一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体及其制备方法和应用

专利名称：一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210636913.7

专利申请（专利权）人：珠海高新创展医学科技有限公司
权利人地址：广东省珠海市高新区唐家湾镇港乐路1号A区厂房11层1103B室

专利发明（设计）人：黄景温,武建功,冯艳巧

专利摘要：本发明属于药物载体技术领域，公开了一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体及其制备方法和应用。本发明在近红外花菁类荧光染料的基础上引入了N‑羟基琥珀酰亚胺结构得到该载体，其化学名为2‑((E)‑2‑((E)‑2‑(4‑(4‑((2,5‑二氧吡咯‑1‑基)氧)‑4‑氧代丁酰基)哌嗪‑1‑基)‑3‑(2‑((E)‑1‑乙基‑3,3‑二甲基吲哚‑2‑叉)亚乙基)环己‑1‑烯‑1‑基)乙烯基)‑1‑乙基‑3,3‑二甲基‑3H‑吲哚‑1‑盐。本发明提供的药物载体结构稳定，具有显著的斯托克斯位移，可以有效降低背景荧光的干扰，极大地提高检测灵敏度；可以有效地与含有氨基、巯基等亲核基团的生物分子等通过共价作用将相应分子共价结合到本发明的药物载体上，对相应分子进行荧光标记。

主权利要求：
1.一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体，其特征在于，其结构式如式(1)所示：其化学名为：
2‑((E)‑2‑((E)‑2‑(4‑(4‑((2,5‑二氧吡咯‑1‑基)氧)‑4‑氧代丁酰基)哌嗪‑1‑基)‑3‑(2‑((E)‑1‑乙基‑3,3‑二甲基吲哚‑2‑叉)亚乙基)环己‑1‑烯‑1‑基)乙烯基)‑1‑乙基‑3,3‑二甲基‑3H‑吲哚‑1‑盐；
‑
X为化学上合理的任一有机酸根或无机酸根负离子。
2.一种如权利要求1所述的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，如式2所示：S1.将丁二酸酐溶于有机溶剂一中，加入哌嗪七甲川菁盐，在碱作用下反应得到中间体；
S2.将所述中间体溶于有机溶剂二中，加入N‑羟基琥珀酰亚胺，在缩合剂的作用下反应得到所述琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体；
S2所述N‑羟基琥珀酰亚胺与所述缩合剂的物质的量之比为1:(0.5～2)；
所述S2中所述缩合剂为1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N‑二异丙基碳二亚胺、N,N‑二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑‑1‑基‑氧基三吡咯烷基磷中的任意一种或几种的组合。
3.根据权利要求2所述的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的制备方法，其特征在于：所述S1中所述碱为碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、三乙胺、吡啶、4‑二甲氨基吡啶中的任意一种或几种的组合，所述S1中所述有机溶剂一为二氯甲烷、乙腈、氯仿、N,N‑二甲基甲酰胺中的任意一种或几种的组合；所述S2中所述有机溶剂二为二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N,N‑二甲基甲酰胺中的任意一种或几种的组合。
4.根据权利要求2所述的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：将所述丁二酸酐溶于所述有机溶剂一得到丁二酸酐溶液，将所述哌嗪七甲川菁盐滴加至所述丁二酸酐溶液中，再加入所述碱，调节反应温度为30～60℃，搅拌反应，反应完成后，纯化得到所述中间体；步骤S2包括：将所述中间体溶于所述有机溶剂二得到中间体溶液，向所述中间体溶液中加入所述N‑羟基琥珀酰亚胺及所述缩合剂，于温度
20～60℃反应，反应完全后，纯化得到所述琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体。
5.根据权利要求2所述的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的制备方法，其特征在于，所述S1中所述哌嗪七甲川菁盐与所述丁二酸酐的物质的量之比为1:(1～5)，所述哌嗪七甲川菁盐与所述碱的物质的量之比为1:(0.8～3)；所述S2中所述N‑羟基琥珀酰亚胺与所述中间体的物质的量之比为1:(0.1～1)。
6.根据权利要求1所述的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的中间体，其特征在于，所述中间体为丁二酰哌嗪七甲川菁盐，结构通式为：
7.一种如权利要求1所述的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的应用，其特征在于，将琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体应用于非疾病的诊断和治疗目的含有氨基的小分子、多肽、蛋白质的荧光标记、检测分析及显影示踪。
8.一种如权利要求1所述的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的应用，其特征在于，应用于非疾病的诊断和治疗目的，将琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体作为载体，用于与含有亲核基团的小分子、多肽、蛋白质制备共聚物。
9.一种应用权利要求1所述的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体制备共聚物的方法，其特征在于，应用于非疾病的诊断和治疗目的，包括以下步骤：将所述琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体溶于有机溶剂制成荧光载体储备液；将含有亲核基团的小分子、多肽、蛋白质溶于碳酸氢钠溶液得到待标记样品，再向待标记样品中加入所述荧光载体储备液，混合均匀，低温避光振荡反应12～24小时，提纯得到被所述荧光载体标记的共聚物。 说明书 : 一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体及其制备方
法和应用技术领域[0001] 本发明涉及药物载体领域，更具体地，涉及一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体及其制备方法和应用。背景技术[0002] 近红外生物荧光成像技术作为一种直观、可视化的观测技术受到越来越多的关注，近红外荧光染料的发射波长范围是700‑1100nm，在此波长范围内，荧光对生物组织的穿透力强；生物组织的自身荧光较弱，可避免背景荧光的干扰及提高检测灵敏度；同时能够减少对生物组织的损伤，所以适合用于活体成像。[0003] 近红外荧光染料主要包括花菁类、BODIPY(氟硼二吡咯甲川衍生物)类、罗丹明类、方酸类及卟啉类等。其中花菁类荧光染料的吸收波长基本在600‑800nm之间，具有摩尔消光系数高、荧光量子产率高以及光稳定性高等优点，已经成为当前备受关注的一类近红外荧光染料。当前花菁类荧光染料已应用在核酸染色或标记，氨基酸、肽和蛋白质的衍生或标记，红外激光染料、非线性光学材料、荧光探针及生物传感等方面。[0004] 目前唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床的花菁类染料是吲哚菁绿(IndocyanineGreen,ICG)，ICG在临床上用于检测心输出量和肝功能，肝血流量以及眼科血管造影。ICG的最大吸收波长为和最大发射波长在780nm、810nm左右，比大多数花菁类染料的波长更长，可穿透更深的组织。但是ICG存在稳定性较差、在极性溶剂中易分解、斯托克斯位移相对较小以及不能和其他分子结合的缺陷。[0005] 现有技术中公开过一种马来酰亚胺丙酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体，该荧光载体含有马来酰亚胺结构，可用于标记带有游离巯基的生物分子。然而对于其他类型的亲核基团，并未明确阐述并证实其被该荧光载体标记的可行性。[0006] 因此亟需设计一种新型近红外荧光染料以解决上述荧光载体存在稳定性较差、在极性溶剂中易分解、斯托克斯位移相对较小、或不能和多种亲核基团的分子结合的问题。发明内容[0007] 本发明为克服上述现有技术的ICG稳定性较差、在极性溶剂中易分解、斯托克斯位移相对较小、或不能和多种亲核基团的分子结合的缺陷，提供一种新型近红外荧光染料琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体。[0008] 本发明的另一目的在于提供一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的制备方法。[0009] 本发明的另一目的在于提供一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的应用。[0010] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：[0011] 一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体，其结构式如式(1)所示。[0012][0013] 其化学名为：[0014] 2‑((E)‑2‑((E)‑2‑(4‑(4‑((2,5‑二氧吡咯‑1‑基)氧)‑4‑氧代丁酰基)哌嗪‑1‑基)‑3‑(2‑((E)‑1‑乙基‑3,3‑二甲基吲哚‑2‑叉)亚乙基)环己‑1‑烯‑1‑基)乙烯基)‑1‑乙基‑3,3‑二甲基‑3H‑吲哚‑1‑盐。[0015] 优选地，X‑为化学上合理的任一有机酸根或无机酸根负离子。结构式中阳离子部‑分是决定分子荧光性质及结合特性的重要结构，X 为化学上合理的任一有机酸根或无机酸根负离子，不影响琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的荧光性质及结合特性。[0016] 优选地，X‑为碘离子。[0017] 一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的制备方法，包括以下步骤，如式2所示：[0018][0019] S1.将丁二酸酐溶于有机溶剂一中，加入哌嗪七甲川菁盐，在碱作用下反应得到中间体；[0020] S2.将中间体溶于有机溶剂二中，加入N‑羟基琥珀酰亚胺，在缩合剂的作用下反应得到琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体。[0021] 优选地，碱为有机碱或无机碱。[0022] 具体地，丁二酸酐的结构式为 哌嗪七甲川菁盐的结构式为中间体的结构式为 N‑羟基琥珀酰亚胺的结构式为[0023] 进一步具体地，中间体为丁二酰哌嗪七甲川菁盐。优选地，丁二酰哌嗪七甲川菁盐为丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物。[0024] 优选地，S1中碱为碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、三乙胺、吡啶、4‑二甲氨基吡啶中的任意一种或几种的组合。[0025] S1中有机溶剂一为二氯甲烷、乙腈、氯仿、N,N‑二甲基甲酰胺中的任意一种或几种的组合。[0026] S2中缩合剂为1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N‑二异丙基碳二亚胺、N,N‑二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑‑1‑基‑氧基三吡咯烷基磷中的任意一种或几种的组合。[0027] S2中有机溶剂二为二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N,N‑二甲基甲酰胺中的任意一种或几种的组合。[0028] 优选地，S1具体包括：将丁二酸酐溶于有机溶剂一得到丁二酸酐溶液，将哌嗪七甲川菁盐滴加至丁二酸酐溶液中，再加入碱，调节反应温度为30～60℃，搅拌反应，反应完成后，纯化得到中间体。[0029] 优选地，S2具体包括：将中间体溶于有机溶剂二得到中间体溶液，向中间体溶液中加入N‑羟基琥珀酰亚胺及缩合剂，于温度20～60℃反应，反应完全后，纯化得到琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体。[0030] 优选地，S1中哌嗪七甲川菁盐与丁二酸酐的物质的量之比为1:(1～5)，哌嗪七甲川菁盐与碱的物质的量之比为1:(0.8～3)。[0031] 进一步优选地，哌嗪七甲川菁盐、丁二酸酐与碱的物质的量之比为1:2:1.5。[0032] 优选地，S2中N‑羟基琥珀酰亚胺与中间体的物质的量之比为1:(0.1～1)，N‑羟基琥珀酰亚胺与缩合剂的物质的量之比为1:(0.5～2)。[0033] 进一步优选地，N‑羟基琥珀酰亚胺、中间体与缩合剂的物质的量之比为1:0.5:1.5。[0034] 一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的应用，具体为，将琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体应用于非疾病的诊断和治疗目的含有氨基的小分子、多肽、蛋白质及其他生物分子的荧光标记、检测分析及显影示踪。[0035] 一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的应用，具体为，将琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体作为载体，用于与含有亲核基团的小分子、多肽、蛋白质及其他生物分子制备共聚物。[0036] 优选地，亲核基团包括双键、三键、氰基、羟基、醚键、氨基和巯基中的任一种。[0037] 优选地，一种应用琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体制备共聚物的方法，包括以下步骤：[0038] 将琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体溶于有机溶剂制成荧光载体储备液；将含有亲核基团的小分子、多肽、蛋白质及其他生物分子溶于碳酸氢钠溶液得到待标记样品，再向待标记样品中加入荧光载体储备液，混合均匀，低温避光振荡反应12～24小时，提纯得到被荧光载体标记的共聚物。[0039] 优选地，含有亲核基团的小分子、多肽、蛋白质及其他生物分子包括牛血清白蛋白(BSA)、胃蛋白酶、胰岛素、免疫球蛋白。[0040] 与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：[0041] 1、本发明在近红外荧光花菁染料的基础上引入了N‑羟基琥珀酰亚胺结构得到的具有全新结构的药物载体，使得该药物载体可以有效地与含有氨基、巯基等亲核基团的有机小分子、多肽、蛋白质或其他生物分子等通过共价作用将相应分子共价结合到本发明药物载体上，对相应分子进行荧光标记，从而能够实现对有机小分子、多肽、蛋白质或其他生物分子的体外分析检测及体内显影示踪。[0042] 2、本发明提供的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体结构较为稳定，在激发波长为690nm时，其最大发射波长为780nm，斯托克斯位移是90nm，具有显著的斯托克斯位移，可以有效降低背景荧光的干扰，极大地提高检测灵敏度，为有机小分子、多肽、蛋白质或其他生物分子的分析检测提供高效、实用的工具。附图说明[0043] 图1为琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物的核磁图谱；[0044] 图2为琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物的高分辨质谱图；[0045] 图3为琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物的吸收光谱；[0046] 图4为琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物的荧光发射光谱；[0047] 图5为Cy7‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯的吸收和发射波长光谱；[0048] 图6为琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物与牛血清白蛋白结合后的紫外吸收图谱；[0049] 图7为琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物与牛血清白蛋白结合后的荧光发射光谱。具体实施方式[0050] 为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例的附图，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。[0051] 下面结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。[0052] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。[0053] 实施例1[0054] 一种琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体，其合成路线为：[0055][0056] 其中，X‑为碘离子。[0057] 具体制备步骤为:[0058] S1：将丁二酸酐(88mg，2.0eq)加至圆底烧瓶中，溶于5mL的二氯甲烷，将哌嗪七甲川菁碘化物(300mg,1.0eq)溶于5mL的二氯甲烷后滴加至反应体系，再滴加吡啶(53uL，1.5eq)，升温至40℃反应12～24小时，经TLC(薄层色谱，ThinLayerChromatography)检测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，用二氯甲烷/甲醇体系作为流动相硅胶柱层析提纯，得到中间体。[0059] S2:将中间体(500mg,1eq)溶于10mL干燥的二氯甲烷，加入N‑羟基琥珀酰亚胺(147mg,2.0eq)、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(365mg,3eq)，室温反应12～24小时，TLC检测反应基本完全后，向反应液中加入大量二氯甲烷，水洗5次后旋干，此时发现除去大部分残余的原料，用二氯甲烷/正己烷重结晶，得到琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体。[0060] 实施例2～6[0061] 实施例2～6中的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的制备方法中的步骤与实施例1相同，不同之处在于以下工艺条件。具体的工艺条件见表1，制备得到的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体进行相关的荧光标记测试。[0062] 表1[0063][0064][0065] 对比例1～3[0066] 对比例1～3中的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体的制备方法中的步骤与实施例1相同，不同之处在于以下工艺条件。具体的工艺条件见表2，制备得到的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体进行相关的荧光标记测试。[0067] 表2[0068][0069] 对比例4[0070] 将现有技术中的同类型分子与本申请制备的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体进行比较，如图5所示，同类型分子Cy7‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：2408482‑09‑5)的吸收和发射波长分别为750nm和773nm，斯托克斯位移是23nm(数据来源：LumiprobeCorporation官网)。[0071] 本发明制得的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体通过以下方法进行结果表征和荧光标记测试。[0072] (1)结果表征[0073] 1)产物的生成量和产率的比较[0074] 如图1～2所示，实施例1～6和对比例1～3所得中间体产物经质谱确证MS‑ESI:+ 1(C42H53N4O3Calc661.911Found661.55)，H‑NMR(400MHz，DMSO)δ7.72(d,J＝13.48Hz,2H),7.52(d,J＝7.36Hz,2H),7.36(t,J＝7.48Hz,2H),7.27(d,J＝7.88Hz,2H),7.16(t,J＝7.4Hz,2H),6.01(d,J＝13.6Hz,2H),4.11(dd,J＝13.72,6.72Hz,4H),3.77(s,4H),3.64(s,2H),3.58(s,2H),2.54‑2.50(m,4H),2.42(s,4H),1.80‑1.76(m,2H),1.62(s,12H),1.26(t,J＝7.0Hz,6H)。[0075] 实施例1～6和对比例1～2所得最终产物经质谱确证(HRMS:C46H56N5O5+1Calc758.4276Found758.4278)，H‑NMR(400MHz，CDCl3)δ7.76(d,J＝13.12Hz,2H),7.35(d,J＝9.12Hz,4H),7.19(t,J＝7.4Hz,2H),7.03(d,J＝7.88Hz,2H),5.94(d,J＝13.08Hz,2H),4.07(d,J＝7.0Hz,4H),3.91(s,4H),3.78(s,2H),3.62(s,2H),3.09‑2.98(m,6H),2.69(s,2H),2.56(s,4H),1.90‑1.87(m,2H),1.69(s,12H),1.43(t,J＝7.0Hz,6H)。对比例3未成功得到最终产物。[0076] 实施例1～6和对比例1～3所得中间体产物和最终产物的质量和产率具体分别见表3～4。[0077] 表3[0078][0079][0080] 表4[0081][0082] 分析说明：[0083] 如表3所示，实施例1～6最终都成功生成最终产物，不同的工艺条件下，其产率分布在32％～90％区间内；其中实施例1为最优实施例，其产率可达到90％。[0084] 如表4所示，在对比例中，对比例1～2以S2中缩合剂的用量作为自变量，实施例1中的N‑羟基琥珀酰亚胺与缩合剂的物质的量之比为1:1.5，对比例1中的N‑羟基琥珀酰亚胺与缩合剂的物质的量之比为1:0.2，对比例2中的N‑羟基琥珀酰亚胺与缩合剂的物质的量之比为1:4；与实施例1相比，对比例1中最终的产物的产率仅为10％，对比例2中最终的产物的产率仅为18％。[0085] 可见，在该制备方法中，缩合剂的物质的量对产物的产率影响较大，缩合剂用量过少时，其与反应物的反应不够完全，则反应产物的产率较低；缩合剂用量过多时，副反应增多，反而导致产率降低。因此，将缩合剂的用量控制在：S2中N‑羟基琥珀酰亚胺与缩合剂的物质的量之比为1:(0.5～2)范围内时，最终产物的产率较为可观。[0086] 对比例3中以S2中缩合剂的种类作为自变量，选用1‑羟基苯并三唑作为缩合剂时，在室温下反应12～24小时，TLC检测反应，发现没有新产物生成，延长反应时间至48h仍没有新产物生成，表明采用1‑羟基苯并三唑时不能得到目标产物。因此，该制备方法中采用实施例1～6中的1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N‑二异丙基碳二亚胺、N,N‑二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑‑1‑基‑氧基三吡咯烷基磷中的任意一种或几种的组合，最终方可成功生成目标产物。[0087] 2)琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物的荧光吸收与发射光谱[0088] 由于本发明所指琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐的阴离子部分对载体的荧光性质没有本质影响，本实例主要是以琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物(代号CY‑NHS，其中CY表示花菁类染料，Cyanine；NHS表示N‑羟基琥珀酰亚胺，N‑hydroxysuccinimide)为代表。[0089] a.琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物的吸收光谱[0090] 将实施例1中制备得到的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物溶于二甲基亚砜，制成20mmol/L的储备液，稀释成5μmol/L，扫描其紫外吸收图谱，如图3所示。由图可知琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物的最大吸收波长是690nm，在756nm处有一肩峰，呈现明显的双吸收，其在近红外区的宽吸收峰意味着能够选取最合适的激发波长。[0091] b.琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物的荧光发射光谱[0092] 将a中琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物的储备液稀释成5μmol/L，用于扫描荧光光谱。设置激发波长690nm，检测波长为730‑900nm，测得荧光光谱如图4所示。由图可知在激发波长为690nm时，其最大发射波长为780nm，斯托克斯位移是90nm，具有较大的斯托克斯位移，而如图5所示，对比例4中的同类型分子Cy7‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：2408482‑09‑5)，其吸收和发射波长分别为750nm和773nm，其斯托克斯位移是23nm，远小于CY‑NHS的斯托克斯位移，说明与Cy7‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯相比，CY‑NHS可以更有效地降低背景荧光的干扰，极大地提高检测灵敏度。[0093] (2)荧光标记测试[0094] 由于本发明所指琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐的阴离子部分对载体的荧光性质没有本质影响，本实例主要是以琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物(代号CY‑NHS)为代表。[0095] 本测试方案选取含有游离氨基的牛血清白蛋白(BSA)作为亲核分子，共价结合到琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物上。琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物可以和目标生物分子上的胺基(伯胺或者仲胺)反应生成稳定的酰胺键，由于游离胺基是蛋白、抗体、多肽表面的常见官能团(来自于赖胺酸侧链)，因此琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物可以直接与它们发生反应。本实验通过实验进一步论证琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁盐荧光载体可高效地与含亲核基团的分子进行有效的共价连接，以进行荧光标记。[0096] 具体操作为：[0097] 测试一：将实施例1中制备得到的琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物溶于二甲基亚砜，制成20mmol/L的储备液；称取BSA蛋白(3mg，1eq)溶于0.1mol/LNaHCO3溶液，再加入CY‑NHS的储备液(18uL,8eq)，混合均匀后置于摇床上，4℃避光反应过夜，观察实验现象。反应完成后用G‑50葡聚糖凝胶柱纯化，得到标记结论1。[0098] 测试二和测试三中的测试实验步骤与测试一中相同，不同之处在于蛋白质的反应溶剂，具体条件及结论如表5。[0099] 表5[0100][0101] 如表5所示，在荧光标记测试中，当将BSA蛋白溶于PBS(磷酸钠)缓冲溶液，再加入琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物进行荧光标记时，琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物发生水解反应，证明其在该缓冲溶液中的稳定性受到影响，未能成功标记BSA蛋白；当将BSA蛋白溶于Tris缓冲溶液，再加入琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物进行荧光标记时，由于Tris缓冲溶液中含有胺基，因此琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物直接与Tris缓冲溶液发生反应，未能成功标记BSA蛋白。仅当使用NaHCO3溶液作为与BSA蛋白的反应溶剂时，BSA蛋白最终被标记成功。[0102] 为了进一步验证BSA蛋白与琥珀酰亚胺丁二酰哌嗪七甲川菁碘化物发生共价结合反应，对纯化后的CY‑NHS标记的BSA蛋白进行紫外吸收和荧光发射测试，结果图谱如图6和图7所示。由图6可知，BSA蛋白本身在600～900nm的波长范围内没有吸收，而被CY‑NHS标记的BSA蛋白在此区域内有类似CY‑NHS的吸收，说明CY‑NHS成功的与BSA蛋白发生共价结合反应；由图7可知，BSA蛋白本身在700～900nm波长内没有荧光，而被CY‑NHS标记的BSA蛋白在此区域内有类似CY‑NHS的荧光发射，也说明CY‑NHS成功的与BSA蛋白发生共价结合反应。[0103] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

专利地区：广东

专利申请日期：2022-06-07

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN115043818B