一种核酸提取试剂及其试剂盒以及快速萃取分离纯化核酸的方法

专利名称：一种核酸提取试剂及其试剂盒以及快速萃取分离纯化核酸的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210471922.5

专利申请（专利权）人：杭州新景生物试剂开发有限公司
权利人地址：浙江省杭州市西湖区西园一路8号4幢5层501室

专利发明（设计）人：徐小寅,张文彬,郝梦雅

专利摘要：本发明公开了一种核酸提取试剂，包括亲蛋白类的有机化合物、盐、去分相试剂和纯水，基于所述的亲蛋白类的有机化合物、盐、去分相试剂和纯水，各组分的质量分数为：亲蛋白类的有机化合物30～60％、盐20％～40％、去分相试剂5～15％，纯水10～30％。本发明还提供所述核酸提取试剂用来快速萃取分离纯化核酸的应用。本发明的核酸萃取方法只需将生物样本加入一个核酸提取试剂溶液中，该溶液包含了裂解生物样本和萃取核酸两个功能，混匀后离心，即可达到裂解样本和萃取核酸一步完成的效果。同时，由于在上清液中已经含有高浓度的盐溶液，可以直接取上清加入含有二氧化硅介质的纯化柱中进行核酸的进一步纯化。本发明无需加入氯仿即可萃取核酸，简便、快速，成本低廉。

主权利要求：
1.一种核酸提取试剂，其特征在于所述的核酸提取试剂的配方为以下之一：配方（一）环己醇48 50%，盐酸胍18 20%，硫氰酸钾5 6%，乙酸5 6%，乙酸钾2 3%，Tris~ ~ ~ ~ ~
0.3 0.5%，EDTA0.2 0.3%,纯水15 20%；
~ ~ ~
配方（二）环己醇30 35%、苯酚10 15%，硫氰酸胍10 12%、氯化铵8 10%、硫氰酸钠10~ ~ ~ ~ ~
15%，丙三醇4 6%，乙酸1 2%，乙酸钠0.1 0.5%，纯水13 15%;~ ~ ~ ~
配方（三）苯酚30 35%，盐酸胍3 5%，硫氰酸铵23 28%，乙醇10 15%，乙酸0.3 0.8%，乙酸~ ~ ~ ~ ~铵1 2%，纯水20 26%；
~ ~
配方中均为质量百分分数。
2.如权利要求1所述的核酸提取试剂，其特征在于所述的核酸提取试剂的配方为以下之一：配方（一）：环己醇50%，盐酸胍20%，硫氰酸钾5%，乙酸5%，乙酸钾2%，Tris0.5%，EDTA
0.25%,纯水17.25%；
配方（二）环己醇30%、苯酚15%，硫氰酸胍10%、氯化铵10%、硫氰酸钠15%，丙三醇5%，乙酸
1%，乙酸钠0.25%，纯水13.75%；
配方（三）苯酚30%，盐酸胍5%，硫氰酸铵25%，乙醇12.5%，乙酸0.5%，乙酸铵1.5%，纯水
25.5%。
3.用于大量提取全血DNA的核酸提取试剂，其特征在于所述试剂的配方为：环己醇50%，盐酸胍20%，硫氰酸钾5%，乙酸5%，乙酸钾2%，Tris0.5%，EDTA0.25%,纯水17.25%。
4.快速全血DNA大量试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包括核酸提取试剂BufferL7，所述核酸提取试剂BufferL7试剂由以下质量分数的组分组成：环己醇50%，盐酸胍20%，硫氰酸钾5%，乙酸5%，乙酸钾2%，Tris0.5%，EDTA0.25%,纯水17.25%。
5.用于提取全血总RNA的核酸提取试剂，其特征在于所述试剂的配方为环己醇30%、苯酚15%，硫氰酸胍10%、氯化铵10%、硫氰酸钠15%，丙三醇5%，乙酸1%，乙酸钠0.25%，纯水
13.75%。
6.全血总RNA试剂盒，特征在于所述试剂盒中包括核酸提取试剂BufferL9，所述核酸提取试剂BufferL9试剂由以下质量分数的组分组成：环己醇30%、苯酚15%，硫氰酸胍10%、氯化铵10%、硫氰酸钠15%，丙三醇5%，乙酸1%，乙酸钠0.25%，纯水13.75%。
7.用于提取生物样本中的RNA的Simzol试剂，可替代Trizol试剂，其特征在于所述试剂的配方为苯酚30%，盐酸胍5%，硫氰酸铵25%，乙醇12.5%，乙酸0.5%，乙酸铵1.5%，纯水25.5%。
8.如权利要求1或2所述的核酸提取试剂的应用，所述应用是利用核酸提取试剂来快速萃取分离纯化核酸，其特征在于所述应用的方法包括以下步骤：（1）将生物样本加入核酸提取试剂中，边加样本边剧烈混匀，至核酸提取试剂由透明状转变成悬浊液，生物样本为固态、总体积较少或者含水量较低时，可再加少量水至形成悬浊液，将悬浊液经过高速离心分离，蛋白质组分被萃取到亲蛋白的有机化合物下相中，核酸则溶解在水上相中，取上相得到提取的核酸粗品；
（2）核酸粗品经过纯化得到核酸纯品。 说明书 : 一种核酸提取试剂及其试剂盒以及快速萃取分离纯化核酸的
方法技术领域[0001] 本发明涉及一种核酸提取试剂及其试剂盒以及快速萃取分离纯化核酸的方法。背景技术[0002] 核酸包括脱氧核糖核酸(核酸)和核糖核酸(RNA),是所有生命个体遗传物质的载体。随着现代基因检测技术不断地应用到各行各业中，核酸的分离纯化技术成为一项关键技术。[0003] 传统的核酸萃取分离法纯化方法是用SDS(十二烷基磺酸钠)、硫氰酸胍、CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB.十六烷基三甲基溴化铵)TX‑100、等试剂裂解生物样本，然后经酚/氯仿(有毒性)萃取去除蛋白质，使核酸释放到水相上清中，上清液中的核酸再经乙醇或异丙醇沉淀回收。传统的核酸萃取方法通常需要经过溶解样本、酚氯仿抽提、醇沉淀核酸、核酸洗涤与干燥、核酸的重溶5个步骤，操作起来非常复杂，并且纯化的核酸中仍存留一部分蛋白质、多糖等物质，需采用其它形式的纯化方法进一步纯化核酸。[0004] 具体的，现有的核酸分离纯化技术主要为以下几种：[0005] 1.SDS酚氯仿抽提法：采用SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K液溶解生物样本，再加入酚/氯仿抽提消化后的生物样本，经离心收集含有核酸上清液，再经乙醇或异丙醇沉淀收集核酸，再进行进一步纯化。该种方法主要用于动物组织DNA的分离纯化，并且含有核酸的上清液需要经过醇沉的沉淀除去SDS后才可过柱，或者需要加入高浓度盐溶液作为柱纯化结合液，才能进一步纯化。含有核酸的上清液无法直接加入二氧化硅介质的纯化柱中对核酸做进一步纯化。[0006] 2.CTAB氯仿抽提法：先在研钵中研碎生物样本，再加入CTAB缓冲液溶解已研碎的生物样本中的细胞，然后加入氯仿抽提溶解后的细胞释放物，经离心收集含有核酸上清液，再经乙醇或异丙醇沉淀收集核酸。该种方法主要用于植物等杂质较多的生物样本的核酸分离纯化，同样含有核酸的上清液也无法直接加入二氧化硅介质的纯化柱中对核酸做进一步纯化。[0007] 3.Trizol试剂法：Trizol试剂主要由硫氰酸胍、乙酸及苯酚混合而成。加入Trizol溶解已经被研碎的生物样本，然后加入氯仿萃取溶解物中的苯酚，经离心氯仿与苯酚形成下层有机相(包括易溶于苯酚的、或者被苯酚变性的一些蛋白质和DNA)，RNA溶解在上层水相，上层水相再经异丙醇沉淀收集RNA。该种方法主要用于生物样本的RNA分离纯化。[0008] 综上所述，三种传统的核酸萃取方法无一例外均需要加入氯仿抽提，用作萃取苯酚或者CTAB等有机化合物，其本质是吸附溶解在这些苯酚或者CTAB中的蛋白质，达到将蛋白质与核酸分子分离的目的。[0009] 氯仿是一种无色透明液体，有特殊气味，味甜，高折光，不燃，质重，易挥发的试剂。氯仿纯品对光敏感，遇光照会与空气中的氧作用，逐渐分解而生成剧毒的光气(碳酰氯)和氯化氢。对人体有毒害作用，主要作用于中枢神经系统，且被世界卫生组织国际癌症研究机构列入2B类致癌物清单中，因此《分子克隆实验指南.精编版》679页，附录4明确指出使用氯仿时要戴合适的手套和安全眼镜并始终在化学通风橱里进行。[0010] 随着当今市场上核酸检测技术的进一步普及应用，市场迫切要求一种不需要添加氯仿的核酸萃取方法。发明内容[0011] 本发明的技术目的是，提供一种无需氯仿的核酸提取试剂，并提供含有该核酸提取试剂的试剂盒，可利用所述试剂盒对核酸进行快速萃取分离纯化。[0012] 本发明采用的技术方案是：[0013] 一种核酸提取试剂，所述试剂中包括亲蛋白类的有机化合物、盐、去分相试剂和纯水，基于所述的亲蛋白类的有机化合物、盐、去分相试剂和纯水，各组分的质量分数为：亲蛋白类的有机化合物的质量分数为30～60％、盐的质量分数为20％～40％、去分相试剂的质量分数为5～15％，纯水的质量分数为10～30％。[0014] 优选基于所述的亲蛋白类的有机化合物、盐、去分相试剂和纯水，各组分的质量分数为：亲蛋白类的有机化合物的质量分数为30～50％、盐的质量分数为25％～36％、去分相试剂的质量分数为5～15％，纯水的质量分数为13～26％。[0015] 所述的亲蛋白类的有机化合物为苯酚、环己醇、环戊醇中的一种或多种；优选苯酚、环己醇或两者的混合；亲蛋白类的有机化合物的作用是使蛋白质发生变性，并促使变性的蛋白溶解到亲蛋白的有机化合物中。[0016] 所述的盐为盐酸胍、氯化铵、氯化钠、氯化钾、硫氰酸胍、硫氰酸铵、硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫酸胍、硫酸铵、硫酸钠、乙酸胍、乙酸铵、乙酸钠、乙酸钾中的一种或多种；优选盐酸胍、氯化铵、硫氰酸胍、硫氰酸铵、硫氰酸钠、硫氰酸钾、乙酸钾、乙酸钠、乙酸铵中的一种或多种。高浓度盐离子的作用是使细胞结构溶解，蛋白质的二级结构消失，促使核蛋白和核酸迅速分离，并可在后续的步骤中促使核酸吸附到二氧化硅介质的纯化柱上。[0017] 所述的去分相试剂为乙醇、丙三醇、乙酸、TX‑100、TX‑114、吐温‑20、DMSO中的一种或多种；优选为乙醇、丙三醇、乙酸中的一种或多种。去分相试剂的作用是促进亲蛋白的有机化合物和盐溶液混合成均一透明的溶液，并且协同作用于生物样本中的蛋白质使其溶解变性。[0018] 核酸提取试剂还可以加入少量的缓冲剂，缓冲剂的质量分数为亲蛋白类的有机化合物、盐、去分相试剂和纯水的总质量的0～1％[0019] 缓冲剂的质量分数中，其中的0代表无限接近于0但不为0。[0020] 所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、巴比妥钠、柠檬酸、柠檬酸钠中的一种或多种。[0021] 缓冲剂用作维持核酸稳定的pH缓冲体系。[0022] 所述核酸提取试剂中还可以添加易溶于有机溶剂但不溶于水的染料，便于后续区分有机相和水相。[0023] 进一步，所述的核酸提取试剂的配方优选为以下之一：[0024] 配方(一)环己醇48～50％，盐酸胍18～20％，硫氰酸钾5～6％，乙酸5～6％，乙酸钾2～3％，Tris0.3～0.5％，EDTA0.2～0.3％,纯水15～20％；配方(一)更优选为环己醇50％，盐酸胍20％，硫氰酸钾5％，乙酸5％，乙酸钾2％，Tris0.5％，EDTA0.25％,纯水17.25％；[0025] 配方(二)环己醇30～35％、苯酚10～15％，硫氰酸胍10～12％、氯化铵8～10％、硫氰酸钠10～15％，丙三醇4～6％，乙酸1～2％，乙酸钠0.1～0.5％，纯水13～15％；配方(二)更优选为环己醇30％、苯酚15％，硫氰酸胍10％、氯化铵10％、硫氰酸钠15％，丙三醇5％，乙酸1％，乙酸钠0.25％，纯水13.75％；[0026] 配方(三)苯酚30～35％，盐酸胍3～5％，硫氰酸铵23～28％，乙醇10～15％，乙酸0.3～0.8％，乙酸铵1～2％，纯水20～26％；配方(三)更优选为苯酚30％，盐酸胍5％，硫氰酸铵25％，乙醇12.5％，乙酸0.5％，乙酸铵1.5％，纯水25.5％。[0027] 配方中均为质量百分分数。[0028] 所述的配方(一)可用于大量提取全血DNA，所述配方(二)可用于提取全血总RNA，所述配方(三)可用于提取生物样本中的RNA，可替代Trizol试剂。[0029] 更进一步，本发明还提供用于大量提取全血DNA的核酸提取试剂，所述试剂的配方为：环己醇50％，盐酸胍20％，硫氰酸钾5％，乙酸5％，乙酸钾2％，Tris0.5％，EDTA0.25％,纯水17.25％。[0030] 本发明还提供用于提取全血总RNA的核酸提取试剂，所述试剂的配方为环己醇30％、苯酚15％，硫氰酸胍10％、氯化铵10％、硫氰酸钠15％，丙三醇5％，乙酸1％，乙酸钠0.25％，纯水13.75％。[0031] 本发明还提供用于提取生物样本中的RNA的Simzol试剂，可替代Trizol试剂，所述试剂的配方为苯酚30％，盐酸胍5％，硫氰酸铵25％，乙醇12.5％，乙酸0.5％，乙酸铵1.5％，纯水25.5％。[0032] 本发明将亲蛋白类的有机化合物、盐、去分相试剂和纯水混合而成得到均一透明的缓冲溶液，在加入一定体积的高含水量生物样本，或者低含水量生物样本和纯水后即能分相形成有机相和水相，生物样本中的蛋白类组分聚集在有机相，核酸类组分溶解在水相。从而无需额外添加氯仿再形成分相。[0033] 与传统的酚/氯仿萃取核酸方法的不同点在于：传统的萃取核酸方法都是先溶解生物样本，再加入萃取试剂(不可缺少氯仿的使用)形成分相萃取核酸；本方法创造性地通过在发明的核酸提取试剂中加入样品时形成分相，即在溶解生物样本时，向核酸提取试剂中加入一定体积比的水性生物样本(体液或者血液)，或者低含水量生物样本加纯水，即可形成有机相和水相，达到在水相中萃取核酸的目的，而无需额外的萃取试剂。[0034] 本发明的核酸提取试剂的具体原理及步骤如下：将微溶于水，且亲蛋白的有机化合物(比如苯酚、环己醇、环戊醇等物质)，与易溶于水的盐溶液(比如硫氰酸铵、硫氰酸钾等水溶液)混合后，由于盐溶液强烈地争夺水分子，会导致有机相(苯酚、环己醇等)和水相(硫氰酸铵、硫氰酸钾等盐溶液)的分层，此时如果加入一定比例的去分相试剂(即水溶性较好的有机化合物：比如乙醇、丙三醇、乙酸、DMSO等)，由于这些去分相试剂既易溶解于有机溶剂，也易溶于水，加入后即可消除形成的分相，形成透明均一的有机化合物、盐、去分相试剂的混合溶液。[0035] 当该混合溶液加入一定体积需要处理的生物样本(比如血液、血浆等高含水量样本)，或者低含水量生物样本加纯水后，去分相试剂被稀释，该溶液即重新形成分相。在重新分相的过程中，蛋白组分主要溶解于有机相，核酸组分则溶解在水相，从而达到了核酸与蛋白的快速分离的目的。由于本方法形成的水相中含有高浓度的盐离子溶液，因而溶解在水相中的核酸还可以直接吸附到含有二氧化硅介质的纯化柱上，洗脱后即获得高纯度的核酸，特别适合蛋白含量很高的生物学样本(比如抗凝全血)中核酸的分离纯化。本方法应用于DNA提取时，获得的水相中的DNA溶液还可以直接加入到含有二氧化硅介质的纯化柱中，无需额外添加乙醇，或者调整pH，盐分等条件，DNA就可以吸附到纯化柱上。[0036] 本发明还提供利用核酸提取试剂来快速萃取分离纯化核酸的方法，所述方法包括以下步骤：[0037] (1)将生物样本加入核酸提取试剂中，边加样本边剧烈混匀，至核酸提取试剂由透明状转变成悬浊液，生物样本为固态、总体积较少或者含水量较低时，可再加少量水至形成悬浊液，将悬浊液经过高速离心分离，蛋白质组分被萃取到亲蛋白的有机化合物下相中，核酸则溶解在水上相中，取上相得到提取的核酸粗品；所述高速离心一般是10000×g以上离心1～10分钟；[0038] 所述的生物样本可以为血浆、血清、唾液、尿液等高含水量样本，也可以为植物组织、动物组织、菌种粉末等，对于低含水量样本、固态样本，加样时需要加水以形成分相，也就是悬浊液。[0039] (2)核酸粗品经过纯化得到核酸纯品。所述的纯化可以为异丙醇沉淀、过核酸纯化柱纯化或磁硅珠纯化。[0040] 进一步，所述步骤(2)中，根据所用的核酸提取试剂和提取的核酸不同，有多种纯化方法，提取大量全血DNA时，将核酸粗品直接加入二氧化硅介质的核酸纯化柱中作进一步纯化；提取全血总RNA时，将核酸粗品加入0.7～0.8倍体积乙醇后再加到二氧化硅介质的核酸纯化柱中作进一步纯化；Simzol试剂提取RNA时，将核酸粗品加入0.8～1倍体积的异丙醇沉淀核酸进行纯化。[0041] 通过调整核酸提取试剂中亲蛋白的有机化合物、盐组分、去分相试剂以及水的比例，加入核酸提取试剂中的生物样本体积可以有一定变化，但均有加入液体生物样本混匀后即可萃取核酸的特点。[0042] 本发明还提供快速全血DNA大量试剂盒，所述试剂盒中包括核酸提取试剂BufferL7，所述核酸提取试剂BufferL7试剂由以下质量分数的组分组成：环己醇50％，盐酸胍20％，硫氰酸钾5％，乙酸5％，乙酸钾2％，Tris0.5％，EDTA0.25％,纯水17.25％。[0043] 进一步，所述快速全血DNA大量试剂盒中，包括核酸提取试剂BufferL7，核酸纯化柱、BufferWA、BufferWB、BufferTE；[0044] BufferWA的配方为：5M盐酸胍，20mMTris‑HCl,pH6.6，含38％乙醇(V/V)；[0045] BufferWB的配方为：20mMNaCl，2mMTris‑HCl,pH7.5，含70％乙醇(V/V)；[0046] BufferTE的配方为：10mMTris‑HCl,pH8.0，1mMEDTA。[0047] 本发明还提供利用快速全血DNA大量试剂盒来提取全血DNA的方法，所述方法为：[0048] 全血(EDTA抗凝)样本加入等体积的BufferL7，漩涡振荡混合均匀，得到悬浊液；离心后取所有上清液过核酸纯化柱，核酸纯化柱离心弃滤液，用BufferWA洗涤、BufferWB洗涤、BufferTE洗脱，收集洗脱液即为全血DNA样本。[0049] 本发明还提供全血总RNA试剂盒，所述试剂盒中包括核酸提取试剂Buffer L9，所述核酸提取试剂BufferL9试剂由以下质量分数的组分组成：环己醇30％、苯酚15％，硫氰酸胍10％、氯化铵10％、硫氰酸钠15％，丙三醇5％，乙酸1％，乙酸钠0.25％，纯水13.75％。[0050] 进一步，所述全血总RNA试剂盒中包括核酸提取试剂BufferL9，BufferWA、BufferWBR；[0051] BufferWA的配方为：5M盐酸胍，20mMTris‑HCl,pH6.6，含38％乙醇(V/V)；[0052] BufferWBR的配方为：2mMTris‑HCl,pH7.5，80％乙醇。[0053] 本发明还提供利用全血总RNA试剂盒来提取全血总RNA的方法，所述方法为：[0054] BufferL9加入一半体积的全血(EDTA抗凝)，漩涡振荡混合均匀，得到悬浊液；离心后吸取上清液，加入0.7～0.8倍体积无水乙醇混匀，混合液过核酸纯化柱上，离心弃滤液，用BufferWA洗涤，再用BufferWBR洗涤，RNase‑Free水洗脱，收集洗脱液即为全血总RNA。[0055] 本发明还提供Simzol试剂，所述Simzol试剂的配方为苯酚30％，盐酸胍5％，硫氰酸铵25％，乙醇12.5％，乙酸0.5％，乙酸铵1.5％，纯水25.5％。[0056] 本发明提供利用Simzol试剂提取RNA的方法，所述方法为：生物样本加Simzol试剂，加RNase‑free水用力震荡至浑浊，成悬浮液，室温孵育，离心取上清液，异丙醇沉淀，弃上清，75％乙醇洗涤，得到白色RNA沉淀。[0057] 本发明的核酸萃取方法只需将生物样本加入一个核酸提取试剂溶液中(该溶液包含了裂解生物样本和萃取核酸两个功能)混匀后离心，即可达到裂解样本和萃取核酸一步完成的效果。同时，由于在上清液中已经含有高浓度的盐溶液，可以直接取上清加入含有二氧化硅介质的纯化柱中进行核酸的进一步纯化。[0058] 本发明的有益效果在于：[0059] 1、无需加入氯仿即可萃取核酸[0060] 传统的SDS酚氯仿抽提法、CTAB氯仿抽提法、Trizol试剂法三种核酸萃取方法都必须加入氯仿后才能萃取核酸。由于氯仿属于2B类致癌物，极大地限制了传统的三种核酸萃取方法的使用。本申请不用加入氯仿，直接在核酸提取试剂中一步完成裂解和萃取，无需加入额外的萃取剂。[0061] 2、简便、快速[0062] 传统的核酸萃取方法至少包含裂解样本、酚氯仿抽提萃取核酸、醇沉淀核酸、核酸洗涤与干燥、核酸的重溶5个步骤，本发明创造的核酸提取试剂将溶解样本和核酸萃取步骤合二为一，最多只涉及4个步骤，如果进一步配套核酸柱纯化方法，操作步骤则更加快速，列举如下：[0063] A以快速全血大量DNA试剂盒方法为例[0064] 传统的全血大量DNA分离纯化方法：红细胞去除，白细胞蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，乙醇洗涤，核酸溶解，耗时约1‑2小时。[0065] 使用本发明开发的全血DNA大量试剂盒：样本溶解及核酸萃取，柱纯化，洗脱核酸，用时小于20分钟。[0066] B以全血总RNA试剂盒方法为例[0067] QIAGEN公司的产品(QIAampRNABloodMiniKit)：红细胞裂解液去除红细胞，收集白细胞，溶解白细胞，过滤柱除基因组DNA，加乙醇柱纯化，洗脱核酸，耗时约1小时。[0068] 使用本发明开发的全血总RNA试剂盒：样本溶解及核酸萃取，加乙醇进行柱纯化，洗脱核酸，用时小于20分钟。[0069] 3、降低成本，通常提取核酸的试剂盒中使用的蛋白酶K是昂贵的生化试剂，本发明不使用蛋白酶K。附图说明[0070] 图1实施例1中提取的四份全血DNA电泳图和PCR扩增电泳图。[0071] 图2实施例2提取的四份血样RNA在1％琼脂糖凝胶上的电泳图。[0072] 图3实施例3从4个大肠杆菌DH5α样本中提取到的RNA样本1％琼脂糖凝胶上的电泳图。具体实施方式[0073] 下面以实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。[0074] 从液体生物样本中(比如血浆、血清、唾液、尿液等)或者固体生物样本中分离纯化核酸的商品化试剂盒，如果产品的操作步骤中涉及本发明的核酸提取试剂，加入液体生物样本、或者加入的是固体生物样本物理破碎后加水调整到合适的体积成为液体生物样本的、或者是固体生物样本物理破碎后与核酸提取试剂混合，再加入一定体积的纯水的，且无需添加氯仿即可萃取到核酸，并可取水相中的核酸用异丙醇沉淀或者过柱纯化的，应认为侵犯我公司产品专利，配制该种核酸提取试剂的方法为我公司单独享有。[0075] 实施例1[0076] 快速全血DNA大量试剂盒[0077] 其中包括核酸提取试剂BufferL7，配方为环己醇50％，盐酸胍20％，硫氰酸钾5％，乙酸5％，乙酸钾2％，Tris0.5％，EDTA0.25％,纯水17.25％。[0078] 应用快速全血DNA大量试剂盒提取全血DNA，步骤如下：[0079] 1)在50ml离心管中加入10～15ml全血(EDTA抗凝)，再加入等体积的Buffer L7，漩涡振荡30秒混合均匀，得到悬浊液。[0080] *比如从10ml抗凝血中提取DNA，则应加入10ml的BufferL7。[0081] *必须按1:1比例混合血样和BufferL7，血样少了可能导致后续的分相失败，血样多了可能影响后续DNA的回收效率。[0082] *BufferL7有腐蚀性，请戴防护用品进行操作。[0083] 2)≥10000g离心10分钟。[0084] 3)吸取所有离心上清转移到核酸纯化柱中，核酸纯化柱置于50ml离心心管中，盖上管盖，10000g离心1分钟。[0085] *不要吸取下相及相间沉淀，沉淀物会严重影响最终DNA的纯度。[0086] 4)弃50ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50ml离心管中，在核酸纯化柱中加入8mlBufferWA,盖上管盖，10000g离心1分钟。[0087] *滤液无须彻底弃尽，如果要避免粘附在离心管管口的滤液对离心机的污染，可将2ml离心管在纸巾上倒扣拍击一次。[0088] *确认在BufferWA中已经加入无水乙醇。[0089] 5)弃50ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50ml离心管中，在核酸纯化柱中加入15mlBufferWB,盖上管盖，10000g离心1分钟。[0090] *确认在BufferWB中已经加入无水乙醇。[0091] 6)弃50ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50ml离心管中，≥10000g离心2分钟。[0092] *请勿省略该步骤，否则可能因所纯化的核酸中混有乙醇而影响后续的实验效果。[0093] 7)弃50ml离心管，将核酸纯化柱置于一个用户自备的50ml离心管中，在纯化柱中加入2～4mlBufferTE，盖上管盖，室温静置2分钟，10000g离心1分钟。[0094] 8)弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将DNA储存于‑20℃备用。[0095] 从4个相同的血样中提取到的DNA经微量分光光度计测试数据如下表1，DNA电泳图和PCR扩增后的电泳图如图1所示。[0096] 图1中，泳道1～4：从血液中提取到的DNA样本取3μl在1％琼脂糖凝胶上的电泳效果图。[0097] 泳道5～8：4个DNA样本用PCR扩增β‑球蛋白基因后(Simgen2试剂盒)在1％琼脂糖凝胶上的电泳效果图。泳道9是阴性对照，泳道10是阳性对照。[0098] 表1[0099][0100] 实施例2[0101] 全血总RNA试剂盒[0102] 其中包括核酸提取试剂BufferL9，配方为环己醇30％、苯酚15％，硫氰酸胍10％、氯化铵10％、硫氰酸钠15％，丙三醇5％，乙酸1％，乙酸钠0.25％，纯水13.75％。[0103] 应用全血总RNA试剂盒提取全血总RNA，步骤如下：[0104] 1)在2ml离心管(有盖离心管，用户自备)中加入1mlBufferL9，再加入500μl全血(EDTA抗凝)，漩涡振荡30秒混合均匀，得到悬浊液。[0105] *如果不能及时将新鲜获得的全血或者骨髓进行RNA提取，可在本步骤将溶解后的全血于‑20℃冻存。溶解后的全血在‑20℃至少冻存两个星期以上而不影响RNA的提取效率。[0106] *BufferL9具有腐蚀性，请戴防护用品进行操作。[0107] 2)13000rpm离心10分钟。在一个洁净的1.5ml离心管中加入500μl无水乙醇备用。[0108] 3)吸取700μl离心上清转移到装有无水乙醇的1.5ml离心管中，勿弃吸头，直接用吸头吸注两次混匀，吸取混合液进入步骤4)的操作。[0109] *宁可吸取少于700μl的离心上清也不要吸取下相及相间沉淀，沉淀物会严重影响最终RNA的纯度。[0110] *上清中所含的血色素可在洗涤步骤被除去，不影响最终RNA的纯化效果。[0111] 4)转移600μl步骤3)中的混合液转移到核酸纯化柱(核酸纯化柱置于试剂盒提供的无盖2ml离心管中)中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。[0112] 5)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，将1.5ml离心管中剩余的液体全部倒入核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。[0113] *滤液无须彻底弃尽，如果要避免粘附在离心管管口的滤液对离心机的污染，可将2ml离心管在纸巾上倒扣拍击一次。[0114] 6)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μlBufferWA,盖上管盖，12000rpm离心30秒。[0115] *确认在BufferWA中已经加入无水乙醇。[0116] 7)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700μlBufferWBR,盖上管盖，12000rpm离心30秒。[0117] *确认在BufferWBR中已经加入无水乙醇。[0118] 8)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。[0119] *如果离心机的离心速度达不到14000rpm，则用最高速离心2分钟。[0120] *请勿省略该步骤，否则可能因所纯化的核酸中混有乙醇而影响后续的实验效果。[0121] 9)弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个RNase‑free的1.5ml离心管中，在纯化柱中加入50μlRNase‑FreeWater，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。[0122] *如果离心机没有防泄漏的盖子，请将离心条件改为8000rpm离心1分钟，以免管盖脱落而损伤离心机。[0123] 10)弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将RNA储存于‑70℃备用。[0124] 从4个相同的血样中提取到的RNA经微量分光光度计测试数据如下表2，RNA样本取8μl在1％琼脂糖凝胶上的电泳图如图2所示。[0125] 表2[0126][0127] 实施例3[0128] 用Simzol试剂从大肠杆菌DH5α中提取RNA[0129] Simzol试剂的配方为苯酚30％，盐酸胍5％，硫氰酸铵25％，乙醇12.5％，乙酸0.5％，乙酸铵1.5％，纯水25.5％。[0130] 操作步骤如下：[0131] 1、在研钵中用液氮将约150～250mg菌体研磨至粉末状，用液氮预冷过的1.5ml离心管称取25～50mg研磨成粉末状的菌体，加入500μlSimzol试剂。用装有18‑25号针头的注射器反复抽吸8～10次。注意将针头保持在液面之下，以减少泡沫的产生。[0132] 2、加入200μlRNase‑free水，盖上管盖，用力摇晃15秒，室温孵育5分钟。[0133] *组织样本量为50mg时，建议在室温下孵育15分钟。[0134] 3、12000×g离心15分钟，吸取500μl上清液到一个新的RNase‑free1.5ml离心管中。[0135] 4、加入500μl异丙醇，混合均匀，12000×g离心10分钟，弃上清。[0136] 5、加入1ml75％乙醇，温和地翻转离心管4～6次，8000×g离心5分钟，弃上清。[0137] *如果观察到RNA沉淀较多，可重复步骤5次，以减少RNA中盐分的残留。[0138] 6、盖上管盖，低速离心数秒使管壁上的乙醇沉降到管底。用200μl吸头吸尽残留的乙醇，保留管底及管壁的白色RNA沉淀。无须干燥RNA。[0139] *注意从某些样本中提取RNA时，RNA不是在离心管管底形成白点，而是会以均匀的薄雾状沉淀形式吸附在管壁上。请注意仔细观察并在步骤6作时特别留意将RNase‑free水加到管壁的相应位置上溶解RNA。[0140] 7、加入50～100μlRNase‑free水溶解RNA，并将RNA储存于﹣70℃备用。[0141] 从4个大肠杆菌DH5α样本中提取到的RNA经微量分光光度计测试数据如下表3，RNA样本取8μl在1％琼脂糖凝胶上的电泳图如图3所示。[0142] 表3从4个大肠杆菌DH5α样本提取到RNA数据[0143]

专利地区：浙江

专利申请日期：2022-04-29

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114908081B