一种基于比色卡的药敏检测方法发明专利

专利名称：一种基于比色卡的药敏检测方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210919341.3

专利申请（专利权）人：杭州汉菁生物科技有限公司
权利人地址：浙江省杭州市富阳区银湖街道中国智谷富春园区C3号楼3楼

专利发明（设计）人：阮奔放

专利摘要：本发明属于药敏检测技术领域，本发明提供了一种基于比色卡的药敏检测方法。本发明方法是通过将菌液和EZMTT药敏指示剂混合加于药敏板，然后将设计好的比色卡(包括CLSI标准药敏判定的折点、药物隔断标记、药物名称和药物浓度)与药敏板叠加，再通过读片灯上的白光将药敏板各个孔的颜色变化与比色卡上标注的信息颜色合成的新组合，可以简单快速且精准地判定细菌对药板上任一药物的敏感/耐药性。本发明方法无需昂贵的仪器，减少了药物颜色和水汽的干扰，且原始药敏结果连同比色卡一同拍照，可保存原始数据。

主权利要求：
1.一种基于比色卡的药敏检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将微生物培养基与EZMTT药敏指示剂混合，得药敏试验培养基，并以药敏试验培养基作为阴性对照；
（2）将待测菌液与所得上述药敏试验培养基混合，得混合菌悬液，并以混合菌悬液作为阳性对照；
（3）将不同待测药物分别与所得上述混合菌悬液混合，得药敏试验品；
（4）将步骤（1）所得的阴性对照、步骤（2）所得的阳性对照与步骤（3）所得的药敏试验品加入药敏板中于同一条件下进行培养；
（5）设计比色卡，所述比色卡上包括CLSI标准药敏判定的折点、药物隔断标记、药物名称和药物浓度，所述CLSI标准药敏判定的折点包括敏感性折点S，中间折点I和耐药性折点R；
（6）培养结束后，观察步骤（4）中所述阴性对照、阳性对照和药敏试验品的培养情况，当阳性对照呈现棕色或橙黄色且阴性对照呈现浅黄色或无色时，将阳性对照与阴性对照混合，并将其显示的颜色作为MIC值的判定标准颜色，然后将药敏板进行膜封或盖封，放置于读片灯上；
（7）在药敏板上方加置比色卡，按照卡上所记载的信息与药敏板上的阴性对照、阳性对照、药敏试验品一一对应放置，比较颜色，若药敏试验品每个浓度的颜色均位于MIC值的判定标准颜色与阳性对照颜色之间或者比阳性对照的颜色更深，则其MIC值为≥最高药物浓度的1.5 2.5倍，直接判定待测菌为对应待测药物的耐药菌R；
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若药敏试验品每个浓度的颜色均位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间，则其MIC值为≤最低药物浓度，直接判定待测菌为对应待测药物的敏感菌S；
其他情况，则由比色卡上所记载的药物低浓度向高浓度观察颜色，以最先出现的位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间的颜色对应的药物浓度为MIC值，将MIC值与比色卡上的CLSI标准药敏判定的折点进行比较，若MIC值≤敏感性折点S所对应的药物浓度，则待测菌为对应待测药物的敏感菌S；若MIC值≥耐药性折点R所对应的药物浓度，则待测菌为对应待测药物的耐药菌R；若敏感性折点S所对应的药物浓度＜MIC值＜耐药性折点R所对应的药物浓度，则待测菌为对应待测药物的中介菌I。
2.根据权利要求1所述的一种基于比色卡的药敏检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述微生物培养基与EZMTT药敏指示剂的混合体积比为190 210:1，所述微生物培养基包括~CAMHB肉汤培养基、RPMI培养基或罗氏培养基。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于比色卡的药敏检测方法，其特征在于，步骤（2）中8
所述待测菌液的浓度为1.4 1.6×10 个/mL，所述待测菌液与药敏试验培养基的混合体积~比为1:190 210。
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4.根据权利要求3所述的一种基于比色卡的药敏检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述混合菌悬液的体积为使待测药物达到指定药物浓度。
5.根据权利要求4所述的一种基于比色卡的药敏检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述药敏板包括孔板或孔卡，所述培养的温度为33 37℃，所述培养的时间为1/6 7d。
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6.根据权利要求5所述的一种基于比色卡的药敏检测方法，其特征在于，步骤（6）中所述阳性对照与阴性对照的混合体积比为2 3:5。
~ 说明书 : 一种基于比色卡的药敏检测方法技术领域[0001] 本发明涉及药敏检测技术领域，尤其涉及一种基于比色卡的药敏检测方法。背景技术[0002] 常用致病菌药敏检测的方法是浊度法(如图1所示)，该法通过目测混浊判定细菌生长，清亮判定细菌不生长，精准度比较差，受检验员的目测判定影响比较大。虽然昂贵的药敏检测仪器可以减小检验员目测标准带来的误差，但是浊度法本身的信号弱，实验的可靠性差表现在其评价指标z因子值小。EZMTT指示剂可以将浊度转化为明显的红棕色，不生长或弱生长的“清亮”孔显浅黄色，生长孔颜色变化明显，可以轻松判定生长和不生长(如图2所示)。但是在实际药敏研究中，EZMTT指示结果需要结合酶标仪读板的吸光度，这个过程会受药物颜色干扰和水汽干扰，另外还需要配套软件进行数据分析，最后还需要人工质控，非常复杂。因此，急需提供一种简单快速且不需昂贵仪器即可精准判定细菌对药板上任一药物的敏感/耐药性的药敏检测方法。发明内容[0003] 为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种基于比色卡的药敏检测方法。[0004] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0005] 本发明提供了一种基于比色卡的药敏检测方法，包括如下步骤：[0006] (1)将微生物培养基与EZMTT药敏指示剂混合，得药敏试验培养基，并以药敏试验培养基作为阴性对照；[0007] (2)将待测菌液与上述所得药敏试验培养基混合，得混合菌悬液，并以混合菌悬液作为阳性对照；[0008] (3)将不同待测药物分别与上述所得混合菌悬液混合，得药敏试验品；[0009] (4)将步骤(1)所得的阴性对照、步骤(2)所得的阳性对照与步骤(3)所得的药敏试验品加入药敏板中于同一条件下进行培养；[0010] (5)设计比色卡，所述比色卡上包括CLSI标准药敏判定的折点、药物隔断标记、药物名称和药物浓度，所述CLSI标准药敏判定的折点包括敏感性折点S，中间折点I和耐药性折点R；[0011] (6)培养结束后，观察步骤(4)中所述阴性对照、阳性对照和药敏试验品的培养情况，当阳性对照呈现棕色或橙黄色且阴性对照呈现浅黄色或无色时，将阳性对照与阴性对照混合，并将其显示的颜色作为MIC值的判定标准颜色，然后将药敏板进行膜封或盖封，放置于读片灯上；[0012] (7)在药敏板上方加置比色卡，按照卡上所记载的信息与药敏板上的阴性对照、阳性对照、药敏试验品一一对应放置，比较颜色，若药敏试验品每个浓度的颜色均位于MIC值的判定标准颜色与阳性对照颜色之间或者比阳性对照的颜色更深，则其MIC值为≥最高药物浓度的1.5～2.5倍，直接判定待测菌为对应待测药物的耐药菌R；[0013] 若药敏试验品每个浓度的颜色均位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间，则其MIC值为≤最低药物浓度，直接判定待测菌为对应待测药物的敏感菌S；[0014] 其他情况，则由比色卡上所记载的药物低浓度向高浓度观察颜色，以最先出现的位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间的颜色对应的药物浓度为MIC值，将MIC值与比色卡上的CLSI标准药敏判定的折点进行比较，若MIC值≤敏感性折点S所对应的药物浓度，则待测菌为对应待测药物的敏感菌S；若MIC值≥耐药性折点R所对应的药物浓度，则待测菌为对应待测药物的耐药菌R；若敏感性折点S所对应的药物浓度＜MIC值＜耐药性折点R所对应的药物浓度，则待测菌为对应待测药物的中介菌I。[0015] 优选的，步骤(1)中所述微生物培养基与EZMTT药敏指示剂的混合体积比为190～210:1，所述微生物培养基包括CAMHB肉汤培养基、RPMI培养基或罗氏培养基。[0016] 优选的，步骤(2)中所述待测菌液的浓度为1.4～1.6×108个/mL，所述待测菌液与药敏试验培养基的混合体积比为1:190～210。[0017] 优选的，步骤(3)中所述混合菌悬液的体积为使待测药物达到该孔指定药物浓度。[0018] 优选的，步骤(4)中所述药敏板包括孔板或孔卡，所述培养的温度为33～37℃，所述培养的时间为1/6～7d。[0019] 优选的，步骤(6)中所述阳性对照与阴性对照的混合体积比为2～3:5。[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：[0021] 1、本发明通过将菌液和EZMTT药敏指示剂混合加于药敏板，然后将设计好的比色卡(包括CLSI标准药敏判定的折点、药物隔断标记、药物名称和药物浓度)与药敏板叠加，再通过读片灯上的白光将药敏板各个孔的颜色变化与比色卡上标注的信息颜色合成的新组合，可以简单快速且精准地判定细菌对药板上任一药物的敏感/耐药性。[0022] 2、本发明方法无需昂贵的仪器，减少了药物颜色和水汽的干扰，且原始药敏结果连同比色卡一同拍照，可保存原始数据。附图说明[0023] 图1为浊度法判定药敏检测结果(注：11E、11F、11G、11H的孔混浊有生长；12E、12F、12G、12H的孔清亮没生长；1～9A、1～9B、1～9C、1～9D的孔为菌的浓度两倍稀释，5～9A、5～9B、5～9C、5～9D的孔的生长情况通过目测难以判定)；[0024] 图2为EZMTT指示剂法检测结果(注：橙色及红棕色孔为耐药孔(ABCD12345678排列组合的32个孔)；透明澄清的浅黄色及更浅颜色的孔为抑菌孔(本身带有颜色的药物除外))；[0025] 图3为本发明基于比色卡的药敏检测方法的整体示意图；[0026] 图4为本发明实验例1的药敏检测结果；[0027] 图5为本发明实验例2的药敏检测结果；[0028] 图6为本发明实验例3的药敏检测结果；[0029] 图7为本发明实验例4的比色卡示意图(注：CLSI药敏试验标准规定：若检测样品为大肠埃希菌或肺炎克雷伯菌的尿液，则抗生素CZO以紫红色圈为判定标准，其中标有低浓度的紫红色圈为敏感孔，标有高浓度的紫红色圈为耐药孔)；[0030] 图8为本发明实验例4的药敏检测结果。具体实施方式[0031] 本发明提供了一种基于比色卡的药敏检测方法，包括如下步骤：[0032] (1)将微生物培养基与EZMTT药敏指示剂混合，得药敏试验培养基，并以药敏试验培养基作为阴性对照；[0033] (2)将待测菌液与上述所得药敏试验培养基混合，得混合菌悬液，并以混合菌悬液作为阳性对照；[0034] (3)将不同待测药物分别与上述所得混合菌悬液混合，得药敏试验品；[0035] (4)将步骤(1)所得的阴性对照、步骤(2)所得的阳性对照与步骤(3)所得的药敏试验品加入药敏板中于同一条件下进行培养；[0036] (5)设计比色卡，所述比色卡上包括CLSI标准药敏判定的折点、药物隔断标记、药物名称和药物浓度，所述CLSI标准药敏判定的折点包括敏感性折点S，中间折点I和耐药性折点R；[0037] (6)培养结束后，观察步骤(4)中所述阴性对照、阳性对照和药敏试验品的培养情况，当阳性对照呈现棕色或橙黄色且阴性对照呈现浅黄色或无色时，将阳性对照与阴性对照混合，并将其显示的颜色作为MIC值的判定标准颜色，然后将药敏板进行膜封或盖封，放置于读片灯上；[0038] (7)在药敏板上方加置比色卡，按照卡上所记载的信息与药敏板上的阴性对照、阳性对照、药敏试验品一一对应放置，比较颜色，若药敏试验品每个浓度的颜色均位于MIC值的判定标准颜色与阳性对照颜色之间或者比阳性对照的颜色更深，则其MIC值为≥最高药物浓度的1.5～2.5倍，直接判定待测菌为对应待测药物的耐药菌R；[0039] 若药敏试验品每个浓度的颜色均位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间，则其MIC值为≤最低药物浓度，直接判定待测菌为对应待测药物的敏感菌S；[0040] 其他情况，则由比色卡上所记载的药物低浓度向高浓度观察颜色，以最先出现的位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间的颜色对应的药物浓度为MIC值，将MIC值与比色卡上的CLSI标准药敏判定的折点进行比较，若MIC值≤敏感性折点S所对应的药物浓度，则待测菌为对应待测药物的敏感菌S；若MIC值≥耐药性折点R所对应的药物浓度，则待测菌为对应待测药物的耐药菌R；若敏感性折点S所对应的药物浓度＜MIC值＜耐药性折点R所对应的药物浓度，则待测菌为对应待测药物的中介菌I。[0041] 在本发明中，步骤(1)中所述微生物培养基与EZMTT药敏指示剂的混合体积比优选为190～210:1，进一步优选为195～205:1，更进一步优选为200:1；所述微生物培养基优选包括CAMHB肉汤培养基、RPMI培养基或罗氏培养基。[0042] 在本发明中，步骤(2)中所述待测菌液的浓度优选为1.4～1.6×108个/mL，进一步8优选为1.5×10个/mL；所述待测菌液与药敏试验培养基的混合体积比优选为1:190～210，进一步优选为1:195～205，更进一步优选为1:200。[0043] 在本发明中，步骤(3)中所述混合菌悬液的体积优选为使待测药物达到该孔指定药物浓度。[0044] 在本发明中，步骤(4)中所述药敏板包括孔板或孔卡，进一步优选为96孔板；所述培养的温度优选为33～37℃，进一步优选为34～36℃，更进一步优选为35℃；所述培养的时间优选为1/6～7d，进一步优选为1～5d，更进一步优选为3d。[0045] 在本发明中，步骤(6)中所述阳性对照与阴性对照的混合体积比优选为2～3:5，进一步优选为1:2。[0046] 在本发明中，步骤(7)中所述在药敏板上方加置比色卡，按照卡上所记载的信息与药敏板上的阴性对照、阳性对照、药敏试验品一一对应放置，比较颜色，若药敏试验品每个浓度的颜色均位于MIC值的判定标准颜色与阳性对照颜色之间或者比阳性对照的颜色更深，则其MIC值为≥最高药物浓度的1.5～2.5倍，直接判定待测菌为对应待测药物的耐药菌R，进一步优选为在药敏板上方加置比色卡，按照卡上所记载的信息与药敏板上的阴性对照、阳性对照、药敏试验品一一对应放置，比较颜色，若药敏试验品每个浓度的颜色均位于MIC值的判定标准颜色与阳性对照颜色之间或者比阳性对照的颜色更深，则其MIC值为≥最高药物浓度的2倍，直接判定待测菌为对应待测药物的耐药菌R。[0047] 下面结合实验例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0048] 实验例1[0049] 以大肠埃希菌(编号为ATCC25922)为例，研究其敏感/耐药性：[0050] (1)将24mLCAMHB肉汤培养基与120μLEZMTT药敏指示剂(购买于杭州健昵福生物科技有限公司，下同)混合，得药敏试验培养基，并将药敏试验培养基加入到药敏板右下方的G12和H12这两个孔作为阴性对照，标记BLK；[0051] (2)用接种环挑取经18h培养的新鲜大肠埃希菌菌落3～10个，碾磨于无菌接种水中，调制成相当于0.5麦氏标准的细菌浓度，将调制好的菌液与上述所得药敏试验培养基按照1:200的体积比混合，得混合菌悬液，并将混合菌悬液加入到药敏板的G11和H11这两个孔作为阳性对照，标记DMSO；[0052] (3)将上述所得混合菌悬液分别加入到除阴性对照孔和阳性对照孔之外的含有不同待测药物的其他药敏孔中(其中混合菌悬液的体积为使对应待测药物达到该孔指定药物浓度)，摇匀，得药敏试验品；[0053] (4)将含有步骤(1)所得的阴性对照、步骤(2)所得的阳性对照与步骤(3)所得的药敏试验品的药敏板放入35℃的培养箱内进行培养；[0054] (5)设计比色卡，所述比色卡上包括CLSI标准药敏判定的折点、药物隔断标记、药物名称和药物浓度，所述CLSI标准药敏判定的折点包括敏感性折点S，中间折点I和耐药性折点R；[0055] (6)培养4小时后取出药敏板，观察步骤(4)中所述阴性对照、阳性对照和药敏试验品的培养情况，当阳性对照呈现棕色或橙黄色且阴性对照呈现浅黄色或无色时，将阳性对照与阴性对照按照1:2的体积比混合，并将其显示的颜色作为MIC值的判定标准颜色，然后将药敏板进行膜封或盖封，放置于读片灯上；[0056] (7)在药敏板上方加置比色卡，按照卡上所记载的信息与药敏板上的阴性对照、阳性对照、药敏试验品一一对应放置，比较颜色，若药敏试验品每个浓度的颜色均位于MIC值的判定标准颜色与阳性对照颜色之间或者比阳性对照的颜色更深，则其MIC值为≥最高药物浓度的2倍，直接判定大肠埃希菌为对应待测药物的耐药菌R；[0057] 若药敏试验品每个浓度的颜色均位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间，则其MIC值为≤最低药物浓度，直接判定大肠埃希菌为对应待测药物的敏感菌S；[0058] 其他情况，则由比色卡上所记载的药物低浓度向高浓度观察颜色，以最先出现的位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间的颜色对应的药物浓度为MIC值，将MIC值与比色卡上的CLSI标准药敏判定的折点进行比较，若MIC值≤敏感性折点S所对应的药物浓度，则大肠埃希菌为对应待测药物的敏感菌S；若MIC值≥耐药性折点R所对应的药物浓度，则大肠埃希菌为对应待测药物的耐药菌R；若敏感性折点S所对应的药物浓度＜MIC值＜耐药性折点R所对应的药物浓度，则大肠埃希菌为对应待测药物的中介菌I。[0059] 具体药敏检测结果如图4所示。[0060] 作为对照，用酶标仪读取上述培养4小时后的药敏板各个孔在630nm和450nm条件下的OD值；450nm的OD值与橙色颜色相关，630nm的OD值与细菌的浊度相关。用计算机软件计算生长率＝(OD450nm样品孔‑OD450nm阴性孔)/(OD450nm阳性孔‑OD450nm阴性孔)，MIC值为浓度从低到高首个出现的生长率≤30％的孔，对照CLSI药敏检测标准，判定药物的耐药敏感性。[0061] 将采用本发明基于比色卡的药敏检测方法的判定结果与酶标仪/软件计算分析法的判定结果进行比较，结果如表1所示。[0062] 表1不同方法下大肠埃希菌的药敏检测结果对比[0063][0064][0065][0066] 由表1可知，将本发明基于比色卡的药敏检测方法的判定结果与酶标仪/软件计算分析法的判定结果进行比较，R/S判定结果完全一致的为91％，略有差别(I/S或S/I)2倍差别的为9％，R/S判定结果相反的为0％。可见，采用本发明基于比色卡的药敏检测方法，判定结果准确可靠。[0067] 实验例2[0068] 以脓肿非结核分子杆菌(编号为BNCC186002)为例，研究其敏感/耐药性：[0069] (1)将24mL罗氏培养基与120μLEZMTT药敏指示剂混合，得药敏试验培养基，并将药敏试验培养基加入到药敏板右下方的G12和H12这两个孔作为阴性对照，标记BLK；[0070] (2)用接种环挑取经18h培养的新鲜脓肿非结核分子杆菌菌落3～10个，碾磨于无菌接种水中，调制成相当于0.5麦氏标准的细菌浓度，将调制好的菌液与上述所得药敏试验培养基按照1:200的体积比混合，得混合菌悬液，并将混合菌悬液加入到药敏板的G11和H11这两个孔作为阳性对照，标记DMSO；[0071] (3)将上述所得混合菌悬液分别加入到除阴性对照孔和阳性对照孔之外的含有不同待测药物的其他药敏孔中(其中混合菌悬液的体积为使对应待测药物达到该孔指定药物浓度)，摇匀，得药敏试验品；[0072] (4)将含有步骤(1)所得的阴性对照、步骤(2)所得的阳性对照与步骤(3)所得的药敏试验品的药敏板放入35℃的培养箱内进行培养；[0073] (5)设计比色卡，所述比色卡上包括CLSI标准药敏判定的折点、药物隔断标记、药物名称和药物浓度，所述CLSI标准药敏判定的折点包括敏感性折点S，中间折点I和耐药性折点R；[0074] (6)培养1d后取出药敏板，观察步骤(4)中所述阴性对照、阳性对照和药敏试验品的培养情况，当阳性对照呈现棕色或橙黄色且阴性对照呈现浅黄色或无色时，将阳性对照与阴性对照按照1:2的体积比混合，并将其显示的颜色作为MIC值的判定标准颜色，然后将药敏板进行膜封，放置于读片灯上；[0075] (7)在药敏板上加置比色卡，按照卡上所记载的信息与药敏板上的阴性对照、阳性对照、药敏试验品一一对应放置，比较颜色，若药敏试验品每个浓度的颜色均位于MIC值的判定标准颜色与阳性对照颜色之间或者比阳性对照的颜色更深，则其MIC值为≥最高药物浓度的2倍，直接判定脓肿非结核分子杆菌为对应待测药物的耐药菌R；[0076] 若药敏试验品每个浓度的颜色均位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间，则其MIC值为≤最低药物浓度，直接判定脓肿非结核分子杆菌为对应待测药物的敏感菌S；[0077] 其他情况，则由比色卡上所记载的药物低浓度向高浓度观察颜色，以最先出现的位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间的颜色对应的药物浓度为MIC值，将MIC值与比色卡上的CLSI标准药敏判定的折点进行比较，若MIC值≤敏感性折点S所对应的药物浓度，则脓肿非结核分子杆菌为对应待测药物的敏感菌S；若MIC值≥耐药性折点R所对应的药物浓度，则脓肿非结核分子杆菌为对应待测药物的耐药菌R；若敏感性折点S所对应的药物浓度＜MIC值＜耐药性折点R所对应的药物浓度，则脓肿非结核分子杆菌为对应待测药物的中介菌I。[0078] 具体药敏检测结果如图5所示。[0079] 作为对照，用酶标仪读取上述培养1d后的药敏板各个孔在630nm和450nm条件下的OD值；450nm的OD值与橙色颜色相关，630nm的OD值与细菌的浊度相关。用计算机软件计算生长率＝(OD450nm样品孔‑OD450nm阴性孔)/(OD450nm阳性孔‑OD450nm阴性孔)，MIC值为浓度从低到高首个出现的生长率≤30％的孔，对照CLSI药敏检测标准，判定药物的耐药敏感性。[0080] 将采用本发明基于比色卡的药敏检测方法的判定结果与酶标仪/软件计算分析法的判定结果进行比较，结果如表2所示。[0081] 表2不同方法下脓肿非结核分子杆菌的药敏检测结果对比[0082][0083][0084] 由表2可知，将本发明基于比色卡的药敏检测方法的判定结果与酶标仪/软件计算分析法的判定结果进行比较，R/S判定结果完全一致的为100％，MIC值略有差别(2倍差别)的为9％。可见，采用本发明基于比色卡的药敏检测方法，判定结果准确可靠。[0085] 实验例3[0086] 以结核菌(H37Ra)为例，研究其敏感/耐药性：[0087] (1)将24mL罗氏培养基与120μLEZMTT药敏指示剂混合，得药敏试验培养基，并将药敏试验培养基加入到药敏板右下方的G12和H12这两个孔作为阴性对照，标记BLK；[0088] (2)用接种环挑取经18h培养的新鲜结核菌菌落3～10个，碾磨于无菌接种水中，调制成相当于0.5麦氏标准的细菌浓度，再稀释10倍，将稀释好的菌液与上述所得药敏试验培养基按照1:200的体积比混合，得混合菌悬液，并将混合菌悬液加入到药敏板的G11和H11这两个孔作为阳性对照，标记DMSO；[0089] (3)将上述所得混合菌悬液分别加入到除阴性对照孔和阳性对照孔之外的含有不同待测药物的其他药敏孔中(其中混合菌悬液的体积为使对应待测药物达到该孔指定药物浓度)，摇匀，得药敏试验品；[0090] (4)将含有步骤(1)所得的阴性对照、步骤(2)所得的阳性对照与步骤(3)所得的药敏试验品的药敏板放入35℃的培养箱内进行培养；[0091] (5)设计比色卡，所述比色卡上包括CLSI标准药敏判定的折点、药物隔断标记、药物名称和药物浓度，所述CLSI标准药敏判定的折点包括敏感性折点S，中间折点I和耐药性折点R；[0092] (6)培养7d后取出药敏板，观察步骤(4)中所述阴性对照、阳性对照和药敏试验品的培养情况，当阳性对照呈现棕色或橙黄色且阴性对照呈现浅黄色或无色时，将阳性对照与阴性对照按照1:2的体积比混合，并将其显示的颜色作为MIC值的判定标准颜色，然后将药敏板进行膜封，放置于读片灯上；[0093] (7)在药敏板上加置比色卡，按照卡上所记载的信息与药敏板上的阴性对照、阳性对照、药敏试验品一一对应放置，比较颜色，若药敏试验品每个浓度的颜色均位于MIC值的判定标准颜色与阳性对照颜色之间或者比阳性对照的颜色更深，则其MIC值为≥最高药物浓度的2倍，直接判定结核菌为对应待测药物的耐药菌R；[0094] 若药敏试验品每个浓度的颜色均位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间，则其MIC值为≤最低药物浓度，直接判定结核菌为对应待测药物的敏感菌S；[0095] 其他情况，则由比色卡上所记载的药物低浓度向高浓度观察颜色，以最先出现的位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间的颜色对应的药物浓度为MIC值，将MIC值与比色卡上的CLSI标准药敏判定的折点进行比较，若MIC值≤敏感性折点S所对应的药物浓度，则结核菌为对应待测药物的敏感菌S；若MIC值≥耐药性折点R所对应的药物浓度，则结核菌为对应待测药物的耐药菌R；若敏感性折点S所对应的药物浓度＜MIC值＜耐药性折点R所对应的药物浓度，则结核菌为对应待测药物的中介菌I。[0096] 具体药敏检测结果如图6所示(当没有出现颜色变化时，如果颜色为DMSO孔的颜色的50％，报道为IC50值)。[0097] 作为对照，用酶标仪读取上述培养7d后的药敏板各个孔在630nm和450nm条件下的OD值；450nm的OD值与橙色颜色相关，630nm的OD值与细菌的浊度相关。用计算机软件计算生长率＝(OD450nm样品孔‑OD450nm阴性孔)/(OD450nm阳性孔‑OD450nm阴性孔)，MIC值为浓度从低到高首个出现的生长率≤30％的孔，对照CLSI药敏检测标准，判定药物的耐药敏感性。[0098] 将采用本发明基于比色卡的药敏检测方法的判定结果与酶标仪/软件计算分析法的判定结果进行比较，结果如表3所示。[0099] 表3不同方法下结核菌的药敏检测结果对比[0100][0101][0102][0103] 注：*表示不是完全抑制，用IC50值表示；#表示软件用30％生长率为MIC，对部分抑制的显示耐药。[0104] 实验例4[0105] 以肺炎克雷伯菌(购买自浙江省杭州市邵逸夫医院，菌种编号为SYF004)为例，研究其敏感/耐药性：[0106] (1)将24mLCAMHB肉汤培养基与120μLEZMTT药敏指示剂混合，得药敏试验培养基，并将药敏试验培养基加入到药敏板右下方的G12和H12这两个孔作为阴性对照，标记BLK；[0107] (2)用接种环挑取经18h培养的新鲜肺炎克雷伯菌菌落3～10个，碾磨于无菌接种水中，调制成相当于0.5麦氏标准的细菌浓度，将调制好的菌液与上述所得药敏试验培养基按照1:200的体积比混合，得混合菌悬液，并将混合菌悬液加入到药敏板的G11和H11这两个孔作为阳性对照，标记DMSO；[0108] (3)将上述所得混合菌悬液分别加入到除阴性对照孔和阳性对照孔之外的含有不同待测药物的其他药敏孔中(其中混合菌悬液的体积为使对应待测药物达到该孔指定药物浓度)，摇匀，得药敏试验品；[0109] (4)将含有步骤(1)所得的阴性对照、步骤(2)所得的阳性对照与步骤(3)所得的药敏试验品的药敏板放入35℃的培养箱内进行培养；[0110] (5)设计比色卡，所述比色卡上包括CLSI标准药敏判定的折点、药物隔断标记、药物名称和药物浓度，所述CLSI标准药敏判定的折点包括敏感性折点S，中间折点I和耐药性折点R，[0111] 具体设计如图7所示：[0112] 敏感性折点S：若抑菌孔在比色卡的绿色圈及其左侧，则为S，MIC值为该孔抗生素的浓度(若某抗生素均为抑菌孔，则MIC值≤最小抗生素浓度)；[0113] 中间折点I：若抑菌孔在比色卡的绿色圈与红色圈之间，则为I；或标为黄色；[0114] 耐药性折点R：若抑菌孔在比色卡的红色圈及其右侧，则为R，MIC值为该孔抗生素的浓度(若某抗生素均为耐药孔，则MIC值≥最大抗生素浓度的二倍)；[0115] 药物隔断：蓝色小柱；[0116] 药物名称和浓度：孔内黑色标注代号和数字；[0117] 特殊情况：若检测样品为大肠埃希菌或肺炎克雷伯菌的尿液，则抗生素CZO以紫红色圈为判定标准，低浓度紫红色圈代表绿色圈，高浓度紫红色圈代表红色圈，判定方法同上；[0118] (6)培养1d后取出药敏板，观察步骤(4)中所述阴性对照、阳性对照和药敏试验品的培养情况，当阳性对照呈现棕色或橙黄色且阴性对照呈现浅黄色或无色时，将阳性对照与阴性对照按照1:2的体积比混合，并将其显示的颜色作为MIC值的判定标准颜色，然后将药敏板进行膜封，放置于读片灯上；[0119] (7)在药敏板上加置比色卡，按照卡上所记载的信息与药敏板上的阴性对照、阳性对照、药敏试验品一一对应放置，比较颜色，若药敏试验品每个浓度的颜色均位于MIC值的判定标准颜色与阳性对照颜色之间或者比阳性对照的颜色更深，则其MIC值为≥最高药物浓度的2倍，直接判定肺炎克雷伯菌为对应待测药物的耐药菌R；[0120] 若药敏试验品每个浓度的颜色均位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间，则其MIC值为≤最低药物浓度，直接判定肺炎克雷伯菌为对应待测药物的敏感菌S；[0121] 其他情况，则由比色卡上所记载的药物低浓度向高浓度观察颜色，以最先出现的位于阴性对照颜色与MIC值的判定标准颜色之间的颜色对应的药物浓度为MIC值，将MIC值与比色卡上的CLSI标准药敏判定的折点进行比较，若MIC值≤敏感性折点S所对应的药物浓度，则肺炎克雷伯菌为对应待测药物的敏感菌S；若MIC值≥耐药性折点R所对应的药物浓度，则肺炎克雷伯菌为对应待测药物的耐药菌R；若敏感性折点S所对应的药物浓度＜MIC值＜耐药性折点R所对应的药物浓度，则肺炎克雷伯菌为对应待测药物的中介菌I。[0122] 具体药敏检测结果如图8和表4所示。[0123] 表4肺炎克雷伯菌的药敏检测结果[0124][0125] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：浙江

专利申请日期：2022-08-02

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN115266700B