融合蛋白发明专利

专利名称：融合蛋白

专利类型：发明专利

专利申请号：CN201980014491.6

专利申请（专利权）人：味之素株式会社
权利人地址：日本东京都中央区京桥一丁目15-1

专利发明（设计）人：井之上一平

专利摘要：本发明提供诸如在新的药物递送系统(DDS)和电子器件的制备之类的用途中具有应用前景的手段。更具体地，本发明提供融合蛋白，其包含(a)铁蛋白单体、和(b)在铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽。本发明还提供多聚体，其包含融合蛋白并具有内腔，该融合蛋白包含(a)铁蛋白单体、和(b)在铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽。

主权利要求：
1.一种融合蛋白，其包含：
(a)人铁蛋白单体、和
(b)在所述人铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽，其中所述功能肽是具有与靶材料结合的能力的肽，并且其中所述柔性连接区是从人铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的区域。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述人铁蛋白单体是人铁蛋白H链。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述人铁蛋白单体是人铁蛋白L链。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至所述融合蛋白的C末端。
5.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至所述融合蛋白的C末端。
6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中，将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至所述融合蛋白的C末端。
7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述靶材料是无机物。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中，所述无机物是金属材料。
9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述靶材料是有机物。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中，所述有机物是生物有机分子。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中，所述生物有机分子是蛋白质。
12.一种多聚体，其包含融合蛋白并具有内腔，所述融合蛋白包含(a)人铁蛋白单体、和(b)在所述人铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽，其中所述功能肽是具有与靶材料结合的能力的肽，并且其中所述柔性连接区是从人铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的区域。
13.根据权利要求12所述的多聚体，其中，所述人铁蛋白单体是人铁蛋白H链。
14.根据权利要求12所述的多聚体，其中，所述人铁蛋白单体是人铁蛋白L链。
15.根据权利要求12所述的多聚体，其中，将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至所述融合蛋白的C末端。
16.根据权利要求13所述的多聚体，其中，将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至所述融合蛋白的C末端。
17.根据权利要求14所述的多聚体，其中，将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至所述融合蛋白的C末端。
18.根据权利要求12所述的多聚体，其中，所述靶材料是无机物。
19.根据权利要求18所述的多聚体，其中，所述无机物是金属材料。
20.根据权利要求12所述的多聚体，其中，所述靶材料是有机物。
21.根据权利要求20所述的多聚体，其中，所述有机物是生物有机分子。
22.根据权利要求21所述的多聚体，其中，所述生物有机分子是蛋白质。
23.一种复合体，其包含(1)根据权利要求12所述的多聚体、和(2)靶材料，其中所述靶材料与所述融合蛋白中的所述功能肽结合。
24.根据权利要求23所述的复合体，其中，所述人铁蛋白单体是人铁蛋白H链。
25.根据权利要求23所述的复合体，其中，所述人铁蛋白单体是人铁蛋白L链。
26.根据权利要求23所述的复合体，其中，将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至所述融合蛋白的C末端。
27.根据权利要求24所述的复合体，其中，将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至所述融合蛋白的C末端。
28.根据权利要求25所述的复合体，其中，将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至所述融合蛋白的C末端。
29.根据权利要求23所述的复合体，其中，所述靶材料是无机物。
30.根据权利要求29所述的复合体，其中，所述无机物是金属材料。
31.根据权利要求23所述的复合体，其中，所述靶材料是有机物。
32.根据权利要求31所述的复合体，其中，所述有机物是生物有机分子。
33.根据权利要求32所述的复合体，其中，所述生物有机分子是蛋白质。
34.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1～6中任一项所述的融合蛋白。
35.一种表达载体，其包含根据权利要求34所述的多核苷酸。
36.一种宿主细胞，其包含根据权利要求34所述的多核苷酸。 说明书 : 融合蛋白技术领域[0001] 本发明涉及融合蛋白等。背景技术[0002] 铁蛋白是球状蛋白质，其普遍存在于从动物和植物到微生物的生物中，并且具有由多个单体形成的内腔。在诸如人等动物中，已知存在H链和L链的两种单体作为铁蛋白，并且铁蛋白是包含24个单体的多聚体(在许多情况中，是H链单体和L链单体的混合物)。另一方面，在微生物中，铁蛋白也被称作Dps (来自饥饿细胞的DNA结合蛋白，DNA‑bindingproteinfromstarvedcells)，并且已知是包含12个单体的多聚体。已知铁蛋白与活生物体和细胞中的铁元素的体内稳态深切相关，并可在其内腔中保持铁，用于发挥诸如输送和贮藏铁之类的生理学功能。已显示，除了铁以外，铁蛋白还能够人工贮藏纳米颗粒，所述纳米颗粒包括金属的氧化物和半导体/磁性物质，所述金属例如为铍、镓、锰、磷、铀、铅、钴、镍和铬，所述半导体/磁性物质例如为硒化镉、硫化锌、硫化铁和硫化镉。因此，对铁蛋白积极研究了其在半导体材料工程领域和医疗领域中的应用(非专利文献1)。[0003] 迄今为止，存在着一些关于铁蛋白单体和肽所形成的融合蛋白的报道，该融合蛋白例如为(1)其中将肽添加到铁蛋白单体的末端区域中的融合蛋白，和(2)其中将肽插入铁蛋白单体的内部区域(末端区域以外的区域)中的融合蛋白。[0004] 例如，作为上述(1)的融合蛋白，已经提供了以下报道。专利文献1和非专利文献1公开了制备在铁蛋白单体的一个末端区域中添加了氧化钛的融合蛋白的特征、以及所制备的融合蛋白用于制备电子器件(例如半导体)的有用性。专利文献2公开了制备在Dps的两个末端区域中添加了所定的肽的融合蛋白的特征，以及所制备的融合蛋白用于制备具有特殊的多孔结构的电子器件的有用性。[0005] 作为上述(2)的融合蛋白，存在着以下报道：在人铁蛋白L链的D区域和E区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区(从铁蛋白单体的N末端起数第5个和第6个α‑螺旋之间的区域)中插入了所定的肽的融合蛋白。例如，非专利文献2和3、以及专利文献3公开了通过在人铁蛋白L链的D区域和E区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区(flexiblelinkerregion)中插入所定的肽(例如白介素‑4受体(IL‑4R)靶肽)来制备融合蛋白多聚体(例如AP1‑PBNC)的特征，以及该多聚体用于治疗诸如癌症之类的疾病的有用性。非专利文献4公开了通过在人铁蛋白L链的D区域和E区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入蛋白酶降解性肽来制备融合蛋白多聚体的特征，以及该多聚体作为蛋白酶响应性递送系统的有用性。[0006] 现有技术文献[0007] 专利文献[0008] 专利文献1：WO2006/126595[0009] 专利文献2：WO2012/086647[0010] 专利文献3:美国专利申请公开第2016/0060307号。[0011] 非专利文献[0012] 非专利文献1：K.Sano等，NanoLett.,2007，第7卷，第3200页[0013] 非专利文献2：JaeOgJeon等，ACSNano(2013)，7(9)，7462‑7471[0014] 非专利文献3：SoojiKim等，Biomacromolecules(2016)，17(3)，1150‑1159[0015] 非专利文献4：YoungJiKang等，Biomacromolecules(2012)，13(12)，4057‑4064。发明内容[0016] 本发明要解决的课题[0017] 本发明的目的是为诸如新的药物递送系统(DDS)和电子器件的制备之类的用途提供有前景的手段。[0018] 解决课题的手段[0019] 作为深入研究的结果，本申请的发明人已发现包含融合蛋白的多聚体可以与靶标强烈地相互作用，该融合蛋白是在各种生物的铁蛋白单体中高度保守的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入了功能肽的融合蛋白。例如，相比于包含在各种生物的铁蛋白单体中高度保守的D区域或随后的区域(例如现有技术报道的D区域和E区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区)中插入了功能肽的融合蛋白的多聚体，此类多聚体可与靶标更强烈地相互作用。因此，本发明人已发现，此类多聚体有前景用于诸如新的药物递送系统(DDS)、电子器件的制备等的用途，并且完成了本发明。[0020] 即，本发明如下所示：[0021] [1]一种融合蛋白，其包含(a)铁蛋白单体、和(b)在铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽；[0022] [2]根据[1]的融合蛋白，其中铁蛋白单体是人铁蛋白单体；[0023] [3]根据[1]或[2]的融合蛋白，其中人铁蛋白单体是人铁蛋白H链；[0024] [4]根据[1]或[2]的融合蛋白，其中人铁蛋白单体是人铁蛋白L链；[0025] [5]根据[1]的融合蛋白，其中铁蛋白单体是Dps单体；[0026] [6]根据[1]‑[5]中任一项的融合蛋白，其中功能肽是具有与靶材料结合的能力的肽；[0027] [7]根据[6]的融合蛋白，其中靶材料是无机物；[0028] [8]根据[7]的融合蛋白，其中无机物是金属材料；[0029] [9]根据[6]的融合蛋白，其中靶材料是有机物；[0030] [10]根据[9]的融合蛋白，其中有机物是生物有机分子；[0031] [11]根据[10]的融合蛋白，其中生物有机分子是蛋白质；[0032] [12]根据[1]‑[11]中任一项的融合蛋白，其中将半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的肽添加至融合蛋白的C末端；[0033] [13]一种多聚体，其包含融合蛋白并具有内腔，所述融合蛋白包含(a)铁蛋白单体、和(b)在铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽；[0034] [14]一种复合体，其包含(1)根据[13]的多聚体、和(2)靶材料,其中靶材料与所述融合蛋白中的功能肽结合；[0035] [15]一种多核苷酸，其编码根据[1]‑[12]中任一项的融合蛋白；[0036] [16]一种表达载体，其包含根据[15]的多核苷酸；[0037] [17]一种宿主细胞，其包含根据[15]的多核苷酸。[0038] 发明的效果[0039] 包含铁蛋白单体和功能肽的融合蛋白的多聚体可与靶标非常强烈地相互作用，所述融合蛋白中在铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入了功能肽。根据本发明，不仅提供具有优异的相互作用能力的此类多聚体，而且提供作为用于制备此类多聚体的单体的融合蛋白、以及使用此类多聚体形成的复合体。根据本发明，还提供有用于制备此类融合蛋白、多聚体和复合体的多核苷酸、表达载体和宿主细胞。附图说明[0040] 图1‑1是表示使用动态光散射法(DLS)针对FTH‑BC‑TBP的不同粒径评价溶液分散性的图。FTH‑BC‑TBP指人来源的铁蛋白H链，其中在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了钛识别肽(minTBP1)；[0041] 图1‑2是表示使用动态光散射法(DLS)针对FTH‑D‑TBP的不同粒径评价溶液分散性的图。FTH‑D‑TBP指人来源的铁蛋白H链，其中在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第四个和第五个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了金识别肽(GBP1)；[0042] 图2是表示使用石英晶体微天平(QCM)方法评价FTH‑BC‑TBP和FTH‑D‑TBP对钛膜的吸附性的图；[0043] 图3是表示通过石英晶体微天平(QCM)方法测量的FTH‑BC‑TBP和FTH‑D‑TBP的不同浓度下的频率变化的图。在测量各浓度下的频率变化之后，对各浓度的倒数与频率变化的倒数之间的相关关系作图，从其斜率求出化学平衡离解常数(dissociationequilibriumconstant)KD值；[0044] 图4是表示对于FHBc用3%磷钨酸染色的透射电子显微镜(TEM)图像(笼状形状)的图。FHBc是人来源的铁蛋白H链，其中在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了癌症识别RGD肽；[0045] 图5是表示使用动态光散射法(DLS)针对包封有氧化铁纳米颗粒的FHBc的不同粒径评价溶液分散性的图；[0046] 图6‑1是表示使用动态光散射法(DLS)针对FTH‑BC‑GBP的不同粒径评价溶液分散性的图。FTH‑BC‑GBP指人来源的铁蛋白H链，其中在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了金识别肽(GBP1)；[0047] 图6‑2是表示使用动态光散射法(DLS)针对FTH‑D‑GBP的不同粒径评价溶液分散性的图。FTH‑D‑GBP指人来源的铁蛋白H链，其中在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第四个和第五个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了金识别肽(GBP1)；[0048] 图7是表示使用石英晶体微天平(QCM)方法评价FTH‑BC‑GBP和FTH‑D‑GBP对金膜的吸附性的图。在测量各浓度下的频率变化之后，对各浓度的倒数与频率变化的倒数之间的相关关系作图，从其斜率求出化学平衡离解常数KD值；[0049] 图8是表示FTL‑BC‑GBP的示意性立体结构的图。FTL‑BC‑GBP指人来源的铁蛋白L链，其中在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了金识别肽(GBP1)；[0050] 图9是表示FTL‑DE‑GBP的示意性立体结构的图。FTL‑DE‑GBP指人来源的铁蛋白L链，其中在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第五个和第六个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了金识别肽(GBP1)；[0051] 图10是表示使用石英晶体微天平(QCM)方法评价FTL‑BC‑GBP和FTL‑DE‑GBP对金膜的吸附性的图。在测量FTL‑BC‑GBP和FTL‑DE‑GBP的各浓度下的频率变化之后，对各浓度的倒数与频率变化的倒数之间的相关关系作图，从其斜率求出化学平衡离解常数KD值；[0052] 图11是表示对于BCDps‑CS4用3%磷钨酸染色的透射电子显微镜(TEM)图像(笼状形状)的图。BCDps‑CS4指无害李斯特菌（Listeriainnocua）来源的Dps，其中在对应于铁蛋白的区域和C末端处插入了异源肽；[0053] 图12是表示使用石英晶体微天平(QCM)方法评价FTH‑BC‑GBP和FTH‑DE‑GBP对金膜的吸附性的图。在测量FTH‑BC‑GBP和FTH‑DE‑GBP的各浓度下的频率变化之后，对各浓度的倒数与频率变化的倒数之间的相关关系作图，从其斜率求出化学平衡离解常数KD值。具体实施方式[0054] 本发明提供融合蛋白，其包含(a)铁蛋白单体、和(b)在铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽。[0055] 铁蛋白(多聚体蛋白质)普遍存在于各种生物中。因此，在本发明中，可以使用各种生物的铁蛋白单体作为构成铁蛋白的铁蛋白单体。铁蛋白单体的来源生物的实例包括高等生物，例如动物、昆虫、鱼类和植物；以及微生物。作为动物，优选哺乳动物或鸟类(例如鸡)，且更优选哺乳动物。哺乳动物的实例包括灵长类(例如人、猴、黑猩猩)、啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔)、以及家畜和使役用的哺乳动物(例如牛、猪、绵羊、山羊和马)。可使用H链或L链的任一种作为铁蛋白单体。可使用天然存在的铁蛋白单体或其突变体的任一种作为铁蛋白单体。[0056] 在一个实施方式中，铁蛋白单体是人铁蛋白单体。从对人的临床应用的观点来看，优选使用人铁蛋白单体作为铁蛋白单体。作为人来源的铁蛋白单体，可以使用人铁蛋白H链或人铁蛋白L链的任一种。[0057] 优选地，人铁蛋白H链可如下所示：[0058] (A1)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白质；[0059] (B1)包含氨基酸序列且具有多聚体(例如24聚体)形成能力的蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQIDNO:2的氨基酸序列中包含选自氨基酸残基的取代、缺失、插入和添加中的一个或数个氨基酸残基的修饰的氨基酸序列；或者[0060] (C1)包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有90%或更高的同源性的氨基酸序列且具有多聚体(例如24聚体)形成能力的蛋白质。[0061] 优选地，人铁蛋白L链可如下所示：[0062] (A2)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的蛋白质；[0063] (B2)包含氨基酸序列且具有多聚体(例如24聚体)形成能力的蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQIDNO:4的氨基酸序列中包含选自氨基酸残基的取代、缺失、插入和添加中的一个或数个氨基酸残基的修饰的氨基酸序列；或者[0064] (C2)包含与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有90%或更高的同源性的氨基酸序列且具有多聚体(例如24聚体)形成能力的蛋白质。[0065] 在另一个实施方式中，铁蛋白单体是微生物铁蛋白单体。微生物铁蛋白也称作Dps。对于Dps而言，根据其来源细菌的种类，有时将其称作NapA、细菌铁蛋白、Dlp或MrgA，并且Dps具有若干亚型，例如DpsA、DpsB、Dps1和Dps2(参见T.HaikarainenandA.C.Papageorgion，Cell.Mol.LifeSci.，2010，第67卷，第341页)。因此，在本发明中，可使用Dps的单体或上述别称蛋白质的单体作为微生物铁蛋白单体。[0066] 作为微生物铁蛋白，已知各种微生物的铁蛋白(例如WO2012/086647)。此类微生物的实例包括属于李斯特菌属（Listeria）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、链球菌属（Streptococcus）、弧菌属（Vibrio）、埃希氏菌属（Escherichia）、布鲁氏菌属（Brucella）、疏螺旋体属（Borrelia）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、异常球菌属(Deinococcus)和棒状杆菌属（Corynebacterium）的细菌。属于李斯特菌属的细菌的实例包括无害李斯特菌（Listeriainnocua）和单核球增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）。金黄色葡萄球菌（StaphylococcusAureus）是属于葡萄球菌属的细菌的实例。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是属于芽孢杆菌属的细菌的实例。属于链球菌属的细菌的实例包括化脓性链球菌（Streptococcuspyogenes）和猪链球菌（Streptococcussuis）。霍乱弧菌（Vibriocholerae）是属于弧菌属的细菌的实例。大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）是属于埃希氏菌属的细菌的实例。羊种布鲁氏菌（BrucellaMelitensis）是属于布鲁氏菌属的细菌的实例。伯氏疏螺旋体（BorreliaBurgdorferi）是属于疏螺旋体属的细菌的实例。耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis）是属于分枝杆菌属的细菌的实例。空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是属于弯曲杆菌属的细菌的实例。细长嗜热聚球藻（ThermosynechococcusElongatus）是属于嗜热聚球藻属的细菌的实例。耐辐射异常球菌(DeinococcusRadiodurans)是属于异常球菌属的细菌的实例。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是属于棒状杆菌属的细菌的实例。在本发明中，可使用以上微生物的铁蛋白单体作为微生物铁蛋白单体。[0067] 优选地，微生物铁蛋白单体可以是无害李斯特菌（Listeriainnocua）铁蛋白(Dps)单体。无害李斯特菌（Listeriainnocua）铁蛋白(Dps)单体可以如下所示：[0068] (A3)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的蛋白质；[0069] (B3)包含氨基酸序列且具有多聚体(例如12聚体)形成能力的蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQIDNO:6的氨基酸序列中包含选自氨基酸残基的取代、缺失、插入和添加中的一个或数个氨基酸残基的修饰的氨基酸序列；或者[0070] (C3)包含与SEQIDNO:6的氨基酸序列具有90%或更高的同源性的氨基酸序列且具有多聚体(例如12聚体)形成能力的蛋白质。[0071] 在蛋白质(B1)至(B3)中，可通过选自氨基酸残基的缺失、取代、添加和插入中的一种、两种、三种或四种的修饰来改变一个或数个氨基酸残基。氨基酸残基的修饰可被引入至氨基酸序列中的一个区域中、或者可被引入至多个不同的区域中。术语“一个或数个”表示所选择的不损害蛋白质活性的数目。由术语“一个或数个”表示的数目例如为1至50个，优选1至40个，更优选1至30个，进一步更优选1至20个，且特别优选1至10个或1至5个(例如1个、2个、3个、4个或5个)。[0072] 在蛋白质(C1)至(C3)中，与对象氨基酸序列的同源性的程度优选为92%或更高，更优选为95%或更高，进一步更优选为97%或更高，且最优选为98%或更高、或者99%或更高。可通过采用以下算法来确定氨基酸序列的同源性(即，同一性或相似性)：例如由Karlin和Altschul开发的BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.，USA，90,5873(1993))和由Pearson开发的FASTA(MethodsEnzymol.,183,63(1990))。由于已基于算法BLAST开发了被称为BLASTP或BLASTN的程序(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，因此可以将这些程序以默认设置使用来计算同源性。作为同源性，例如可使用如下获得的数值：使用采用Lipman‑Pearson法的由GENETYX公司开发的GENETYXVer7.0.9软件，采用ORF中编码的多肽部分全长，以UnitSizetoCompare=2的设置来执行相似性的百分比计算时所得的数值。或者，同源性可以是在NEEDLE程序(JMolBiol1970；48:443‑453)检索中使用默认设置的参数(空位惩罚(Gappenalty)=10，延伸惩罚(Extendpenalty)=0.5，矩阵(Matrix)=EBLOSUM62)而获得的值(同一性)。在通过这些计算得到的同源性%的值之中可以采用最低值。优选使用同一性%作为同源性%。[0073] 在氨基酸序列中应该引入突变的氨基酸残基的位置，对于本领域技术人员来说是显而易见的，但是可以进一步参考序列比对来确定。具体地，本领域技术人员可以(1)比较多个氨基酸序列，(2)揭示相对保守的区域和相对不保守的区域，然后(3)从相对保守的区域和相对不保守的区域分别预测能够对功能发挥重要作用的区域和不能对功能发挥重要作用的区域，用以识别结构和功能之间的相关性。由此，本领域技术人员可通过利用序列比对来确定氨基酸序列中应该引入突变的位置，以及通过并用已知的二级结构信息和三级结构信息来确定在氨基酸序列中应该引入突变的氨基酸残基的位置。[0074] 在通过取代使氨基酸残基突变的情况下，氨基酸残基的取代可以是保守取代。本说明书中使用的术语“保守取代”指将所定的氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在相关领域中是已知的。例如，此类家族的实例包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、具有β位分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)、具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)、具有含羟基(例如醇羟基和酚羟基)侧链的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)、以及具有含硫侧链的氨基酸(例如半胱氨酸和蛋氨酸)。优选地，氨基酸的保守取代可以是：天冬氨酸和谷氨酸之间的取代；精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的取代；色氨酸和苯丙氨酸之间的取代；苯丙氨酸和缬氨酸之间的取代；亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸之间的取代；以及甘氨酸和丙氨酸之间的取代。[0075] 已知高等生物的铁蛋白单体具有在各种高等生物间高度保守的6个α‑螺旋，以及存在着H链和L链这两种单体作为高等生物的铁蛋白单体。另一方面，已知微生物的铁蛋白单体(Dps单体)具有在各种微生物间高度保守的5个α‑螺旋，以及存在着一种单体作为微生物的铁蛋白单体。高等生物和微生物的铁蛋白单体具有在A区域、B区域、C区域和D区域中高度保守的α‑螺旋。在高等生物的铁蛋白单体中，识别到在微生物的铁蛋白单体中存在的B区域和C区域之间的边界中的α‑螺旋的缺失。另一方面，在微生物的铁蛋白单体中，识别到在高等生物的铁蛋白单体中存在的E区域中的α‑螺旋的缺失。针对作为高等生物的铁蛋白单体的实例列出的人铁蛋白单体和作为微生物的铁蛋白单体的实例列出的无害李斯特菌（Listeriainnocua）铁蛋白单体，α‑螺旋的位置总结在下表1中。[0076] [表1][0077][0078] (a)括号中的编号(第X个)表示从N末端起数存在于第X个位置处的第X个的α‑螺旋；[0079] (b)A E区域和第1 6个的分类根据IntJMolSci.2011;12(8):5406‑5421来定~ ~义。[0080] 与包含“在各种生物的铁蛋白单体中高度保守的D区域和/或随后的区域[例如现有技术中报道的D区域和E区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区(例如从铁蛋白单体的N末端起数第五个和第六个α‑螺旋之间的区域)]中插入了功能肽的融合蛋白”的多聚体相比，包含“在各种生物的铁蛋白单体中高度保守的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区(从诸如人之类的高等生物中的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的区域；以及从微生物中的铁蛋白(Dps)单体的N末端起数第二个和第四个α‑螺旋之间的区域)中插入了功能肽的融合蛋白”的多聚体可以实现与靶标的更强烈的相互作用。[0081] 铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋，在相关领域中是众所周知的，并且本领域技术人员可以适当地确定来源于各种生物的铁蛋白单体中B区域和C区域中的α‑螺旋的位置。因此，在本发明中，其中插入功能肽的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区在相关领域中也是众所周知的，并且可以由本领域技术人员适当地确定。例如，作为在诸如人铁蛋白H链(SEQIDNO:2)之类的高等生物铁蛋白H链中功能肽的此类插入位置，可以利用包括第78至96位(优选第83至91位)的氨基酸残基的区域中的任意位置。此外，作为在诸如人铁蛋白L链(SEQIDNO:4)之类的高等生物铁蛋白L链中功能肽的此类插入位置，可以利用包括第74至92位(优选第79至87位)的氨基酸残基的区域中的任意位置。进而，作为在诸如无害李斯特菌Dps(SEQIDNO:6)之类的微生物铁蛋白单体Dps中功能肽的此类插入位置，可以利用包括第67至94位(优选第82至94位)的氨基酸残基的区域中的任意位置。在实施例中构建的各种融合蛋白中，在如下表2中所列出的所定的铁蛋白单体的所需的部位插入了各种功能肽(例如钛识别肽、癌症识别肽和金识别肽)。[0082] [表2][0083][0084] 人铁蛋白H链：SEQIDNO:2[0085] 人铁蛋白L链：SEQIDNO:4[0086] 无害李斯特菌（Listeriainnocua）铁蛋白单体Dps：SEQIDNO:6。[0087] 作为功能肽，可以使用在与目标蛋白融合时能够对目标蛋白附加任意的功能的肽。此类肽的实例包括：具有与靶材料结合的能力的肽、蛋白酶降解性肽、细胞透过性肽和稳定化肽。本发明揭示了，与包含“在铁蛋白的第五个和第六个α‑螺旋之间的区域中插入了相同的肽的融合蛋白”的多聚体相比，包含“在铁蛋白的第二个和第三个α‑螺旋之间的区域中插入了具有与靶材料结合的能力的肽的融合蛋白”的多聚体可以实现与靶材料的优异结合能力。这表明，“在第二个和第三个α‑螺旋之间的区域中插入的肽”与“在第五个和第六个α‑螺旋之间的区域中插入的肽”相比可更强烈地与靶标相互作用。因此，作为功能肽，不仅在使用具有与靶材料结合的能力的肽的情况下，而且在使用其他肽(例如蛋白酶降解性肽)的情况下，均认为能够与靶标(例如蛋白酶)强烈地相互作用，因此，在使用此种其他肽作为功能肽的情况下，本发明也是有用的。[0088] 待在上述区域中插入的功能肽，可以是具有所需功能的仅1个肽，或者可以是具有所需功能的相同类型或不同类型的多个(例如2个、3个或4个等的数个)肽。在功能肽是如上述的多个肽的情况下，多个功能肽可按任意顺序插入并与铁蛋白单体融合。可以经由酰胺键来实现融合。对于融合而言，可以通过酰胺键直接实现，或者通过由1个氨基酸残基(例如蛋氨酸)或包含数个(例如2至20个，优选2至10个，更优选2个、3个、4个或5个)氨基酸残基的肽(肽接头)介导的酰胺键间接实现。由于已知各种肽接头，因此在本发明中亦可使用此类肽接头。优选地，在上述区域中插入的肽的总长度为20个氨基酸残基或更少。[0089] 在使用具有与靶材料结合的能力的肽作为功能肽的情况下，靶材料的实例包括有机物和无机物(例如导体、半导体和磁性物质)。更具体地，此类靶材料的实例包括生物有机分子、金属材料、硅材料、碳材料、能够与用于蛋白质纯化的标记(例如组氨酸标记、麦芽糖结合蛋白质标记、谷胱甘肽‑S‑转移酶)相互作用的材料(例如镍、麦芽糖和谷胱甘肽)、标记物质(例如放射性物质、荧光物质和色素)、聚合物(例如疏水性有机聚合物或导电性聚合物，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚环氧乙烷和聚(L‑乳酸))。[0090] 生物有机分子的实例包括蛋白质(例如寡肽或多肽)、核酸(例如DNA、RNA、核苷、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸)、糖类(例如单糖、寡糖或多糖)和脂质。生物有机分子也可以是细胞表面抗原(例如癌抗原、心脏病标志物、糖尿病标志物、神经系统疾病标志物、免疫性疾病标志物、炎症标志物、激素、传染病标志物)。生物有机分子还可以是疾病抗原(例如癌抗原、心脏病标志物、糖尿病标志物、神经系统疾病标志物、免疫性疾病标志物、炎症标志物、激素、传染病标志物)。已经报道了各种肽作为具有与此类生物有机分子结合的能力的肽。已报道数种肽如下：例如，具有与蛋白质结合的能力的肽(参见例如F.Danhier等，Mol.Pharmaceutics，2012，第9卷，第11期，第2961页；C‑H.Wu等，Sci.Transl.Med.，2015，第7卷，第290期，290ra91；L.Vannucci等，Int.J.Nanomedicine，2012，第7卷，第1489页；J.Cutrera等，Mol.Ther.，2011，第19(8)卷，第1468页；R.Liu等，Adv.DrugDeliv.Rev.，2017，第110‑111卷，第13页)；具有与核酸结合的能力的肽(参见例如R.Tan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1995，第92卷，第5282页；R.Tan等，Cell，1993，第73卷，第1031页；R.Talanian等，Biochemistry，1992，第31卷，第6871页)；具有与糖类结合的能力的肽(参见例如K.Oldenburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1992，第89卷，第12期，第5393‑5397页；K.Yamamoto等，J.Biochem.,1992，第111卷，第436页；A.Baimiev等，Mol.Biol.(莫斯科)，2005，第39卷，第1期，第90页)；和具有与脂质结合的能力的肽(参见例如O.Kruse等，BZ.Naturforsch.，1995，第50c卷，第380页；O.Silva等，Sci.Rep.，2016，第6卷，27128；A.Filoteo等，J.Biol.Chem.，1992，第267卷，第17期，第11800页)。[0091] 优选地，具有与生物有机分子结合的能力的肽，可以是具有与蛋白质结合的能力的肽。具有与蛋白质结合的能力的肽的实例包括：Danhier等，Mol.Pharmaceutics，2012，第9卷，第11期，第2961页中公开的含有RGD的肽及其修饰序列(例如RGD(SEQIDNO:37)、ACDCRGDCFCG(SEQIDNO:38)、CDCRGDCFC(SEQIDNO:39)、GRGDS(SEQIDNO:40)、ASDRGDFSG(SEQIDNO:16))、以及其它的整联蛋白识别序列(例如EILDV(SEQIDNO:41)和REDV(SEQIDNO:42))；L.Vannucci等，Int.J.Nanomedicine.2012，第7卷，第1489页中公开的肽(例如SYSMEHFRWGKP(SEQIDNO:43))；J.Cutrera等，Mol.Ther.，2011，第19卷，第8期，第1468页中公开的肽(例如VNTANST(SEQIDNO:44))；R.Liu等，Adv.DrugDeliv.Rev.，2017，第110‑111卷，第13页中公开的肽(例如DHLASLWWGTEL(SEQIDNO:45)、以及NYSKPTDRQYHF(SEQIDNO:46)、IPLPPPSRPFFK(SEQIDNO:47)、LMNPNNHPRTPR(SEQIDNO:48)、CHHNLTHAC(SEQIDNO:49)、CLHHYHGSC(SEQIDNO:50)、CHHALTHAC(SEQIDNO:51)、SPRPRHTLRLSL(SEQIDNO:52)、TMGFTAPRFPHY(SEQIDNO:53)、NGYEIEWYSWVTHGMY(SEQIDNO:54)、FRSFESCLAKSH(SEQIDNO:55)、YHWYGYTPQNVI(SEQIDNO:56)、QHYNIVNTQSRV(SEQIDNO:57)、QRHKPRE(SEQIDNO:58)、HSQAAVP(SEQIDNO:59)、AGNWTPI(SEQIDNO:60)、PLLQATL(SEQIDNO:61)、LSLITRL(SEQIDNO:62)、CRGDCL(SEQIDNO:63)、CRRETAWAC(SEQIDNO:64)、RTDLDSLRTYTL(SEQIDNO:65)、CTTHWGFTLC(SEQIDNO:66)、APSPMIW(SEQIDNO:67)、LQNAPRS(SEQIDNO:68)、SWTLYTPSGQSK(SEQIDNO:69)、SWELYYPLRANL(SEQIDNO:70)、WQPDTAHHWATL(SEQIDNO:71)、CSDSWHYWC(SEQIDNO:72)、WHWLPNLRHYAS(SEQIDNO:73)、WHTEILKSYPHE(SEQIDNO:74)、LPAFFVTNQTQD(SEQIDNO:75)、YNTNHVPLSPKY(SEQIDNO:76)、YSAYPDSVPMMS(SEQIDNO:77)、TNYLFSPNGPIA(SEQIDNO:78)、CLSYYPSYC(SEQIDNO:79)、CVGVLPSQDAIGIC(SEQIDNO:80)、CEWKFDPGLGQARC(SEQIDNO:81)、CDYMTDGRAASKIC(SEQIDNO:82)、KCCYSL(SEQIDNO:83)、MARSGL(SEQIDNO:84)、MARAKE(SEQIDNO:85)、MSRTMS(SEQIDNO:86)、WTGWCLNPEESTWGFCTGSF(SEQIDNO:87)、MCGVCLSAQRWT(SEQID NO:88)、SGLWWLGVDILG(SEQ ID NO: 89)、NPGTCKDKWIECLLNG(SEQ ID NO: 90)、ANTPCGPYTHDCPVKR(SEQ ID NO: 91)、IVWHRWYAWSPASRI(SEQIDNO:92)、CGLIIQKNEC(SEQIDNO:93)、MQLPLAT(SEQIDNO:94)、CRALLRGAPFHLAEC(SEQIDNO:95)、IELLQAR(SEQIDNO:96)、TLTYTWS(SEQIDNO:97)、CVAYCIEHHCWTC(SEQIDNO:98)、THENWPA(SEQIDNO:99)、WHPWSYLWTQQA(SEQIDNO:100)、VLWLKNR(SEQIDNO:101)、CTVRTSADC(SEQIDNO:102)、AAAPLAQPHMWA(SEQIDNO:103)、SHSLLSS(SEQIDNO:104)、ALWPPNLHAWVP(SEQIDNO:105)、LTVSPWY(SEQIDNO:106)、SSMDIVLRAPLM(SEQIDNO:107)、FPMFNHWEQWPP(SEQIDNO:108)、SYPIPDT(SEQIDNO:109)、HTSDQTN(SEQIDNO:110)、CLFMRLAWC(SEQIDNO:111)、DMPGTVLP(SEQIDNO:112)、DWRGDSMDS(SEQIDNO:113)、VPTDTDYS(SEQIDNO:114)、VEEGGYIAA(SEQIDNO:115)、VTWTPQAWFQWV(SEQIDNO:116)、AQYLNPS(SEQIDNO:117)、CSSRTMHHC(SEQIDNO:118)、CPLDIDFYC(SEQIDNO:119)、CPIEDRPMC(SEQIDNO:120)、RGDLATLRQLAQEDGVVG(SEQIDNO:121)、SPRGDLAVLGHK(SEQIDNO:122)、SPRGDLAVLGHKY(SEQIDNO:123)、CQQSNRGDRKRC(SEQIDNO:124)、CMGNKCRSAKRP(SEQIDNO:125)、CGEMGWVRC (SEQIDNO:126)、GFRFGALHEYNS(SEQIDNO:127)、CTLPHLKMC(SEQIDNO:128)、ASGALSPSRLDT(SEQIDNO:129)、SWDIAWPPLKVP(SEQIDNO:130)、CTVALPGGYVRVC(SEQIDNO:131)、ETAPLSTMLSPY(SEQIDNO:132)、GIRLRG(SEQIDNO:133)、CPGPEGAGC(SEQIDNO:134)、CGRRAGGSC(SEQIDNO:135)、CRGRRST(SEQIDNO:136)、CNGRCVSGCAGRC(SEQIDNO:137)、CGNKRTRGC(SEQIDNO:138)、HVGGSSV(SEQIDNO:139)、RGDGSSV(SEQIDNO:140)、SWKLPPS(SEQIDNO:141)、CRGDKRGPDC(SEQIDNO:142)、GGKRPAR(SEQIDNO:143)、RIGRPLR(SEQIDNO:144)、CGFYWLRSC(SEQIDNO:145)、RPARPAR(SEQIDNO:146)、TLTYTWS(SEQIDNO:147)、SSQPFWS(SEQIDNO:148)、YRCTLNSPFFWEDMTHEC(SEQIDNO:149)、KTLLPTP(SEQIDNO:150)、KELCELDSLLRI(SEQIDNO:151)、IRELYSYDDDFG(SEQIDNO:152)、NVVRQ(SEQIDNO:153)、VECYLIRDNLCIY(SEQIDNO:154)、CGGRRLGGC(SEQIDNO:155)、WFCSWYGGDTCVQ(SEQIDNO:156)、NQQLIEEIIQILHKIFEIL(SEQIDNO:157)、KMVIYWKAG(SEQIDNO:158)、LNIVSVNGRH(SEQIDNO:159)、QMARIPKRLARH(SEQIDNO:160)和QDGRMGF(SEQIDNO:161))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0092] 优选地，具有与生物有机分子结合的能力的肽，可以是具有与核酸结合的能力的肽。具有与核酸结合的能力的肽的实例包括：R.Tan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，第92卷，第5282页中公开的肽(例如TRQARRN(SEQIDNO:162)、TRQARRNRRRRWRERQR(SEQIDNO:163)、TRRQRTRRARRNR(SEQIDNO:164)、NAKTRRHERRRKLAIER(SEQIDNO:165)、MDAQTRRRERRAEKQAQWKAA(SEQIDNO:166)和RKKRRQRRR(SEQIDNO:167))；R.Tan等，Cell，1993，第73卷，第1031页中公开的肽(例如TRQARRNRRRRWRERQR(SEQIDNO:168))；Talanian等，Biochemistry，1992，第31卷，第6871页中公开的肽(例如KRARNTEAARRSRARK(SEQIDNO:169))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0093] 优选地，具有与生物有机分子结合的能力的肽，可以是具有与糖类结合的能力的肽。具有与糖类结合的能力的肽的实例包括：K.Oldenburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，第89卷，第12期，第5393‑5397页中公开的肽(例如DVFYPYPYASGS(SEQIDNO:170)和RVWYPYGSYLTASGS(SEQIDNO:171))；K.Yamamoto等，J.Biochem.，1992，第111卷，第436页中公开的肽(例如DTWPNTEWS(SEQIDNO:172)、DSYHNIW(SEQIDNO:173)、DTYFGKAYNPW(SEQIDNO:174)和DTIGSPVNFW(SEQIDNO:175))；A.Baimiev等，Mol.Biol.(莫斯科)，2005，第39卷，第1期，第90页中公开的肽(例如TYCNPGWDPRDR(SEQIDNO:176)和TFYNEEWDLVIKDEH(SEQIDNO:177))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0094] 优选地，具有与生物有机分子结合的能力的肽，可以是具有与脂质结合的能力的肽。具有与脂质结合的能力的肽的实例包括：O.Kruse等，Z.Naturforsch.，1995，第50c卷，第380页中公开的肽(例如MTLILELVVI(SEQIDNO:178)、MTSILEREQR(SEQIDNO:179)和MTTILQQRES(SEQIDNO:180))；O.Silva等，Sci.Rep.，2016，第6卷，27128中公开的肽(例如VFQFLGKIIHHVGNFVHGFSHVF(SEQIDNO:181))；A.Filoteo等，J.Biol.Chem.，1992，第267(17)卷，第11800页中公开的肽(例如KKAVKVPKKEKSVLQGKLTRLAVQI(SEQIDNO:182))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0095] 金属材料的实例包括金属和金属化合物。金属的实例包括钛、金、铬、锌、铅、锰、钙、铜、钙、锗、铝、镓、镉、铁、钴、银、铂、钯、铪和碲。金属化合物的实例包括此类金属的氧化物、硫化物、碳酸盐、砷化物、氯化物、氟化物、碘化物和金属间化合物。作为具有与此类金属材料结合的能力的肽，已报道了各种肽(例如WO2005/010031；WO2012/086647；K.Sano等，Langmuir，2004，第21卷，第3090页；S.Brown,Nat.Biotechnol.，1997，第15卷，第269页；K.Kjaergaard等，Appl.Environ.Microbiol.，2000，第66卷，第10页；Umetsu等，Adv.Mater.,17，2571‑2575(2005)；M.B.Dickerson等，Chem.Commun.，2004，第15卷，第1776页；C.E.Flynn等，J.Mater.Chem.，2003，第13卷，第2414页)。因此，在本发明中，可以使用此类各种肽。还已知具有与金属结合的能力的肽可具有金属的矿化(mineralization)作用，而具有与金属化合物结合的能力的肽可具有金属化合物的矿化作用(例如K.Sano等，Langmuir，2004，第21卷，第3090页；M.Umetsu等，Adv.Mater.，2005，第17卷，第2571页)。因此，在使用具有与金属材料结合的能力的肽作为具有与靶材料结合的能力的肽的情况下，具有与金属材料结合的能力的肽具有此类矿化作用。[0096] 优选地，具有与金属材料结合的能力的肽，可以是具有与诸如钛或钛化合物(例如氧化钛)之类的钛材料结合的能力的肽，以及具有与诸如金或金化合物之类的金材料结合的能力的肽。具有与钛材料结合的能力的肽的实例包括：在后述的实施例中描述以及在WO2006/126595中公开的肽(例如RKLPDA(SEQIDNO:7))；M.J.Pender等，NanoLett.，2006，第6卷，第1期，第40‑44页中公开的肽(例如SSKKSGSYSGSKGSKRRIL(SEQIDNO:183))；I.Inoue等，J.Biosci.Bioeng.，2006，第122卷，第5期，第528页中公开的肽(例如AYPQKFNNNFMS(SEQIDNO:184))；WO2006/126595中公开的肽(例如RKLPDAPGMHTW(SEQIDNO:185)和RALPDA(SEQIDNO:186))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。具有与金材料结合的能力的肽的实例包括：在后述的实施例中描述以及在S.Brown,Nat.Biotechnol.1997，第15卷，第269页中公开的肽(例如MHGKTQATSGTIQS(SEQIDNO:21))；J.Kim等，ActaBiomater.，2010，第6卷，第7期，第2681页中公开的肽(例如TGTSVLIATPYV(SEQIDNO:187)和TGTSVLIATPGV(SEQIDNO:188))；K.Nam等，Science，2006，第312卷，第5775期，第885页中公开的肽(例如LKAHLPPSRLPS(SEQIDNO:189))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0097] 硅材料的实例包括硅或硅化合物。硅化合物的实例包括：硅的氧化物(例如一氧化硅(SiO)、二氧化硅(SiO2))、碳化硅(SiC)、硅烷(SiH4)和硅酮橡胶。作为具有与此类硅材料结合的能力的肽，已报道了各种肽(例如WO2006/126595；WO2006/126595；M.J.Pender等，NanoLett.，2006，第6卷，第1期，第40‑44页)。因此，在本发明中，可以使用此类各种肽。[0098] 优选地，具有与硅材料结合的能力的肽，可以是具有与硅或硅化合物(例如硅的氧化物)结合的能力的肽。此类肽的实例包括：WO2006/126595中公开的肽(例如RKLPDA(SEQIDNO:7))；M.J.Pender等，NanoLett.，2006，第6卷，第1期，第40‑44页中公开的肽(例如SSKKSGSYSGSKGSKRRIL (SEQIDNO:190))；WO2006/126595中公开的肽(例如MSPHPHPRHHHT(SEQIDNO:191)、TGRRRRLSCRLL(SEQIDNO:192)和KPSHHHHHTGAN(SEQIDNO:193))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0099] 碳材料的实例包括碳纳米材料(例如碳纳米管(CNT)、碳纳米角(CNH))、富勒烯(C60)、石墨烯片和石墨。作为具有与此类碳材料结合的能力的肽，已报道了各种肽(例如日本专利申请特开第2004‑121154号；日本专利申请特开第2004‑121154号；和M.J.Pender等，NanoLett.，2006，第6卷，第1期，第40‑44页)。因此，在本发明中，可以使用此类各种肽。[0100] 优选地，具有与碳材料结合的能力的肽，可以是具有与诸如碳纳米管(CNT)或碳纳米角(CNH))之类的碳纳米材料结合的能力的肽。此类肽的实例包括：在后述的实施例中描述以及在日本专利申请特开第2004‑121154号中公开的肽(例如DYFSSPYYEQLF(SEQIDNO:194))；M.J.Pender等，NanoLett.，2006，第6卷，第1期，第40‑44页中公开的肽(例如HSSYWYAFNNKT(SEQIDNO:195))；日本专利申请特开第2004‑121154号中公开的肽(例如YDPFHII(SEQIDNO:196))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0101] 在使用蛋白酶降解性肽作为功能肽的情况下，蛋白酶的实例包括：半胱氨酸蛋白酶，例如胱天蛋白酶(caspase)和组织蛋白酶(D.McIlwain1等，ColdSpringHarbPerspectBiol.，2013，第5卷，a008656；V.Stoka等，IUBMBLife，2005，第57卷，第4‑5期，第347页)、胶原酶(G.Lee等，EurJPharmBiopharm.，2007，第67卷，第3期，第646页)、凝血酶和Xa因子(R.Jenny等，ProteinExpr.Purif.,2003，第31卷，第1页；H.Xu等，J.Virol.,2010，第84卷，第2期，第1076页)和病毒来源的蛋白酶(C.Byrd等，DrugDev.Res.，2006，第67卷，第501页)。[0102] 蛋白酶降解性肽的实例包括：E.Lee等，Adv.Funct.Mater.，2015，第25卷，第1279页中公开的肽(例如GRRGKGG(SEQIDNO:197))；G.Lee等，EurJPharmBiopharm.，2007，第67卷，第3期，第646页中公开的肽(例如GPLGV(SEQIDNO:198)和GPLGVRG(SEQIDNO:199))；Y.Kang等，Biomacromolecules,2012，第13卷，第12期，第4057页中公开的肽(例如GGLVPRGSGAS(SEQIDNO:200))；R.Talanian等，J.Biol.Chem.,1997，第272期，第9677页中公开的肽(例如YEVDGW(SEQIDNO:201)、LEVDGW(SEQIDNO:202)、VDQMDGW(SEQIDNO:203)、VDVADGW(SEQIDNO:204)、VQVDGW(SEQIDNO:205)和VDQVDGW(SEQIDNO:206))；Jenny等，ProteinExpr.Purif.，2003，第31卷，第1页中公开的肽(例如ELSLSRLRDSA(SEQIDNO:207)、ELSLSRLR(SEQIDNO:208)、DNYTRLRK(SEQIDNO:209)、YTRLRKQM(SEQIDNO:210)、APSGRVSM(SEQIDNO:211)、VSMIKNLQ(SEQIDNO:212)、RIRPKLKW(SEQIDNO:213)、NFFWKTFT(SEQIDNO:214)、KMYPRGNH(SEQIDNO:215)、QTYPRTNT(SEQIDNO:216)、GVYARVTA(SEQIDNO:217)、SGLSRIVN(SEQIDNO:218)、NSRVA(SEQIDNO:219)、QVRLG(SEQIDNO:220)、MKSRNL(SEQIDNO:221)、RCKPVN(SEQIDNO:222)和SSKYPN(SEQIDNO:223))；H.Xu等，J.Virol.,2010，第84卷，第2期，第1076页中公开的肽(例如LVPRGS(SEQIDNO:224))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0103] 在使用稳定化肽作为功能肽的情况下，稳定化肽的实例包括：X.Meng等，Nanoscale,2011，第3卷，第3期，第977页中公开的肽(例如CCALNN(SEQIDNO:225))；E.Falvo等，Biomacromolecules，2016，第17卷，第2期，第514页中公开的肽(例如PAS(SEQIDNO:226))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0104] 在使用细胞透过性肽作为功能肽的情况下，细胞透过性肽的实例包括：Z.Guo等，Biomed.Rep.,2016，第4卷，第5期，第528页中公开的肽(例如GRKKRRQRRRPPQ(SEQIDNO:227)、RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQIDNO:228)、CGYGPKKKRKVGG(SEQIDNO:229)、RRRRRRRR(SEQIDNO:230)、KKKKKKKK(SEQIDNO:231)、GLAFLGFLGAAGSTM(SEQIDNO:232)、GAWSQPKKKRKV(SEQIDNO:233)、LLIILRRRIRKQAHAHSK(SEQIDNO:234)、MVRRFLVTL(SEQIDNO:235)、RIRRACGPPRVRV(SEQIDNO:236)、MVKSKIGSWILVLFV(SEQIDNO:237)、SDVGLCKKRP(SEQIDNO:238)、NAATATRGRSAASRPTQR(SEQIDNO:239)、PRAPARSASRPRRPVQ (SEQIDNO:240)、DPKGDPKGVTVT(SEQIDNO:241)、VTVTVTGKGDPKPD(SEQIDNO:242)、KLALKLALK(SEQIDNO:243)、ALKAALKLA(SEQIDNO:244)、GWTLNSAGYLLG(SEQIDNO:245)、KINLKALAALAKKIL(SEQIDNO:246)、RLSGMNEVLSFRW(SEQIDNO:247)、SDLWEMMMVSLACQY(SEQIDNO:248)和PIEVCMYREP(SEQIDNO:249))；以及它们的突变肽(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基的保守取代等突变)；以及具有一个或更多个此类氨基酸序列的肽。[0105] 功能肽优选为具有与靶材料结合的能力的肽。具有与靶材料结合的能力的肽的优选实例是具有与有机物结合的能力的肽。具有与有机物结合的能力的肽优选为具有与生物有机分子结合的能力的肽，且更优选为具有与蛋白质结合的能力的肽。具有与靶材料结合的能力的肽的另一优选实例是具有与无机物结合的能力的肽。具有与无机物结合的能力的肽优选为具有与金属材料结合的能力的肽，且更优选为具有与钛材料或金材料结合的能力的肽。[0106] 对于本发明的融合蛋白而言，可在其N末端区域和/或C末端区域中进行修饰。动物铁蛋白单体（例如人铁蛋白单体）的N末端可在多聚体的表面上露出，而其C末端不能在该表面上露出。因此，添加到动物铁蛋白单体的N末端的肽部分在多聚体的表面上露出，用以与存在于该多聚体外部的靶材料相互作用，但是添加到动物铁蛋白单体的C末端的肽部分未在该多聚体的表面上露出，因此不能与存在于该多聚体外部的靶材料相互作用(例如WO2006/126595)。然而，已报道了，对于动物铁蛋白单体的C末端，可通过修饰(改变)其氨基酸残基，从而可在将药剂包封入多聚体的内腔中时利用(参见例如Y.J.Kang，Biomacromolecules.2012，第13(12)卷，4057)。另一方面，对于微生物铁蛋白单体(即Dps)而言，其N末端和C末端这两者均可在多聚体的表面上露出。因此，添加到微生物铁蛋白单体的N末端和C末端这两者的肽部分均可在多聚体的表面上露出，用以与存在于多聚体外部的不同靶材料相互作用(例如WO2012/086647)。[0107] 在优选的实施方式中，对于本发明的融合蛋白而言，作为其N末端区域中的修饰，可以在N末端添加肽部分。待添加的肽部分的实例是以上所描述的功能肽。待添加的肽部分的其它实例包括：用于提高目标蛋白的溶解性的肽成分(例如Nus‑标记)、作为分子伴侣起作用的肽成分(例如引发因子)、具有其它功能的肽成分(例如全长蛋白质或其一部分)和接头。作为待添加到融合蛋白的N末端的肽部分，可使用与待在第二个和第三个α‑螺旋之间的区域中插入的功能肽相同或不同的肽。从实现与不同的靶材料相互作用等的观点考虑，优选使用不同的肽。优选地，待添加到本发明的融合蛋白的N末端的肽部分是以上所描述的功能肽。优选对待添加到N末端的肽部分进行设计，以使N末端中包含对应于起始密码子的氨基酸残基(例如蛋氨酸残基)。此类设计促进了本发明的融合蛋白的翻译。[0108] 在另一优选的实施方式中，对于本发明的融合蛋白而言，作为其C末端区域中的修饰，可以进行如下修饰：用反应性氨基酸残基取代C末端区域中的氨基酸残基、在C末端区域中插入反应性氨基酸残基、或者将反应性氨基酸残基或含有反应性氨基酸残基的肽(例如含有2 12个、优选2 5个氨基酸残基的肽)添加到C末端。此类C末端区域的实例包括：包括人~ ~铁蛋白H链的第175 183个(优选第179 183个)氨基酸残基的区域、以及包括人铁蛋白L链的~ ~第171 175个(优选第173 175个)氨基酸残基的区域。通过此类修饰，可以使反应性氨基酸~ ~残基与所定物质(例如药物和靶物质)反应，并由此使得能够通过共价键将所定物质包封入多聚体的内腔中。此类反应性氨基酸残基的实例包括：具有硫醇基的半胱氨酸残基、具有氨基的赖氨酸残基、精氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基，并且优选半胱氨酸残基。优选地，本发明的融合蛋白的C末端区域的修饰是将反应性氨基酸残基或含有反应性氨基酸残基的肽添加到C末端。[0109] 本发明的融合蛋白可以通过下述方式获得：利用含有编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞(本发明的宿主细胞)，并在宿主细胞产生融合蛋白。用于产生本发明的融合蛋白的宿主细胞的实例包括来源于动物、昆虫、鱼类、植物或微生物的细胞。动物优选为哺乳动物或鸟类(例如鸡)，且更优选为哺乳动物。哺乳动物的实例包括灵长类(例如人、猴和黑猩猩)、啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和兔)、家畜和使役用的哺乳动物(例如牛、猪、绵羊、山羊和马)。[0110] 在优选的实施方式中，宿主细胞是人细胞或用于产生人蛋白质的细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、和人胎肾来源的HEK293细胞)。在作为融合蛋白使用人铁蛋白单体和功能肽的融合蛋白的情况下，从对人的临床应用的观点考虑，优选使用此类宿主细胞。[0111] 在另一优选的实施方式中，宿主细胞是微生物。从融合蛋白的大量生产等的观点考虑，可以使用此类宿主细胞。微生物的实例包括细菌和真菌。作为细菌，可以使用能用作宿主细胞的任何细菌。细菌的实例包括：属于芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌(例如枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）)、属于棒状杆菌属（Corynebacterium）的细菌(例如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum))、属于埃希氏菌属（Escherichia）的细菌(例如大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）)和属于泛菌属（Pantoea）的细菌(例如菠萝泛菌（Pantoeaananatis）)。作为真菌，可以使用能用作宿主细胞的任何真菌。真菌的实例包括：属于酵母属(Saccharomyces)的真菌(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、和属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的真菌(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))。或者，作为微生物，可以使用丝状真菌。丝状真菌的实例包括属于以下属的真菌：枝顶孢霉属（Acremonium）/篮状菌属（Talaromyces）、木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀菌属（Fusarium）、金孢属（Chrysosporium）、腐质霉属（Humicola）、裸胞壳属（Emericella）和肉座菌属（Hypocrea）。[0112] 本发明的宿主细胞，除了包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸以外，优选还包含表达单元，该表达单元含有与该多核苷酸可操作地连接的启动子。术语“表达单元(expressionunit)”指含有待作为蛋白质表达的所定多核苷酸及与该多核苷酸可操作地连接的启动子，并使得能够转录该多核苷酸且因此产生由该多核苷酸编码的蛋白质的单元。表达单元可进一步包含诸如终止子、核糖体结合位点及耐药基因之类的元件。表达单元可以是DNA或RNA，且优选为DNA。表达单元可以包括在微生物(宿主细胞)的基因组区域(例如作为天然基因座的天然基因组区域，其中固有地存在编码上述蛋白质的多核苷酸；或不是该天然基因座的非天然基因组区域)、或非基因组区域(例如细胞质)中。表达单元可以包括在基因组区域中的一个或更多个(例如1个、2个、3个、4个或5个)的不同位置处。非基因组区域中所包括的表达单元的具体形式的实例是质粒、病毒载体、噬菌体或人工染色体。[0113] 构成表达单元的启动子不受特别限制，只要它能在宿主细胞中表达由连接在其下游的多核苷酸编码的蛋白质即可。例如，启动子可以与宿主细胞同源或异源，但优选与宿主细胞异源。例如可以使用常规用于产生重组蛋白的构成或诱导型启动子。作为此类启动子，可以根据所使用的宿主细胞的种类(例如哺乳动物细胞（例如人细胞）或微生物)来适当选择哺乳动物来源的启动子、微生物来源的启动子、病毒来源的启动子等启动子。[0114] 可通过相关领域中已知的任何方法来制备本发明的宿主细胞。例如，可以通过使用表达载体的方法(例如感受态细胞方法、电穿孔方法、磷酸钙沉淀方法)或基因组修饰技术来制备本发明的宿主细胞。在表达载体是与宿主细胞的基因组DNA发生同源重组的整合型(integrative)载体的情况下，可以通过转化将表达单元整合到宿主细胞的基因组DNA中。另一方面，在表达载体是不与宿主细胞的基因组DNA发生同源重组的非整合型载体的情况下，表达单元不通过转化整合到宿主细胞的基因组DNA中，并且可以在宿主细胞内保持表达载体的状态独立于基因组DNA而存在。或者，根据基因组编辑技术(例如CRISPR/Cas系统、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN))，可将表达单元整合到宿主细胞的基因组DNA中，并且可以修饰宿主细胞固有具备的表达单元。[0115] 除了以上描述的最小单元之外，表达载体可进一步包括诸如在宿主细胞中起作用的终止子、核糖体结合位点和耐药基因之类的元件作为表达单元。耐药基因的实例包括针对以下药物的耐性基因：例如四环素、氨苄西林、卡那霉素、潮霉素和膦丝菌素(phosphinothricin)。表达载体还可包括使得能够与宿主细胞的基因组同源重组的区域，用于与宿主细胞的基因组DNA同源重组。例如，可以设计表达载体，以使其中所含的表达单元位于一对同源区域(例如与宿主细胞的基因组中的特定序列同源的同源臂、loxP和FRT)之间。待引入表达单元的宿主细胞的基因组区域(同源区域的靶标)不受特别限制，但可以是在宿主细胞中具有高表达水平的基因座。[0116] 表达载体可以是质粒、病毒载体、噬菌体或人工染色体。表达载体还可以是整合型载体或非整合型载体。整合型载体可以是其全体被整合到宿主细胞的基因组中的一类载体。或者，整合型载体可以是其一部分(例如表达单元)被整合到宿主细胞的基因组中的一类载体。表达载体可以是DNA载体或RNA载体(例如逆转录病毒)。可以根据所使用的宿主细胞的种类(例如哺乳动物细胞（例如人细胞）或微生物)适当选择此类表达载体。[0117] 用于培养宿主细胞的培养基是已知的，并且可以使用与宿主细胞的种类相对应的合适的培养基。可将所定组分(例如碳源、氮源或维生素)加入到此类培养基中。对于宿主细胞而言，通常在16 42℃、优选25 37℃下培养通常5 168小时、优选8 72小时。培养方法的实~ ~ ~ ~例包括分批培养方法、补料分批培养方法和连续培养方法。或者，可以使用诱导剂来诱导融合蛋白的表达。[0118] 可以通过盐析方法、沉淀方法(例如等电点沉淀方法和溶剂沉淀方法)、利用分子量差异的方法(例如透析、超滤和凝胶过滤)、利用特异亲和性的方法(例如亲和色谱和离子交换色谱)、利用疏水性差异的方法(例如疏水色谱和反相色谱)或它们的组合，从宿主细胞或含有宿主细胞的培养基中纯化或分离所产生的目标蛋白。在本发明的融合蛋白在宿主细胞内蓄积的情况下，可通过以下方式来获得本发明的融合蛋白：首先，破碎(例如超声处理和匀浆)或溶解(例如溶菌酶处理)宿主细胞，然后通过上述方法对所得的破碎产物和溶菌产物进行处理。[0119] 本发明还提供可用于制备本发明的融合蛋白的如以上所描述的编码本发明的融合蛋白的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体、以及宿主细胞。[0120] 本发明还提供多聚体。本发明的多聚体包含融合蛋白、并可具有内腔。构成本发明的多聚体的融合蛋白的详细情况如上所描述。本发明的多聚体可以通过表达本发明的融合蛋白而自主产生。构成本发明的多聚体的单体单元的数目，可以通过本发明的融合蛋白中所含的铁蛋白的来源来确定。例如，在铁蛋白来源于动物（例如人）的情况下，本发明的多聚体是24聚体。另一方面，在铁蛋白来源于微生物的情况下(例如Dps)，本发明的多聚体是12聚体。[0121] 本发明的多聚体可以是包含单一融合蛋白作为单体单元的同多聚体，或者可以是包含不同的多种(例如两种)融合蛋白的异多聚体(heteromultimer)。例如，在动物（例如人）中，已知大多数铁蛋白作为包含两种亚单位(H链和L链)的异多聚体存在。因此，可使用异多聚体作为本发明的多聚体。[0122] 包含不同的多种融合蛋白的多聚体，例如可以通过以下方式来获得：使用含有编码不同种类的融合蛋白的多个多核苷酸的宿主细胞，产生不同种类的融合蛋白。此类多聚体还可以通过以下方式来获得：使包含单一融合蛋白的第一单体和包含单一融合蛋白(不同于构成第一多聚体的融合蛋白)的第二单体共存于相同的介质(例如缓冲液)中，并将它们放置。例如可以通过使本发明的多聚体在低pH的缓冲液中放置来制备融合蛋白的单体(参见例如B.Zheng等，Nanotechnology，2010，第21卷，第445602页)。[0123] 从减轻构成本发明的多聚体的单体的制备(例如获得重组蛋白)负担等的观点考虑，本发明的多聚体优选是同多聚体。以上所描述的构成本发明的同多聚体的融合蛋白中的铁蛋白单体部分优选是动物铁蛋白单体，其为动物铁蛋白H链或动物铁蛋白L链；或微生物铁蛋白单体(Dps单体)。铁蛋白单体部分更优选是人铁蛋白单体，其为人铁蛋白H链或人铁蛋白L链；或无害李斯特菌铁蛋白单体(Dps单体)。铁蛋白单体部分进一步更优选是上述(A1) (C1)的任一种或上述(A2) (C2)的任一种、或者上述(A3) (C3)的任一种。构成本发~ ~ ~明的同多聚体的融合蛋白中的功能肽如以上所描述，并且优选为具有与靶材料结合的能力的肽。具有与靶材料结合的能力的肽的优选实例是具有与有机物结合的能力的肽。具有与有机物结合的能力的肽优选为具有与生物有机分子结合的能力的肽，且更优选为具有与蛋白质结合的能力的肽。具有与靶材料结合的能力的肽的另一优选实例是具有与无机物结合的能力的肽。具有与无机物结合的能力的肽优选为具有与金属材料结合的能力的肽，更优选为具有与钛材料或金材料结合的能力的肽。[0124] 构成本发明的多聚体的融合蛋白可在其N末端区域和/或C末端区域中被修饰。优选地，在构成本发明的多聚体的融合蛋白中，可将肽部分添加到N末端作为如上所描述的N末端区域中的修饰。待添加的肽部分的实例如以上所描述。在构成本发明的多聚体的融合蛋白中，可通过以下方式进行如以上所描述的C末端区域中的修饰：用如以上所描述的反应性氨基酸残基取代C末端区域中的氨基酸残基、在C末端区域中插入反应性氨基酸残基、或将反应性氨基酸残基或含有反应性氨基酸残基的肽(与以上所描述的相同)添加至C末端。优选地，构成本发明的多聚体的融合蛋白的C末端区域的修饰是将反应性氨基酸残基或含有反应性氨基酸残基的肽添加至C末端。[0125] 本发明的多聚体可通过共价键或非共价键在内腔中含有物质。例如，可使用反应性氨基酸残基，通过如以上所描述那样修饰本发明的融合蛋白的C末端区域来进行通过共价键将物质包封入本发明的多聚体的内腔中。可通过利用铁蛋白能够并入物质(例如纳米颗粒)的特性来进行通过非共价键将物质包封入本发明的多聚体的内腔中。本领域技术人员可通过考虑以下性质来适当选择可被包封在本发明的多聚体中的物质：例如，本发明的多聚体的内腔的尺寸、以及可涉及(参与)本发明的多聚体中物质的并入的区域(例如C末端的区域：参见R.M.Kramer等，2004，J.Am.Chem.Soc.，第126卷，第13282页)中的氨基酸残基的电荷特性。例如，人铁蛋白形成笼状结构，其具有外径为12nm(内径为7nm)的内腔。微生物铁蛋白(Dps)形成笼状结构，其具有外径为9nm(内径为4.5nm)的内腔。因此，此类多聚体中可包封的物质的尺寸，可以是能够被包封入此类内腔中的尺寸。据报道，通过改变可涉及多聚体中物质的并入的区域中的电荷特性(例如具有能够获得正电荷或负电荷的侧链的氨基酸残基的种类和数目)，可更加促进将物质并入多聚体的内腔中(参见例如R.M.Kramer等，2004,J.Am.Chem.Soc.，第126卷，第13282页)，因此本发明中亦可使用具有电荷特性变化的区域的融合蛋白的多聚体。可通过非共价键包封在本发明的多聚体中的物质的实例是与以上所描述的靶材料相同的无机材料。可通过非共价键包封在本发明的多聚体中的物质的具体实例包括氧化铁、镍、钴、锰、磷、铀、铍、铝、硫化镉、硒化镉、钯、铬、铜、银、钆配合物、铂钴、氧化硅、氧化钴、氧化铟、铂、金、硫化金、硒化锌和镉硒。可通过已知方法来进行通过非共价键将物质包封入本发明的多聚体的内腔中，例如以与将物质包封入多聚体的内腔中的方法(参见例如I.Yamashita等，Chem.Lett.，2005，第33卷，第1158页)相同的方式进行。具体地，可通过以下方式将物质包封入本发明的多聚体的内腔中：使本发明的多聚体(或本发明的融合蛋白)和待包封的物质共存于缓冲液（例如HEPES缓冲液）中，然后使它们在适当的温度(例如0至37℃)下放置。[0126] 对于本发明的多聚体而言，在内腔中包含物质的情况下，可以以下述形式提供：包含不同的多种(例如两种、三种或四种)物质的不同的多种多聚体的组(set)的形式。例如，在以包含两种物质的两种多聚体的组的形式提供本发明的多聚体的情况下，这样的组可通过将包封第一物质的第一多聚体与包封不同于第一物质的第二物质的第二多聚体组合来获得，所述第二多聚体与所述第一多聚体分别单独制备。通过将以上所描述的融合蛋白的多种模式与包封的物质的多种模式适当组合，可获得多样性非常丰富的本发明的多聚体。[0127] 在优选的实施方式中，本发明的多聚体是包含融合蛋白的多聚体，该融合蛋白包含(a)人铁蛋白单体、和(b)在人铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽，并且，本发明的多聚体具有内腔，功能肽具有与生物有机分子结合的能力。在使用人铁蛋白单体作为融合蛋白中的铁蛋白单体的情况下，多聚体可以是24聚体。本发明的多聚体可在内腔中含有药物。此类多聚体，使得能够如以上所描述地将药物包封在内腔中，以及与作为功能肽的靶标的生物有机分子结合，因此可以将药物特异性地递送到其中存在生物有机分子的生物靶标部位。因此，本发明的多聚体例如作为药物递送系统(DDS)有用。对于本发明的多聚体而言，鉴于其中所含的人铁蛋白单体对人不具有抗原性和免疫原性，在临床应用中还具有安全性优异的优点。[0128] 在另一优选实施方式中，本发明的多聚体是包含融合蛋白的多聚体，该融合蛋白包含(a)铁蛋白单体、和(b)在铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽，并且本发明的多聚体具有内腔，功能肽具有与金属材料、硅材料或碳材料结合的能力。融合蛋白可在N末端和/或C末端具有肽部分，该肽部分具有与金属材料、硅材料或碳材料结合的能力(优选与“不同于功能肽所结合的材料的材料”结合的能力)。在使用动物铁蛋白单体作为融合蛋白中的铁蛋白单体的情况下，多聚体可以是24聚体。在使用微生物铁蛋白单体作为融合蛋白中的铁蛋白单体的情况下，多聚体可以是12聚体。此类多聚体在例如以下的用途中有用：电子器件(例如光电转换元件(例如染料敏化太阳能电池等太阳能电池)、产氢元件、净水材料、抗菌材料和半导体存储元件)的制备等(例如WO2006/126595；WO2012/086647；K.Sano等，NanoLett.，2007，第7卷，第3200页)。[0129] 本发明还提供复合体。本发明的复合体含有本发明的多聚体和靶材料。在本发明的复合体中，靶材料与构成本发明的多聚体的融合蛋白中的功能肽结合。本发明的多聚体、构成该多聚体的融合蛋白和靶材料的实例及优选实例如以上所描述。靶材料也可含于另一种物体中、或者可以是与另一种物体结合的状态。例如，作为靶材料，可使用包含生物有机分子(例如细胞表面抗原分子)的细胞、或包含此类细胞的组织。此外，作为靶材料，可使用固定在固相(例如诸如孔板之类的板、支撑体、底材、元件或器件)上的材料。[0130] 在优选的实施方式中，本发明的复合体是包含(1)本发明的多聚体和(2)生物有机分子的复合体，其中生物有机分子与下述的功能肽结合；所述本发明的多聚体包含融合蛋白，该融合蛋白包含(a)人铁蛋白单体、和(b)在人铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽，所述本发明的多聚体具有内腔，功能肽具有与生物有机分子结合的能力。此类复合体在DDS的研究和开发(例如药物递送系统的分析)中有用。[0131] 在另一实施方式中，本发明的复合体是包含(1)本发明的多聚体和(2)金属材料、硅材料或碳材料的复合体，其中金属材料、硅材料或碳材料与下述的功能肽结合；所述本发明的多聚体包含融合蛋白，该融合蛋白包含(a)铁蛋白单体、和(b)在铁蛋白单体的B区域和C区域中的α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的功能肽，所述本发明的多聚体具有内腔，功能肽具有与金属材料、硅材料或碳材料结合的能力。此类复合体在例如以下的用途中有用：电子器件(例如光电转换元件(例如染料敏化太阳能电池等太阳能电池)、产氢元件、净水材料、抗菌材料和半导体存储元件)的制备等(例如WO2006/126595；WO2012/086647；K.Sano等，NanoLett.，2007，第7卷，第3200页)。实施例[0132] 下文，参考实施例来详细描述本发明，但是本发明不局限于这些实施例。[0133] <实施例1：多功能铁蛋白的构建(1)>[0134] 对编码人来源的铁蛋白H链(FTH‑BC‑TBP(SEQIDNO:8和SEQIDNO:9))的DNA进行全合成，在该人来源的铁蛋白H链中，在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了钛识别肽(minTBP1:RKLPDA(SEQIDNO:7))。使用全合成的DNA作为模板，以5'‑GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG‑3'(SEQIDNO:10)和5'‑CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC‑3'(SEQIDNO:11)作为引物进行PCR。此外，使用pET20(默克公司)作为模板，以5'‑TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC‑3'(SEQIDNO:12)和5'‑TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG‑3'(SEQIDNO:13)作为引物进行PCR。使用WizardDNA纯化系统(Clean‑UpSystem)(普洛麦格(Promega)公司)纯化各所得的PCR产物，然后使用In‑FusionHD克隆试剂盒(TakaraBio公司)在50℃下进行15分钟的In‑Fusion酶处理，从而构建了携带编码FTH‑BC‑TBP的基因的表达质粒(pET20‑FTH‑BC‑TBP)；[0135] 此外，对编码人来源的铁蛋白H链(FTH‑D‑TBP，SEQIDNO:250和SEQIDNO:251)的DNA进行全合成，在该人来源的铁蛋白H链中，在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第四个和第五个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了钛识别肽(minTBP1)。使用全合成的编码FTH‑D‑TBP的DNA作为模板，以及使用与FTH‑BC‑TBP的那些相同的引物和反应体系构建了携带编码FTH‑D‑TBP的基因的表达质粒(pET20‑FTH‑D‑TBP)。[0136] 随后，使用烧瓶将向其中引入了构建的pET20‑FTH‑BC‑TBP的大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）BL21(DE3)在100mL的LB培养基(包括10g/L的细菌用胰蛋白胨(Bacto‑tryptone)、5g/L的细菌用酵母提取物(Bacto‑yeastextract)、5g/L的NaCl和100mg/L的氨苄西林)中于37℃培养24小时。超声破碎所得的菌体(细菌细胞)，然后将上清液在60℃下加热20分钟。将加热后获得的上清液注入用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerpQHP柱(GEHealthcare公司)中。然后，通过应用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)中所含的0mM至500mMNaCl的盐浓度梯度来分离和纯化目标蛋白。通过使用Vivaspin20‑100K(GEHealthcare公司)的离心超滤，用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)置换含有该蛋白的溶液的溶剂。将所得溶液注入用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep26/60SephacrylS‑300HR柱(GEHealthcare公司)中，以利用尺寸分离和纯化FTH‑BC‑TBP。以相同方式使用大肠埃希氏菌（E.coli）表达FTH‑D‑TBP，并进行纯化。[0137] 通过使用了ZetasizerNanoZS(马尔文(Malvern)公司)的动态光散射方法(DLS)来评价所得的铁蛋白的粒径和溶液分散性。如图1‑1和1‑2中所示，FTH‑BC‑TBP和FTH‑D‑TBP均表现出平均直径为约12nm的单分散，这表明形成了24聚体的高级结构，且该24聚体彼此没有聚集。[0138] <实施例2：多功能铁蛋白的活性评价(1)>[0139] 通过石英晶体微天平(QCM)方法评价两种铁蛋白突变体FTH‑BC‑TBP和FTH‑D‑TBP对钛膜的吸附性。[0140] 首先，在钛膜传感器单元(QCMSC‑TI，Initium公司)的钛膜表面上载置2μL的Piranha溶液(通过以3:1混合浓硫酸和过氧化氢水溶液而制备的溶液)，放置5分钟，然后用500μL的水洗涤五次。重复该洗涤两次，以去除钛膜表面上的有机物。随后，将该钛膜传感器单元设置于AFFINIXQNμ(Initium公司)，并在其上载置490μL或495μL的50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)。接着，通过在25℃的测量温度、1000rpm的转速下搅拌并使其放置约30分钟来稳定传感器的输出值。对于每次测量，将调制为100mg/L的各铁蛋白突变体溶液分别加入到载置在钛膜传感器单元上的缓冲液中，以将溶液中的铁蛋白终浓度控制为1.9nM。使用蛋白测定CBB溶液(NacalaiTesque公司)，将牛白蛋白作为标准来确定评价中所用的铁蛋白溶液的浓度。使用以下设置进行测量，以根据QCM的频率变化来评价钛膜表面上的吸附量；所述设置是：铁蛋白24聚体的分子量为529kDa，反应温度为25℃，搅拌转速为1000rpm，频率为27MHz，且测量间隔为5秒。[0141] 其结果是，通过加入含有FTH‑BC‑TBP或FTH‑D‑TBP的缓冲液，可确认QCM的频率变化，这证明了这些铁蛋白突变体表现出对钛膜的吸附性(图2)。[0142] 随后，在相同的条件下将调制为100mg/L的各铁蛋白突变体溶液加入到载置在钛膜传感器单元上的缓冲液中，以将溶液中的铁蛋白终浓度控制为0.2nM至5.6nM，用以测量频率变化。然后，对各浓度的倒数与频率变化的倒数之间的相关关系作图，从其斜率求出化学平衡离解常数KD值。[0143] 其结果是，FTH‑BC‑TBP的KD值为0.97nM，是FTH‑D‑TBP的KD值3.77nM的约四分之一这样的低值(图3)。对该差异进行协方差分析，结果确认了存在显著差异，其中显著性概率p值为1%或更小。这证明，与在第四个和第五个α‑螺旋之间插入了肽的铁蛋白相比，由在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入了钛识别肽的铁蛋白实现了对靶材料的更高的吸附性。[0144] <实施例3：多功能铁蛋白的构建(2)>[0145] 对编码人来源的铁蛋白H链(FHBc(SEQIDNO:15和SEQIDNO:16))的DNA进行全合成，在该人来源的铁蛋白H链中，在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了癌症识别RGD肽(ASDRGDFSG(SEQIDNO: 14))，同时将半胱氨酸添加至C末端。使用全合成的DNA作为模板，以5'‑TTTCATATGACGACCGCGTCCACCTCG‑3' (SEQ ID NO: 17)和5 '‑TTTGGATCCTTAACAGCTTTCATTATCACTG‑3'(SEQIDNO:18)作为引物进行PCR。此外，使用pET20(默克公司)作为模板，以5'‑TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC‑3'(SEQIDNO:12)和5'‑TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG‑3'(SEQIDNO:13)作为引物进行PCR。用限制酶DpnI、BamHI和NdeI消化各所得的PCR产物，用以连接，从而构建了携带编码FHBc的基因的表达质粒(pET20‑FHBc)。[0146] 随后，使用烧瓶将向其中引入了构建的pET20‑FHBc的大肠埃希氏菌BL21(DE3)在100mL的LB培养基(包括10g/L的细菌用胰蛋白胨、5g/L的细菌用酵母提取物、5g/L的NaCl和100mg/L的氨苄西林)中于37℃培养24小时。超声破碎所得的菌体，然后将上清液在60℃下加热20分钟。将加热后获得的上清液注入用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerpQHP柱(GEHealthcare公司)中。然后，通过应用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)中所含的0mM至500mMNaCl的盐浓度梯度来分离和纯化目标蛋白。通过使用Vivaspin20‑100K(GEHealthcare公司)的离心超滤，用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)置换含有该蛋白的溶液的溶剂。将所得溶液注入用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep26/60SephacrylS‑300HR柱(GEHealthcare公司)中，以利用尺寸分离和纯化FHBc。[0147] <实施例4：多功能铁蛋白的高级结构的确认(1)>[0148] 通过用3%磷钨酸(PTA)将其染色，并在透射电子显微镜(TEM)下对其进行分析，确认了如图4中所示的通过自组织而实现的所得的FHBc的笼状结构。结果显示，此时的FTBc的直径为12nm，其与天然存在的人铁蛋白的尺寸相同，这证实了即使在第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入了肽的情况下，所获得的FHBc也能够形成笼状结构而不显著丧失蛋白质的高级结构。[0149] 进行了后续的实验，尝试在各铁蛋白的内腔内形成氧化铁纳米颗粒，用以证实FHBc在维持内部空孔的同时具有铁蛋白的功能。[0150] 制备10mL含有FTBc的Tris‑HCl缓冲液(按终浓度计，包括50mMTris‑HCl(pH8.5)、0.5mg/mL的FTBc、300mMNaCl和1mM硫酸铵铁)，在4℃下放置30分钟，导致溶液的颜色变为橙色。这表明在铁蛋白的内腔内形成了氧化铁纳米颗粒。冷却并放置之后，将所得溶液以6500rpm离心分离15分钟。收集上清液之后，通过使用Vivaspin20‑100K(GEHealthcare公司)的离心超滤，用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)置换所得溶剂。将所得溶液注入用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep16/60SephacrylS‑300HR柱(GEHealthcare公司)中，以分离和纯化具有包封的氧化铁纳米颗粒的FHBc。[0151] 通过使用了ZetasizerNanoZS(马尔文公司)的动态光散射方法(DLS)评价所获得的具有包封的氧化铁纳米颗粒的铁蛋白的粒径和溶液分散性。如图5中所示，具有包封的氧化铁纳米颗粒的FHBc被证实表现出平均直径为16nm或更小的单分散，这表明FHBc没有聚集。[0152] <实施例5：多功能铁蛋白的构建(3)>[0153] 对编码人来源的铁蛋白H链(FTH‑BC‑GBP(SEQIDNO:20和SEQIDNO:21))的DNA进行全合成，在该人来源的铁蛋白H链中，在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了金识别肽(GBP1:MHGKTQATSGTIQS(SEQIDNO:19))。使用全合成的DNA作为模板，以5'‑GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG‑3'(SEQIDNO:10)和5'‑CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC‑3'(SEQIDNO:11)作为引物进行PCR。此外，使用pET20(默克公司)作为模板，以5'‑TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC‑3' (SEQ ID NO: 12)和5'‑TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG‑3'(SEQIDNO:13)作为引物进行PCR。使用WizardDNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化各所得的PCR产物，然后使用In‑FusionHD克隆试剂盒(TakaraBio公司)在50℃下进行15分钟的In‑Fusion酶处理，从而构建了携带合成基因的表达质粒。在该质粒上携带的合成基因的经确认的核酸序列中，在金识别肽GBP1的氨基酸序列的开始处缺失了蛋氨酸。为了修饰该蛋氨酸的缺失，使用构建的质粒作为模板DNA，以5'‑ATGCATGGCAAAACCCAGGCGACCAG‑3'(SEQIDNO:22)和5'‑ACCCTTGATATCCTGAAGGA‑3'(SEQIDNO:23)作为引物进行PCR。随后，使用WizardDNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化所得的PCR产物，然后用T4多核苷酸激酶(TakaraBio公司)处理，并在37℃下放置30分钟，用以将PCR产物的5'末端磷酸化。使所得DNA进行自身连接，从而构建了携带FTH‑BC‑GBP的表达质粒(pET20‑FTH‑BC‑GBP)；[0154] 此外，对编码人来源的铁蛋白H链(FTH‑D‑GBP，SEQIDNO:252和SEQIDNO:253)的DNA进行全合成，在该人来源的铁蛋白H链中，在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第四个和第五个α‑螺旋之间插入并融合了金识别肽(GBP1)。使用全合成的编码FTH‑D‑GBP的DNA作为模板，以及使用与FTH‑BC‑GBP的那些相同的引物和反应体系构建了携带编码FTH‑D‑GBP的基因的表达质粒(pET20‑FTH‑D‑GBP)。由于在该金识别肽GBP1的氨基酸序列的开始处缺失了蛋氨酸，因此通过以下方式来构建携带FTH‑D‑GBP的表达质粒(pET20‑FTH‑D‑GBP)：以与FTH‑BC‑GBP的情况中相同的方式，以5'‑ATGCATGGCAAAACCCAGGCGACCAG‑3'(SEQIDNO:22)和5'‑ATGTGTCTCAATGAAGTCACACAA‑3'(SEQIDNO:254)作为引物进行PCR，然后用T4多核苷酸激酶(TakaraBio公司)进行处理。[0155] 随后，使用烧瓶将向其中引入了构建的pET20‑FTH‑BC‑GBP的大肠埃希氏菌BL21(DE3)在100mL的LB培养基(包括10g/L的细菌用胰蛋白胨、5g/L的细菌用酵母提取物、5g/L的NaCl和100mg/L的氨苄西林)中于37℃培养24小时。超声破碎所得的菌体，然后将上清液在60℃下加热20分钟。将加热后获得的上清液注入用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerpQHP柱(GEHealthcare公司)中。然后，通过应用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)中所含的0mM至500mMNaCl的盐浓度梯度来分离和纯化目标蛋白。通过使用Vivaspin20‑100K(GEHealthcare公司)的离心超滤，用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)置换含有该蛋白的溶液的溶剂。将所得溶液注入用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep26/60SephacrylS‑300HR柱(GEHealthcare公司)中，以利用尺寸分离和纯化FTH‑BC‑GBP。以相同方式使用大肠埃希氏菌（E.coli）表达FTH‑D‑GBP，并进行纯化。[0156] 通过使用了ZetasizerNanoZS(马尔文公司)的动态光散射方法(DLS)来评价所得的铁蛋白的粒径和溶液分散性。如图6‑1和6‑2中所示，FTH‑BC‑GBP和FTH‑D‑GBP均表现出平均直径为约12nm的单分散，这表明形成了24聚体的高级结构，且该24聚体彼此没有聚集。[0157] <实施例6：多功能铁蛋白的活性评价(2)>[0158] 通过石英晶体微天平(QCM)方法评价两种铁蛋白突变体FTH‑BC‑GBP和FTH‑D‑GBP对金膜的吸附性。[0159] 首先，在金膜传感器单元(QCMSC‑AU，Initium公司)的金膜表面上载置2μL的Piranha溶液(通过以3:1混合浓硫酸和过氧化氢水溶液而制备的溶液)，放置5分钟，然后用500μL的水洗涤五次。重复该洗涤两次，以去除金膜表面上的有机物。随后，将该金膜传感器单元设置于AFFINIXQNμ(Initium公司)，并在其上载置490μL或495μL的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)。接着，通过在25℃的测量温度、1000rpm的转速下搅拌并使其放置约30分钟来稳定传感器的输出值。接着，将调制为100mg/L的各铁蛋白突变体溶液分别加入到载置在金膜传感器单元上的缓冲液中，以将溶液中的铁蛋白终浓度控制为0.3nM至5.4nM，用以测量频率变化。使用蛋白测定CBB溶液(NacalaiTesque公司)，将牛白蛋白作为标准来确定评价中所用的铁蛋白溶液的浓度。使用以下设置进行测量，以根据频率变化来评价金膜表面上的吸附量；所述设置是：铁蛋白24聚体的分子量为546kDa，QCM的频率为27MHz，且测量间隔为5秒。然后，对各浓度的倒数与频率变化的倒数之间的相关关系作图，从其斜率求出化学平衡离解常数KD值。[0160] 其结果是，FTH‑BC‑GBP的KD值为0.42nM，是FTH‑D‑GBP的KD值3.10nM的约七分之一这样的低值(图7)。对该差异进行协方差分析，结果确认了存在显著差异，其中显著性概率p值为1%或更小。这证明，与在第四个和第五个α‑螺旋之间插入了肽的铁蛋白相比，由在从包含6个α‑螺旋的H链铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入了金识别肽的铁蛋白实现了对靶材料的更高的吸附性。[0161] <实施例7：多功能铁蛋白的构建(4)>[0162] 对编码人来源的铁蛋白L链(FTL‑BC‑GBP(SEQIDNO:24和SEQIDNO:25)，图8)的DNA进行全合成，在该人来源的铁蛋白L链中，在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了金识别肽(GBP1:MHGKTQATSGTIQS(SEQIDNO:19))。使用全合成的DNA作为模板，以5'‑GAAGGAGATATACATATGAGCTCCCAGATTCGTCAG‑3'(SEQIDNO:26)和5'‑CTCGAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTGAGAGTGAG‑3'(SEQIDNO:27)作为引物进行PCR。此外，使用pET20(默克公司)作为模板，以5'‑TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC‑3' (SEQ ID NO:12)和5'‑TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG‑3'(SEQIDNO:13)作为引物进行PCR。使用WizardDNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化各所得的PCR产物，然后使用In‑FusionHD克隆试剂盒(TakaraBio公司)在50℃下进行15分钟的In‑Fusion酶处理，从而构建了携带合成基因的表达质粒。在该质粒上携带的合成基因的经确认的核酸序列中，在金识别肽GBP1的氨基酸序列的开始处缺失了蛋氨酸。为了修饰该蛋氨酸的缺失，使用构建的质粒作为模板DNA，以5'‑ATGCATGGCAAAACCCAGGCGACCAG‑3'(SEQIDNO:22)和5'‑ACCCTTGATGTCCTGGAAGAGA‑3'(SEQIDNO:28)作为引物进行PCR。随后，使用WizardDNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化所得的PCR产物，然后用T4多核苷酸激酶(TakaraBio公司)处理，并在37℃下放置30分钟，用以将PCR产物的5'末端磷酸化。使所得DNA进行自身连接，从而构建了携带FTL‑BC‑GBP的表达质粒(pET20‑FTL‑BC‑GBP)。[0163] 此外，对编码人来源的铁蛋白L链(FTL‑DE‑GBP(SEQIDNO:29和SEQIDNO:30)图9)的DNA进行全合成，在该人来源的铁蛋白L链中，在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第五个和第六个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了金识别肽(GBP1)。还使用全合成的编码FTL‑DE‑GBP的DNA作为模板，以及使用与FTL‑BC‑GBP的那些相同的引物和反应体系构建了携带编码FTL‑DE‑GBP的基因的表达质粒(pET20‑FTL‑DE‑GBP)。由于在该金识别肽GBP1的氨基酸序列的开始处缺失了蛋氨酸，因此通过以下方式来构建携带FTL‑DE‑GBP的表达质粒(pET20‑FTL‑DE‑GBP)：以与FTL‑BC‑GBP的情况中相同的方式，以5'‑ATGCATGGCAAAACCCAGGCGACCAG‑3'(SEQIDNO:22)和5'‑CATACCCAGCCTGTGGAGGT‑3'(SEQIDNO:31)作为引物进行PCR，然后用T4多核苷酸激酶进行处理。[0164] 随后，使用烧瓶将向其中引入了构建的pET20‑FTL‑BC‑GBP的大肠埃希氏菌BL21(DE3)在100mL的LB培养基(包括10g/L的细菌用胰蛋白胨、5g/L的细菌用酵母提取物、5g/L的NaCl和100mg/L的氨苄西林)中于30℃培养24小时。超声破碎所得的菌体，然后将上清液在60℃下加热20分钟。将加热后获得的上清液注入用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerpQHP柱(GEHealthcare公司)中。然后，通过应用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)中所含的0mM至500mMNaCl的盐浓度梯度来分离和纯化目标蛋白。通过使用Vivaspin20‑100K(GEHealthcare公司)的离心超滤，用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)置换含有该蛋白的溶液的溶剂。将所得溶液注入用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep26/60SephacrylS‑300HR柱(GEHealthcare公司)中，以利用尺寸分离和纯化FTL‑BC‑GBP。以相同方式使用大肠埃希氏菌（E.coli）表达FTL‑DE‑GBP，并进行纯化。[0165] <实施例8：多功能铁蛋白的活性评价(3)>[0166] 通过石英晶体微天平(QCM)方法评价两种铁蛋白突变体FTL‑BC‑GBP和FTL‑DE‑GBP对金膜的吸附性。[0167] 首先，在金膜传感器单元(QCMSC‑AU，Initium公司)的金膜表面上载置2μL的Piranha溶液(通过以3:1混合浓硫酸和过氧化氢水溶液而制备的溶液)，放置5分钟，然后用500μL的水洗涤五次。重复该洗涤两次，以去除金膜表面上的有机物。随后，将该金膜传感器单元设置于AFFINIXQNμ(Initium公司)，并在其上载置490μL或495μL的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)。接着，通过在25℃的测量温度、1000rpm的转速下搅拌并使其放置约30分钟来稳定传感器的输出值。对于每次测量，将调制为100mg/L的各铁蛋白突变体溶液分别加入到载置在金膜传感器单元上的缓冲液中，以将溶液中的铁蛋白终浓度控制为0.2nM至4.9nM，用以测量频率变化。使用蛋白测定CBB溶液(NacalaiTesque公司)，将牛白蛋白作为标准来确定评价中所用的铁蛋白溶液的浓度。使用以下设置进行测量，以根据频率变化来评价金膜表面上的吸附量；所述设置是：铁蛋白24聚体的分子量为518kDa，QCM的频率为27MHz，且测量间隔为5秒。然后，对各浓度的倒数与频率变化的倒数之间的相关关系作图，从其斜率求出化学平衡离解常数KD值。[0168] 其结果是，FTL‑BC‑GBP的KD值为1.15nM，是FTL‑DE‑GBP的KD值1.68nM的约70%这样的低值(图10)。对该差异进行协方差分析，结果确认了存在显著差异，其中显著性概率p值为5%或更小。这证明，与在第五个和第六个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入了肽的铁蛋白相比，由在从包含6个α‑螺旋的L链铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入了金识别肽的铁蛋白实现了对靶材料的更高的吸附性。[0169] 上述结果证实了从N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入的肽在人铁蛋白的H链和L链二者中都是高效的。[0170] <实施例9：多功能微生物来源的铁蛋白(Dps)的构建>[0171] Dps（微生物中铁蛋白的同源蛋白质）具有12个单体，该12个单体各自具有与铁蛋白类似的结构。该12个单体结合在一起，以形成小于铁蛋白的笼状，其外径为9nm，且内径为4.5nm。铁蛋白和Dps的单体的立体结构彼此十分相似。已知在Dps的柔性连接区中形成包含7个氨基酸的小α‑螺旋，该柔性连接区对应于从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区(Int.J.Mol.Sci.2011；12(8):5406‑5421)。于是，构建了无害李斯特菌（Listeriainnocua）来源的Dps(BCDps‑CS4，SEQIDNO:33和SEQIDNO:34)，其中在C末端和对应于铁蛋白的区域处插入了异源肽(QVNGLGERSQQM(SEQIDNO:32))。[0172] 首先，对BCDps‑CS4基因的一部分进行全合成。使用全合成的基因作为模板，以5'‑TTTCATATGAAAACAATCAACTCAGTAG‑3'(SEQIDNO:35)和5'‑TTTGGATCCTTACATCTGCTGACTCCGCTCACCCAAACCATTCACCTGTTCTAATGGAGCTTTTCCAAG‑3'(SEQIDNO:36)作为引物进行PCR。此外，使用pET20(默克公司)作为模板，以5'‑TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC‑3'(SEQIDNO:12)和5'‑TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG‑3'(SEQIDNO:13)作为引物进行PCR。用限制酶DpnI、BamHI、NdeI消化各所得的PCR产物，用以连接，从而构建了携带编码BCDps‑CS4的基因的表达质粒(pET20‑BCDps‑CS4)。[0173] 随后，使用烧瓶将向其中引入了构建的pET20‑BCDps‑CS4的大肠埃希氏菌BL21(DE3)在100mL的LB培养基(包括10g/L的细菌用胰蛋白胨、5g/L的细菌用酵母提取物、5g/L的NaCl和100mg/L的氨苄西林)中于37℃培养24小时。超声破碎所得的菌体，然后将上清液在60℃下加热20分钟。将加热后获得的上清液注入用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerpQHP柱(GEHealthcare公司)中。然后，通过应用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)中所含的0mM至500mMNaCl的盐浓度梯度来分离和纯化目标蛋白。通过使用Vivaspin20‑100K(GEHealthcare公司)的离心超滤，用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)置换含有该蛋白的溶液的溶剂。将所得溶液注入用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep26/60SephacrylS‑300HR柱(GEHealthcare公司)中，以利用尺寸分离和纯化BCDps‑CS4。[0174] <实施例10：多功能Dps的高级结构的确认>[0175] 通过用3%磷钨酸(PTA)将其染色，并在透射电子显微镜(TEM)下对其进行分析，确认了如图11中所示的通过自组织而实现的所得的BCDps‑CS4的笼状结构。结果显示，此时的BCDps‑CS4的直径为9nm，其与天然存在的Dps的尺寸相同，这证实了，即使在对应于人铁蛋白的第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区的部位中插入了肽情况下，Dps也能够形成与天然存在的Dps同等的笼状结构而不显著丧失蛋白质的高级结构。[0176] <实施例11：多功能铁蛋白的构建(5)>[0177] 对编码人来源的铁蛋白H链(FTH‑DE‑GBP(SEQIDNO:255和SEQIDNO:256))的DNA进行全合成，在该人来源的铁蛋白H链中，在从包含6个α‑螺旋的铁蛋白单体的N末端起数第五个和第六个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入并融合了金识别肽(GBP1:MHGKTQATSGTIQS(SEQIDNO:19))。使用全合成的DNA作为模板，以5'‑GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG‑3'(SEQIDNO:10)和5'‑CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC‑3'(SEQIDNO:11)作为引物进行PCR。此外，使用pET20(默克公司)作为模板，以5'‑TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC‑3' (SEQ ID NO:12)和5'‑TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG‑3'(SEQIDNO:13)作为引物进行PCR。使用WizardDNA纯化系统(普洛麦格公司)纯化各所得的PCR产物，然后使用In‑FusionHD克隆试剂盒(TakaraBio公司)在50℃下进行15分钟的In‑Fusion酶处理，从而构建了携带多功能铁蛋白的构建FTH‑DE‑GBP的表达质粒(pET20‑FTH‑DE‑GBP)。[0178] 随后，使用烧瓶将向其中引入了构建的pET20‑FTH‑DE‑GBP的大肠埃希氏菌BL21(DE3)在100mL的LB培养基(包括10g/L的细菌用胰蛋白胨、5g/L的细菌用酵母提取物、5g/L的NaCl和100mg/L的氨苄西林)中于37℃培养24小时。超声破碎所得的菌体，然后将上清液在60℃下加热20分钟。将加热后获得的上清液注入用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPerpQHP柱(GEHealthcare公司)中。然后，通过应用50mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)中所含的0mM至500mMNaCl的盐浓度梯度来分离和纯化目标蛋白。通过使用Vivaspin20‑100K(GEHealthcare公司)的离心超滤，用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)置换含有该蛋白的溶液的溶剂。将所得溶液注入用10mMTris‑HCl缓冲液(pH8.0)平衡化的HiPrep26/60SephacrylS‑300HR柱(GEHealthcare公司)中，以利用尺寸分离和纯化FTH‑DE‑GBP。[0179] <实施例12：多功能铁蛋白的活性评价(4)>[0180] 通过石英晶体微天平(QCM)方法评价两种铁蛋白突变体FTH‑BC‑GBP和FTH‑DE‑GBP对金膜的吸附性。[0181] 首先，在金膜传感器单元(QCMSC‑AU，Initium公司)的金膜表面上载置2μL的Piranha溶液(通过以3:1混合浓硫酸和过氧化氢水溶液而制备的溶液)，放置5分钟，然后用500μL的水洗涤五次。重复该洗涤两次，以去除金膜表面上的有机物。随后，将该金膜传感器单元设置于AFFINIXQNμ(Initium公司)，并在其上载置490μL或495μL的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)。接着，通过在25℃的测量温度、1000rpm的转速下搅拌并使其放置约30分钟来稳定传感器的输出值。接着，将调制为100mg/L的各铁蛋白突变体溶液分别加入到载置在金膜传感器单元上的缓冲液中，以将溶液中的铁蛋白终浓度控制为0.2nM至2.6nM，用以测量频率变化。使用蛋白测定CBB溶液(NacalaiTesque公司)，将牛白蛋白作为标准来确定评价中所用的铁蛋白溶液的浓度。使用以下设置进行测量，以根据频率变化来评价金膜表面上的吸附量；所述设置是：铁蛋白24聚体的分子量为546kDa，QCM的频率为27MHz，且测量间隔为5秒。然后，对各浓度的倒数与频率变化的倒数之间的相关关系作图，从其斜率求出化学平衡离解常数KD值。[0182] 其结果是，FTH‑DE‑GBP的KD值为1.90nM，实施例6中测量的FTH‑BC‑GBP的KD值0.42nM是约五分之一的低值(图12)。对该差异进行协方差分析，结果确认了存在显著差异，其中显著性概率p值为5%或更小。这证明，与在第五个和第六个α‑螺旋之间插入了肽的铁蛋白相比，由在从包含6个α‑螺旋的H链铁蛋白单体的N末端起数第二个和第三个α‑螺旋之间的柔性连接区中插入了金识别肽的铁蛋白实现了对靶材料的更高的吸附性。[0183] 工业适用性[0184] 本发明的多聚体在诸如新的药物递送系统(DDS)和电子器件的制备等用途中具有应用前景。例如，在构成本发明的多聚体的融合蛋白中的铁蛋白单体是人铁蛋白单体的情况下，本发明的多聚体作为DDS有用。此外，鉴于人铁蛋白单体对人不具有抗原性和免疫原性，本发明的多聚体在临床应用中具有安全性优异的优点。另一方面，在该铁蛋白单体是微生物铁蛋白单体的情况下，本发明的多聚体在电子器件的制备中有用。本发明的融合蛋白例如在本发明的多聚体的制备中有用。本发明的复合体例如在诸如新的药物递送系统(DDS)的研究和开发、及电子器件的制备之类的用途中有用。本发明的多核苷酸、表达载体和宿主细胞使得能够容易地制备本发明的融合蛋白。因此，本发明的多核苷酸、表达载体和宿主细胞在例如本发明的多聚体的制备中有用。

专利地区：日本

专利申请日期：2019-02-21

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN111712574B