L-脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的新用途

专利名称：L-脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的新用途

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410446501.6

专利申请（专利权）人：哈尔滨医科大学
权利人地址：黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路157号

专利发明（设计）人：刘大斌,周云飞,孟宏学

专利摘要：本发明涉及L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的新用途，属于医药技术领域。为解决现阶段缺少治疗NAFLD的有效临床手段的问题，本发明提供了L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的新用途。本发明证实了L‑脯氨酸能够通过靶向激活脂肪细胞角鲨烯环氧化酶SQLE抑制非酒精性脂肪肝病NAFLD的发展；口服L‑脯氨酸能够激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶SQLE的表达来降低饮食诱导的肥胖，降低白色脂肪重量及缓解高脂饮食诱导的NAFLD疾病；口服L‑脯氨酸能够激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶SQLE的表达来降低血液中神经酰胺Cer18:1/18:1的浓度，缓解NAFLD的进展。

主权利要求：
1.L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，其特征在于，所述防治非酒精性脂肪肝病是通过激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶的表达来抑制非酒精性脂肪肝病的进展。
3.根据权利要求1所述L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，其特征在于，所述防治非酒精性脂肪肝病是通过激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶的表达来降低饮食诱导的肥胖，降低白色脂肪重量及缓解高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝病疾病。
4.根据权利要求1所述L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，其特征在于，所述防治非酒精性脂肪肝病是通过激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶的表达来降低血液中神经酰胺Cer18:1/18:1的浓度，缓解非酒精性脂肪肝病的进展。
5.根据权利要求1‑4任一所述L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，其特征在于，所述防治非酒精性脂肪肝病药物中，L‑脯氨酸是唯一活性成分。
6.根据权利要求5所述L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，其特征在于，所述防治非酒精性脂肪肝病药物包括L‑脯氨酸和药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，其特征在于，所述防治非酒精性脂肪肝病药物中L‑脯氨酸的含量为0.1 99wt%。
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8.根据权利要求7所述L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，其特征在于，所述防治非酒精性脂肪肝病药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或口服液体制剂。
9.根据权利要求8所述L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，其特征在于，所述防治非酒精性脂肪肝病药物通过口服方式给药，每天口服L‑脯氨酸250mg/kg体重。 说明书 : L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的新用途技术领域[0001] 本发明属于医药技术领域，尤其涉及L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的新用途。背景技术[0002] 非酒精性脂肪肝病（Non‑alcohlicfattyliverdisease，NAFLD）和代谢紊乱综合征互为因果，又被称为代谢相关脂肪肝病，临床上与糖尿病和动脉粥样硬化性心血管疾病等代谢性疾病关系密切。非酒精性脂肪肝病同时也是肝癌发生的重要诱因，肥胖相关的单纯性脂肪肝（Steatosis）可不经过肝炎阶段，直接发展成肝癌，且免疫疗法对于非酒精性脂肪肝病诱发的肝癌患者疗效甚微。[0003] 脂肪组织作为机体重要的胆固醇储存器官，其在代谢性脂肪肝病发生发展过程中的作用正越来越被科研人员重视。国内外多项研究证实肥胖状态下脂肪细胞来源的细胞因子和脂肪酸可影响机体代谢稳态，并通过脂肪组织‑肝组织轴影响代谢性相关脂肪肝病的发生发展。但靶向脂肪细胞治疗代谢性相关脂肪肝病仅仅处于概念阶段，尚无相关药物或者治疗策略进入临床试验阶段。[0004] 针对非酒精性脂肪肝病新型治疗靶标的发现和治疗模式的发展是一个未得到满足的临床需求。发明内容[0005] 为解决现阶段缺少治疗非酒精性脂肪肝病的有效临床手段的问题，本发明提供了L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的新用途。[0006] 本发明的技术方案：[0007] L‑脯氨酸在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。[0008] 进一步的，所述防治非酒精性脂肪肝病是通过激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶的表达来抑制非酒精性脂肪肝病的进展。[0009] 进一步的，所述防治非酒精性脂肪肝病是通过激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶的表达来降低饮食诱导的肥胖，降低白色脂肪重量及缓解高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝病疾病。[0010] 进一步的，所述防治非酒精性脂肪肝病是通过激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶的表达来降低血液中神经酰胺Cer18:1/18:1的浓度，缓解非酒精性脂肪肝病的进展。[0011] 进一步的，所述防治非酒精性脂肪肝病药物中，L‑脯氨酸是唯一活性成分。[0012] 进一步的，所述防治非酒精性脂肪肝病药物包括L‑脯氨酸和药学上可接受的载体。[0013] 进一步的，所述防治非酒精性脂肪肝病药物中L‑脯氨酸的含量为0.1 99wt%。~[0014] 进一步的，所述防治非酒精性脂肪肝病药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或口服液体制剂。[0015] 进一步的，所述防治非酒精性脂肪肝病药物通过口服方式给药，每天口服L‑脯氨酸250mg/kg体重。[0016] 本发明的有益效果：[0017] 本发明在两种饮食诱导的非酒精性脂肪肝病动物模型中，通过饮水补充L‑脯氨酸，证实L‑脯氨酸能够通过靶向激活脂肪细胞角鲨烯环氧化酶（SQLE）抑制非酒精性脂肪肝病的发展。本发明证实口服L‑脯氨酸能够激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶的表达来降低饮食诱导的肥胖，降低白色脂肪重量及缓解高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝病疾病；口服L‑脯氨酸能够激活脂肪细胞中角鲨烯环氧化酶的表达来降低血液中神经酰胺Cer18:1/18:1的浓度，缓解非酒精性脂肪肝病的进展。本发明同时利用肝细胞特异性SQLE敲除小鼠证实了靶向激活脂肪细胞SQLE的同时抑制肝脏细胞SQLE是一种安全性更高的有效可行的治疗代谢性相关脂肪肝病的策略。附图说明[0018] 图1为实施例1中NAFLD模型小鼠高脂肪高胆固醇饮食饲喂方法示意图；[0019] 图2为实施例1中两组小鼠的体重增加率对比图；[0020] 图3由左至右依次为实施例1中两组小鼠的肝脏重量、血液谷草转氨酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定结果对比图；[0021] 图4为实施例1中两组小鼠的胰岛素耐受测试实验结果图；[0022] 图5为实施例1中两组小鼠的苏木精—伊红染色（HE）和油红染色结果对比照片；[0023] 图6为实施例1中两组小鼠血液中神经酰胺含量的对比图；[0024] 图7为实施例1中两组小鼠白色脂肪组织（eWAT）MARCH6基因mRNA表达水平对比图；[0025] 图8为实施例1中两组小鼠白色脂肪组织（eWAT）SQLE及其下游HIF2α/ACER2基因蛋白表达水平对比图；[0026] 图9为实施例1中两组小鼠3T3L1细胞和LO2细胞中SQLE蛋白表达水平的对比图；[0027] 图10为实施例2中NAFLD模型小鼠蛋氨酸胆碱缺乏高脂饮食饲喂方法示意图；[0028] 图11为实施例2中两组小鼠的HE染色结果对比照片；[0029] 图12为实施例3中野生小鼠和Sqleko/Alb‑Cre小鼠高脂肪高胆固醇饮食饲喂方法示意图；[0030] 图13为实施例3中三组小鼠的HE和油红染色结果对比照片；[0031] 图14由左至右依次为实施例3中三组小鼠的体重增长率、肝脏/体重比、血清ALT、血清胆固醇和血清甘油三酯（TG）的对比图。具体实施方式[0032] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0033] 本发明动物实验所用材料和方法具体如下：[0034] A.人血液标本[0035] 人血液样本由蚌埠医学院第一附属医院李冬冬医生团队馈赠。获得所有受试者的书面知情同意书，研究方案经蚌埠医学院第一附属医院科学临床研究伦理委员会批准。[0036] 正常与肥胖人群的腹部白色脂肪组织由哈尔滨医科大学附属肿瘤医院孟宏学教授收集。获得所有受试者的书面知情同意书，研究方案经哈尔滨医科大学附属肿瘤医院科学临床研究伦理委员会批准。[0037] B.转基因小鼠模型[0038] NAFLD小鼠模型：[0039] 喂食6周龄野生型小鼠（WT）高脂肪高胆固醇饮食。8周龄时，将小鼠随机分成两组，并用水或L‑脯氨酸（用水配置为300ppm浓度，每2天更换一次饮水）治疗。L‑脯氨酸治疗12周后，处死小鼠以检查L‑脯氨酸的治疗效果。[0040] 喂食8周龄野生型小鼠（WT）蛋氨酸胆碱缺乏高脂饮食（MCD）。9周龄时，将小鼠随机分成两组，并用水或L‑脯氨酸（用水配置为300ppm浓度，每2天更换一次饮水）治疗。L‑脯氨酸治疗4周后，处死小鼠以检查L‑脯氨酸的治疗效果。[0041] 喂食6周龄Sqleko/Alb‑Cre小鼠及其野生型同窝小鼠（WT）高脂肪高胆固醇饮食。12周龄时，将Sqleko/Alb‑Cre小鼠随机分成两组，并用水或L‑脯氨酸（用水配置为300ppm浓度，每2天更换一次饮水）治疗。L‑脯氨酸治疗12周后，处死小鼠以检查L‑脯氨酸的治疗效果。[0042] NAFLD的评估：使用HE染色在处死时评估肝组织学。[0043] 炎症评估：使用血清ALT和AST测定肝损伤。[0044] 代谢综合征的评估：油红染色（oilredo）以及胰岛素耐量试验和葡萄糖耐量试验。[0045] 肝细胞特异性Sqle敲除小鼠模型：[0046] Sqle敲除小鼠由BIOCYTOGEN公司(中国北京)基于CRISPR/Cas9技术构建。[0047] 为了驱动Sqle的肝细胞特异性敲除，Sqleko小鼠与B6.CgTg(Alb‑cre)21Mgn/JNju小鼠(中国南京大学)杂交。通过PCR基因分型验证Sqleko/Alb‑Cre小鼠。[0048] WT和Sqle相关的转基因小鼠在不同的时间点自由摄取高脂肪高胆固醇（HFHC:27.4%脂肪，40.1%碳水化合物，24.2%蛋白质，2%胆固醇)饮食（BiotechHDCo.,Ltd.Beijing,China)，形成饮食诱导的NAFLD模型。[0049] 所有动物研究均根据哈尔滨医科大学附属第四医院动物实验伦理委员会批准的指南进行。[0050] 肝脏胆固醇水平检测方法：收获2mg组织，并通过胆固醇/胆固醇酯定量试剂盒（ab65359，Abcam）按照制造商的说明检测肝脏胆固醇水平。所有实验一式三份进行三次。结果显示未平均值±SEM。[0051] 肝脏甘油三酯（TG）水平：收获100mg组织，并通过甘油三酯定量试剂盒（ab65336，Abcam）按照制造商的说明检测肝脏甘油三酯水平。所有实验一式三份进行三次。结果显示未平均值±SEM。[0052] C.生物功能分析[0053] 血清胆固醇、TG、ALT和AST检测[0054] 取5μL血液样本，利用ELISA试剂盒检测血清胆固醇、TG、ALT和AST水平。其中胆固醇水平使用胆固醇/胆固醇酯定量试剂盒（ab65359，Abcam）检测。甘油三酯（TG）水平使用甘油三酯定量试剂盒（ab65336，Abcam）检测。ALT和AST水平分别使用谷丙转氨酶活性检测试剂盒（BC155，中国索莱宝）和谷草转氨酶活性检测试剂盒（BC1565，中国索莱宝）检测。[0055] 胰岛素耐量测试（ITT）和葡萄糖耐量测试（GTT）[0056] 对于葡萄糖耐量试验，将小鼠转移到笼子上部或底部没有食物或粪便的清洁笼子中使小鼠禁食过夜。然后向小鼠腹膜内注射0.75U胰岛素/kg体重（ITT）或1g葡萄糖/kg体重（GTT）的水溶液。在注射前和注射后30、60和90分钟获得来自尾静脉的血液，使用葡萄糖计测定血糖。[0057] D.统计分析[0058] 使用SPSS或GraphPad软件进行所有统计学检验。数据表示为平均值±SEM。通过单变量ANOVA分析多组比较。进行Mann‑WhitneyU检验或学生t检验以比较两组的变量。P值<0.05为统计学显著。[0059] 实施例1[0060] 本实施例通过动物实验证实口服L‑脯氨酸能够激活脂肪细胞SQLE表达并缓解NAFLD进程。[0061] 在高脂肪高胆固醇饮食诱导的肥胖相关NAFLD模型中，以水或L‑脯氨酸饲喂野生小鼠，饲喂方法如图1所示。[0062] 图2为实施例1中两组小鼠的体重增加率对比图，图3由左至右依次为实施例1中两组小鼠的肝脏重量、血液AST和ALT测定结果对比图，图4为实施例1中两组小鼠的胰岛素耐受测试实验结果图；图中显示，口服L‑脯氨酸能够显著降低小鼠的体重增加率和肝脏重量，能够显著缓解胰岛素耐受，提示L‑脯氨酸可能缓解高脂饮食诱导的NAFLD。[0063] 图5为实施例1中两组小鼠的HE和油红染色结果对比照片；图中显示，在高脂肪高胆固醇饮食饲料条件下，对照组可以形成NAFLD疾病，病理表现为典型的肝脏脂肪变性水平超过10%（HE）和过量的脂肪堆积（油红染色）。而口服L‑脯氨酸可以显著降低肝脏脂肪变性水平（低于5%，HE染色）和脂肪堆积程度（油红染色），证实L‑脯氨酸可以有效缓解该类型的NAFLD疾病进展。[0064] 图6为实施例1中两组小鼠血液中神经酰胺含量的对比图，图7为实施例1中两组小鼠白色脂肪eWAT组织MARCH6基因mRNA表达水平对比图，图8为实施例1中两组小鼠白色脂肪eWAT组织SQLE及其下游HIF2α/ACER2基因蛋白表达水平对比图；实验证实口服L‑脯氨酸能够降低血液中神经酰胺Cer18:1/18:1的含量，抑制白色脂肪eWAT组织中MARCH6基因mRNA表达水平，升高SQLE及其下游HIF2α/ACER2基因蛋白表达水平，但对脂肪组织SQLEmRNA表达和肝脏SQLE蛋白表达水平无明显影响。[0065] 图9为实施例1中两组小鼠3T3L1细胞和LO2细胞中SQLE蛋白表达水平的对比图，图中显示，口服L‑脯氨酸能够显著降低3T3L1细胞中SQLE蛋白表达水平，但对LO2细胞SQLE蛋白表达水平的表达无明显影响。这提示L‑脯氨酸可能是干扰了脂肪细胞SQLE的功能，缓解了NAFLD进程。[0066] 综上证实，口服L‑脯氨酸能够激活脂肪细胞SQLE的表达，降低血液神经酰胺（Cer18:1/18:1）水平并缓解NAFLD进程，由此提示，靶向激活脂肪细胞中SQLE的表达是NAFLD治疗的新策略。[0067] 实施例2[0068] 在蛋氨酸胆碱缺乏高脂饮食诱导的瘦型NAFLD模型中，以水或L‑脯氨酸饲喂野生小鼠，饲喂方法如图10所示。[0069] 图11为实施例2中两组小鼠的HE染色结果对比照片；图中显示，在蛋氨酸胆碱缺乏高脂饮食饲料条件下，对照组可以形成NAFLD疾病，病理表现为严重的脂肪变性程度。而口服L‑脯氨酸可以显著降低肝脏脂肪变性水平，证实L‑脯氨酸可以有效缓解该类型高脂饮食诱导的NAFLD疾病进展。[0070] 实施例3[0071] 本实施例通过肝细胞特异性Sqle敲除小鼠模型实验证实口服L‑脯氨酸的同时抑制肝脏细胞SQLE的表达能够抑制NAFLD进展，降低血液ALT和胆固醇水平。[0072] 在高脂肪高胆固醇饮食诱导的小鼠模型中，以水饲喂野生小鼠，以水或L‑脯氨酸饲喂肝细胞特异性Sqle敲除Sqleko/Alb‑Cre小鼠，饲喂方法如图12所示。[0073] 图13为实施例3中三组小鼠的HE和油红染色结果对比照片；在高脂肪高胆固醇饮食饲料条件下，WT对照小鼠组（水）可以形成NAFLD疾病，病理表现为典型的重度肝脏脂肪变性水平（超过60%，HE染色）和过量的脂肪堆积（油红染色）。与WT对照小鼠相比，单纯特异性敲除肝脏SQLE（Sqleko/Alb‑Cre）可以显著降低肝脏脂肪变性水平（5‑10%，HE染色）和脂肪堆积程度（油红染色），使重度NAFLD恢复成轻度或者中度偏轻的NAFLD疾病水平。而敲除肝脏SQLE的同时辅以口服L‑脯氨酸可以进一步降低肝脏脂肪变性水平（0‑5%，HE染色）和脂肪堆积程度（油红染色）。证实口服L‑脯氨酸的同时精准靶向肝脏SQLE是一种更有效的NAFLD疾病治疗手段。[0074] 图14由左至右依次为实施例3中三组小鼠的体重增长率、肝脏/体重比、血清ALT、血清胆固醇和血清TG的对比图；图中显示，与野生型小鼠对照相比，口服L‑脯氨酸的同时抑制肝细胞SQLE的表达可显著缓解NAFLD疾病的发展，同时显著降低血液ALT和胆固醇水平。与单独饮食补充L‑脯氨酸（图3）相比，该联合治疗方案具有更好的疗效和安全性。

专利地区：黑龙江

专利申请日期：2024-04-15

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN118045083B