d)包括两次处理,第一次处理使用H2O2处理步骤c)中获得的解聚肝素,比例为每千克解聚肝素使用0.05至0.25升质量浓度为33%的H2O2,第二次处理使用H2O2的比例为每千克解聚肝素使用0.04至0.25升质量浓度为33%的H2O2。[0055] 在另一个实施方案中,步骤d)包括三次使用H2O2处理。[0056] 优选地,步骤d)在20至50℃温度条件下完成,优选地在25至45℃之间。[0057] 优选地,每次使用H2O2处理的持续时间至少为3小时。例如,持续3至20小时。在一个具体实施方案中,第一次使用H2O2处理的持续时间为12至20小时,优选地14至18小时。优选地,第二次和后续使用H2O2处理的持续时间为3至7小时,优选地4至6小时。[0058] 在一个优选实施方案中,步骤d)在pH值介于10.5至11.5的条件下完成。此外,本发明的方法可以包括一个补充步骤,即每次在步骤d)中使用H2O2处理后,在甲醇中沉淀解聚肝素。在一个具体实施方案中,使用H2O2进行两次处理,在两次使用H2O2处理之间,在甲醇中沉淀解聚肝素。在另一个实施方案中,使用H2O2进行三次处理,在第一次和第二次使用H2O2处理之间以及第二次和第三次使用H2O2处理之间,在甲醇中沉淀解聚肝素。[0059] 优选地,在步骤d)中使用H2O2进行第一次处理后,在乙酸钠甲醇溶液中沉淀解聚肝素。[0060] 在一个优选实施方案中,通过甲醇沉淀对根据本发明的方法获得的LMWH进行纯化。[0061] 所获得的LMWH可以进行冻干处理。附图说明[0062] 图1为根据本发明的方法获得的LMWH的1HNMR光谱,其中异构区放大。[0063] 图2为根据本发明的方法获得的LMWH的1H13CHSQC光谱,其中异构区放大。实施例[0064] 下文提供的具体实施例用于说明本发明的性质。这些实施例仅出于说明目的,不应解释为对本发明的限制。[0065] 实施例1[0066] 将10克肝素钠溶于纯水,搅拌并加入质量浓度为50%的苯扎氯铵溶液,形成苯扎氯铵肝素。对所形成的产物水洗数次,去除多余的氯化物,最后通过冻干对产物进行干燥。将苯扎氯铵肝素溶于二氯甲烷中,调节温度至30±5℃。加入质量浓度为40%的苄基三甲基氢氧化铵(TritonB)甲醇溶液,TritonB与苯扎氯铵肝素的重量比为0.25:1,并在上述温度下静置反应。重复加入两次TritonB,在第一次加入后静置8小时,在第二次加入后静置16小时,在第三次加入后静置8小时。[0067] 在pH值为10.5至11.5的条件下,向解聚产物溶液中加入质量浓度为33%的H2O2,其中每千克苯扎氯铵肝素加入0.1±10%升质量浓度为33%的H2O2,在30±5℃温度条件下静置反应3小时以上(14至18小时)。反应时间结束后,在乙酸钠甲醇溶液中沉淀,离心分离出低分子量肝素粗品。[0068] 将该低分子量肝素粗品溶于水中,再次使用甲醇沉淀。将沉淀物溶于纯净水中,使用质量浓度为33%的H2O2处理,其中每千克苯扎氯铵肝素加入0.08±10%升重量浓度为33%的H2O2,保持40±2℃的温度3小时以上(约5小时)。反应时间结束后,中和溶液并使用甲醇沉淀。[0069] 将沉淀物再次溶于纯净水中,并再次使用重量浓度为33%的H2O2处理,其中每千克苯扎氯铵肝素加入0.05±10%升,保持40±2℃的温度3小时以上(约5小时)。反应时间结束后,中和溶液并使用甲醇沉淀。[0070] 除非另有说明,否则在本实施例以及所有其他实施例中,进行解聚和第一次过氧化氢处理的溶液中,苯扎氯铵肝素的质量浓度均为20±2%。在不同阶段中加入的过氧化氢量以苯扎氯胺肝素和解聚肝素为参照均相同,因为在不同阶段中加入TritonB后,反应中存在的苯扎氯胺肝素解聚生成解聚肝素。[0071] 将纯化后的产物溶于水中并冻干,获得6.00克低分子量肝素,其平均分子量为3241Da,抗FXa活性为118IU/mg,抗FIIa活性为13.7IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,其中1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,这与其他低分子量肝素不同。[0072] 该低分子量肝素还表现出室温条件下24‑36个月的稳定性优势,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。[0073] 颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下24至36个月内是稳定的。[0074] 实施例2[0075] 从10克肝素钠开始,重复实施例1中的步骤,获得6.01克低分子量肝素,其平均分子量为3259Da,抗FXa活性为103IU/mg,抗FIIa活性为15.2IU/mg。该低分子量肝素表现出的特点为其寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,其中1,6‑脱水葡糖胺残基含量大于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,这与其他低分子量肝素不同。[0076] 该低分子量肝素还表现出室温条件下24‑36个月的稳定性优势,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。[0077] 颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下24至36个月内是稳定的。[0078] 实施例3[0079] 将10克肝素钠溶于纯水,搅拌并加入质量浓度为50%的苯扎氯铵溶液,形成苯扎氯铵肝素。对所形成的产物水洗数次,去除多余的氯化物,最后通过冻干对产物进行干燥。[0080] 将苯扎氯铵肝素溶于二氯甲烷中,调节温度至30±5℃。加入质量浓度为40%的苄基三甲基氢氧化铵(TritonB)甲醇溶液,TritonB与苯扎氯铵肝素的重量比为0.25:1,并在上述温度下静置反应。重复加入两次TritonB,在第一次加入后静置8小时,在第二次加入后静置16小时,在第三次加入后静置8小时。[0081] 在pH值为10.5至11.5的条件下,向解聚产物溶液中加入质量浓度为33%的H2O2,其中每千克苯扎氯铵肝素加入0.1±10%升质量浓度为33%的H2O2,在30±5℃温度条件下静置反应16小时。反应时间结束后,在乙酸钠甲醇溶液中沉淀,离心分离出低分子量肝素粗品。[0082] 将该低分子量肝素粗品溶于水中,再次使用甲醇沉淀。将沉淀物溶于纯净水中,在40±2℃的温度条件下使用质量浓度为33%的H2O2处理,其中每千克苯扎氯铵肝素加入0.08±10%升质量浓度为33%的H2O2。反应5小时后,中和溶液并使用甲醇沉淀。[0083] 将纯化后的产物溶于水中并冻干,获得5.21克低分子量肝素,其平均分子量为3269Da,抗FXa活性为119IU/mg,抗FIIa活性为13.70IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,其中1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,这与其他低分子量肝素不同。[0084] 该低分子量肝素还表现出室温条件下24‑36个月的稳定性优势,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。[0085] 颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下24至36个月内是稳定的。[0086] 实施例4[0087] 从10克肝素钠开始,重复实施例1中的步骤,获得6.25克低分子量肝素,其平均分子量为3172Da,抗FXa活性为108IU/mg,抗FIIa活性为13.1IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,其中1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,这与诸如依诺肝素等其他低分子量肝素不同。[0088] 该低分子量肝素还表现出室温条件下24‑36个月的稳定性优势,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。[0089] 颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下24至36个月内是稳定的。[0090] 实施例5[0091] 从10克肝素钠开始,重复实施例1中的步骤,获得6.34克低分子量肝素,其平均分子量为3347Da,抗FXa活性为110IU/mg,抗FIIa活性为14.7IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,其中1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基,这与诸如依诺肝素等其他低分子量肝素不同。[0092] 该低分子量肝素还表现出室温条件下24‑36个月的稳定性优势,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下24至36个月内是稳定的。[0093] 实施例6[0094] 从10克肝素钠开始,重复实施例1中的步骤,获得7.11克低分子量肝素,其平均分子量为3400Da,抗FXa活性为119IU/mg,抗FIIa活性为15.0IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,其中1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,这与诸如依诺肝素等其他低分子量肝素不同。[0095] 该低分子量肝素还表现出室温条件下24‑36个月的稳定性优势,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下24至36个月内是稳定的。[0096] 实施例7[0097] 从10克肝素钠开始,重复实施例1中的步骤,获得6.92克低分子量肝素,其平均分子量为3328Da,抗FXa活性为117IU/mg,抗FIIa活性为14.9IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,其中1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,这与诸如依诺肝素等其他低分子量肝素不同。[0098] 该低分子量肝素还表现出室温条件下24‑36个月的稳定性优势,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在24至36个月内是稳定的。[0099] 实施例8[0100] 从10克肝素钠开始,重复实施例3中的步骤,获得7.04克低分子量肝素,其平均分子量为3331Da,抗FXa活性为113IU/mg,抗FIIa活性为15.3IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,其中1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,这与诸如依诺肝素等其他低分子量肝素不同。[0101] 该低分子量肝素还表现出室温条件下24‑36个月的稳定性优势,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下24至36个月内是稳定的。[0102] 实施例9[0103] 从10克肝素钠开始,重复实施例3中的步骤,获得7.09克低分子量肝素,其平均分子量为3366Da,抗FXa活性为115IU/mg,抗FIIa活性为16.0IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量在1%至15%之间,其中1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量,这与诸如依诺肝素等其他低分子量肝素不同。[0104] 该低分子量肝素还表现出室温条件下24‑36个月的稳定性优势,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下24至36个月内是稳定的。[0105] 比较例10(未使用H2O2处理)[0106] 将10克肝素钠溶于纯水,搅拌并加入质量浓度为50%的苯扎氯铵溶液,形成苯扎氯铵肝素。对所形成的产物水洗数次,去除多余的氯化物,最后通过冻干对产物进行干燥。[0107] 将苯扎氯铵肝素溶于二氯甲烷中,调节温度至30±5℃。加入质量浓度为40%的苄基三甲基氢氧化铵(TritonB)甲醇溶液,TritonB与苯扎氯铵肝素的重量比为0.25:1,并在上述温度下静置反应。重复加入两次TritonB,在第一次加入后静置8小时,在第二次加入后静置16小时,在第三次加入后静置8小时。[0108] 在乙酸钠甲醇溶液中沉淀解聚产物溶液,离心分离出低分子量肝素粗品。[0109] 将该低分子量肝素粗品溶于水中,再次使用甲醇沉淀。将沉淀物溶于温度为40±2℃、pH值为11的纯化水中。反应5小时后,中和溶液并使用甲醇沉淀。[0110] 将纯化后的产物溶于水中并冻干,获得5.28克低分子量肝素,其平均分子量为3280Da,抗FXa活性为112IU/mg,抗FIIa活性为13.70IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量为18.5%。[0111] 此外,对1,6‑脱水葡萄糖胺残基与1,6‑脱水甘露糖胺残基的比率进行分析,与之前实施例不同的是,1,6‑脱水甘露糖胺残基多于1,6‑脱水葡萄糖胺残基。[0112] 进一步对与样品颜色相关的稳定性进行分析,发现在室温条件下自第十个月开始,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级为4级。[0113] 颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下超过9个月后将不再稳定,而加入H2O2似乎是造成这种情况的原因。[0114] 比较例11(60℃条件下解聚)[0115] 将10克肝素钠溶于纯水,搅拌并加入质量浓度为50%的苯扎氯铵溶液,形成苯扎氯铵肝素。对所形成的产物水洗数次,去除多余的氯化物,最后通过冻干对产物进行干燥。将苯扎氯铵肝素溶于二氯甲烷中,调节温度至60±5℃。加入质量浓度为40%的苄基三甲基氢氧化铵(TritonB)甲醇溶液,TritonB与苯扎氯铵肝素的重量比为0.25:1,并在上述温度下静置反应。重复加入两次TritonB,在第一次加入后静置8小时,在第二次加入后静置16小时,在第三次加入后静置8小时。[0116] 在pH值为10.5至11.5的条件下,向解聚产物溶液中加入质量浓度为33%的过氧化氢,其中每千克苯扎氯铵肝素加入0.1±10%升质量浓度为33%的H2O2,在30±5℃温度条件下静置反应16小时。反应时间结束后,在乙酸钠甲醇溶液中沉淀,离心分离出低分子量肝素粗品。[0117] 将该低分子量肝素粗品溶于水中,再次使用甲醇沉淀。将沉淀物溶于纯净水中,在40±2℃的温度条件下使用质量浓度为33%的过氧化氢处理,其中每千克苯扎氯铵肝素加入0.08±10%升质量浓度为33%的H2O2。反应5小时后,中和溶液并使用甲醇沉淀。[0118] 将沉淀物再次溶于纯净水中,并再次使用质量浓度为33%的H2O2处理,其中每千克苯扎氯铵肝素加入33%的H2O20.05±10%升,保持40±2℃的温度约5小时。反应时间结束后,中和溶液并使用甲醇沉淀。将纯化后的产物溶于水中并冻干,获得5.10克低分子量肝素,其平均分子量为2341Da,抗FXa活性为109IU/mg,抗FIIa活性为2.8IU/mg,寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量为21%,其中1,6‑脱水葡萄糖胺残基含量远远低于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量。[0119] 进一步对与样品颜色相关的稳定性进行分析,发现在室温条件下自第十个月开始,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级为4级。[0120] 颜色等级是一个与产品稳定性直接相关的参数,可由此确定包装成品在室温条件下超过10‑11个月后将不再稳定,需要通过冷链使产品稳定性维持12个月以上。[0121] 实施例12[0122] 根据《欧洲药典》第九版“依诺肝素钠专论”1097鉴定方法B中所述,对实施例1至11中获得的产物进行分析,以便具体确定1,6‑脱水残基的含量,分析得出以下结果。[0123] 实施例 平均分子量,Da 1,6‑脱水残基含量,%1 3241 82 3259 93 3269 114 3172 85 3347 76 3400 57 3328 58 3331 49 3366 410 3280 18.511 2341 21[0124] 实施例13[0125] 通过核磁共振,具体而言,通过1H‑NMRy1H‑13CHSQC实验对实施例1中获得的产物进行分析。[0126] 1H‑NMR光谱法是研究该类化合物最广泛使用的技术,因为这涉及大量原子核和高回旋磁比率。1.8‑2.1ppm之间的区域对应于可能通过合成加入的还原端N‑乙酰基或甲基的信号。2.8‑4.6ppm之间的区域大部分对应于糖环的信号,且这些信号之间表现为高度重叠,因此很难直接从该区域中提取到结构信息。4.6‑6.0ppm之间的区域为异构化质子所对应的信号。由于该区域信号大幅度减少,因此可以从中提取大量信息。此外,对于通过β‑消除机制获得LMWH的情况,还含有与分子非还原端H4相对应的信号。[0127] 具体地,如文献中所述,对应于1,6‑脱水残基的信号出现在5.57‑5.62ppm之间的区域,分别对应于1,6‑脱水甘露糖胺残基和1,6‑脱水葡萄糖胺残基结构的异构化质子。[0128] 另一个非常重要的该类化合物结构表征二维实验是1H‑13CHSQC(异核单量子相关谱),该方法是将质子的化学位移与碳13的化学位移相关联,可由此确定GAG衍生寡糖的初级结构和单糖组成。[0129] 通过该二维技术实现光谱色散的增大,可以对相应一维谱中重叠信号的整合进行量化。如文献中所述,且如实施例1中所获得产物样品相对应的图1和图2中所示,对应于1,6‑脱水残基的信号出现在5.57‑103.9ppm之间的区域和5.61‑104.3ppm之间的区域,分别对应于1,6‑脱水甘露糖胺残基和1,6‑脱水葡萄糖胺残基结构的异构化质子。[0130] 实施例14[0131] 按照1H‑13CHSQC实验技术领域所熟知的方法,对实施例1至11中获得的产物进行分析,以确定2‑磺胺‑1,6‑脱水‑2‑脱氧‑β‑D‑吡喃葡萄糖(1,6‑脱水葡萄糖胺或简称1,6‑an.A)和2‑磺胺‑1,6‑脱水‑2‑脱氧‑β‑D‑甘露糖(1,6‑脱水甘露糖胺或简称1,6‑an.M)残基的含量,得到以下结果。[0132][0133] 实施例15:重现EP1070503实施例1并同样加入过氧化氢进行处理[0134] 按照EP1070503所述,重现了其实施例1,但区别在于:在使用TritonB解聚后,在pH值为10.5至11.5的条件下,使用过氧化氢进行了两次处理,其中第一次是在40±2℃的温度条件下,每千克苯扎氯铵肝素加入0.08升质量浓度为33%的H2O2(反应5小时),第二次是在40±2℃的温度条件下,每千克苯扎氯铵肝素加入0.05升质量浓度为33%的H2O2,反应时间约5小时。[0135] 通过重现EP1070503的实施例1,获得了一种低分子量肝素,其寡糖链还原端1,6‑脱水残基含量为0.3%,而添加上述两次过氧化氢处理后,该含量变为6%。此外,在重现EP1070503的实施例1时,产物1,6‑脱水甘露糖胺残基多于1,6‑脱水葡萄糖胺残基,而当进行了上述过氧化氢处理后,1,6‑脱水葡萄糖胺残基的摩尔比大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基的摩尔比。[0136] 在重现EP1070503的实施例1并对与样品颜色相关的稳定性进行分析时发现,在室温条件下自第十个月开始,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级为4级。而通过上述过氧化物处理,获得的产物在室温条件下24‑36个月内保持稳定,参照《欧洲药典》(第2.2.2章方法II)中规定的参考颜色范围,使用 色度计测量的颜色等级≥第6级。[0137] 实施例16:[0138] 重现实施例1和3,但改变过氧化氢的加入量,每次处理用量的浮动范围为每千克苯扎氯铵肝素(或解聚肝素)加入0.04至1.0升质量浓度为33%的H2O2,反应时间3至20小时。[0139]第一次处理* 第二次处理* 第三次处理*0.2,持续3小时 0.2,持续3小时 ‑0.3,持续3小时 0.3,持续3小时 ‑0.5,持续3小时 0.5,持续3小时 ‑0.6,持续3小时 0.6,持续3小时 ‑0.8,持续3小时 0.8,持续3小时 ‑0.04,持续20小时 0.04,持续20小时 0.04,持续20小时0.08,持续18小时 0.08,持续7小时 0.08,持续7小时0.1,持续16小时 0.1,持续5小时 0.1,持续5小时0.25,持续14小时 0.25,持续4小时 0.25,持续4小时0.1,持续16小时 0.08,持续5小时 0.05,持续5小时0.04,持续18小时 0.05,持续7小时 ‑[0140] *每千克苯扎氯铵肝素中加入的质量浓度为33%的H2O2量,单位:升在所有情况下,获得的肝素的平均分子量均为3‑3.8KDa,抗FXa活性为80‑120IU/mg,抗FIIa活性为5‑20IU/mg。[0141] 同样,在所有情况下,获得的肝素寡糖链还原端1,6‑脱水残基的含量在1至15%之间,且1,6‑脱水葡萄糖残基含量大于或等于1,6‑脱水甘露糖胺残基含量。

专利地区:西班

专利申请日期:2020-11-10

专利公开日期:2024-06-18

专利公告号:CN115485308B

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