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抗H1N1流感病毒双特异性中和抗体Bis-Hu11-1及其应用

更新时间:2024-07-04
抗H1N1流感病毒双特异性中和抗体Bis-Hu11-1及其应用 专利申请类型:发明专利;
地区:浙江-杭州;
源自:杭州高价值专利检索信息库;

专利名称:抗H1N1流感病毒双特异性中和抗体Bis-Hu11-1及其应用

专利类型:发明专利

专利申请号:CN202210600393.4

专利申请(专利权)人:浙江大学医学院附属第一医院
权利人地址:浙江省杭州市上城区庆春路79号

专利发明(设计)人:吴海波,杨帆,吴南屏,姚航平

专利摘要:本发明公开了一种用于抗H1N1流感病毒的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1及其应用,属基因工程抗体技术领域。本发明以靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2的抗体ZJU11‑01和靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb的抗体ZCMU‑H1N1为亲本抗体,依据CrossMab平台利用基因工程技术将双特异性IgG抗体Fab臂功能域(CH1‑CL)的交换,哺乳动物真核表达体系表达Bis‑Hu11‑1。本发明还提供表达和纯化双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的方法,通过CHO‑S细胞分泌表达,亲和层析纯化获得目的蛋白。此双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1能够特异性同时结合于H1N1流感病毒血凝素蛋白的抗原位点Ca2和Sb,通过中和作用抑制H1N1流感病毒。本发明为H1N1亚型季节性流感病毒感染的预防和治疗提供了有效的工具,并可推广用于与其他药物联合应用以及其他研究。

主权利要求:
1.一种抗H1N1流感病毒的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1,其特征在于,该双特异性中和抗体包括抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2与抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb两个亲本全长抗体的可变区序列;所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2亲本抗体ZJU11‑01的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2亲本抗体ZJU11‑01的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示;所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示,所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。
2.权利要求1所述的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的制备方法,通过以下步骤和技术方案实现:
(1)采用分子生物学方法构建双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1:将ZJU11‑01、ZCMU‑H1N1的轻重链可变区氨基酸序列与人IgG1抗体轻重链可变区恒定区氨基酸序列拼接构建获得双特异性抗体的四条重、轻链可变区序列,同时进行克隆重组,构建双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1重组载体;将目的质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂板,挑取阳性单克隆进行测序比对,选取测序结果正确的大肠杆菌DH5α进行扩增并保存;
(2)将四种目的质粒共转染CHO‑S细胞进行表达,低温离心取培养上清,利用ProteinA亲和纯化法分离纯化上清中的抗体,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物表达及装配是否正确;
(3)得到一株抗H1N1流感病毒双特异性中和抗体,即Bis‑Hu11‑1,并通过ELISA实验分析抗体与抗原的亲和能力,体外中和实验分析抗体在细胞水平的抗病毒能力,同时在小鼠体内检验抗体的预防和治疗效果。
3.编码权利要求1所述的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的核酸分子,其特征在于,所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2亲本抗体ZJU11‑01的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示,所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2亲本抗体ZJU11‑01的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示,所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。
4.一种表达载体,其特征在于,所述的表达载体来源于真核表达载体pcDNA3.4,包含权利要求3所述的核酸分子,可转染真核细胞CHO‑S并表达蛋白。
5.权利要求1所述的抗H1N1流感病毒的双特异中和抗体Bis‑Hu11‑1在制备预防H1N1季节性流感病毒药物中的应用。
6.权利要求1所述的抗H1N1流感病毒的双特异中和抗体Bis‑Hu11‑1在制备治疗H1N1季节性流感病毒药物中的应用。 说明书 : 抗H1N1流感病毒双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1及其应用技术领域[0001] 本发明属于基因工程抗体技术领域,具体涉及一种新型的、可以同时靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb和Ca2的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑抗H1N1流感病毒双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1及其应用。其可用于制备治疗或预防甲型H1N1流感病毒感染的药物。背景技术[0002] 季节性流感病毒流行仍然是全球共同关注的公共卫生问题。大多数人对甲型H1N1流感病毒没有免疫力,因此当季节性疫苗与当年的流行毒株不匹配时则可能导致疫苗无效和大流行的发生。至今,H1N1仍在世界范围内引起死亡病例的增加。其早期症状与普通流感相似,易被轻视,但病情可迅速进展,突然高热、肺炎,重者可以出现呼吸衰竭、多器官损伤,甚至死亡,病死率可达6%。[0003] 目前临床治疗流感的抗病毒药物主要为奥司他韦和金刚烷胺,但是已有研究显示甲型H1N1流感病毒对金刚烷胺的耐药率已超过90%。另外在临床研究中发现流感病毒在药物暴露期间会出现耐药突变,导致对奥司他韦出现耐药。由于耐药率增加、治疗时间窗(必须在症状出现后48小时内用药)受限,寻求一种新的针对流感的预防和治疗干预措施迫在眉睫。单克隆抗体因其具有高度的特异性、有限的脱靶效应和良好的安全性而得到广泛的应用。与单克隆抗体相比,双特异性抗体增加了一个特异性抗原结合位点,具有更强的特异性、更准确的靶向性和更低的脱靶毒性。[0004] 基于以上背景,本发明依据CrossMab平台设计了一种同时靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2和Sb的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1,利用双特异性中和抗体其中一端ZJU11‑01能够识别H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2,同时另一端ZCMU‑H1N1能够识别H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb,通过病毒中和作用抑制病毒进入细胞,同时避免H1N1流感病毒在治疗中的发生免疫逃逸,增强抗病毒作用。双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1可以与两种不同的表面抗原结合,增加结合特异性,并降低脱靶等引起的副作用,为H1N1流感的预防与治疗提供了新的启发和思路。发明内容[0005] 本发明的目的是提供一种具有预防和治疗H1N1流感病毒感染的能够同时特异性地靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb和Ca2的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1。该双特异性中和抗体包括抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2与抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb两个亲本全长抗体的可变区序列;所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2亲本抗体ZJU11‑01的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2亲本抗体ZJU11‑01的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示;所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示,所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。[0006] 编码所述的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的核酸分子,所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2亲本抗体ZJU11‑01的重链的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示,所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2亲本抗体ZJU11‑01的轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的重链的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示,所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。[0007] 序列如下:[0008] SEQIDNO.1[0009] Heavychain:Aminoacidsequence(124AA)[0010] Signalpeptide‑FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTPSGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIAPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCADGFYYYNTNYRDYFDHWGQGTTLTVSS[0011] SEQIDNO.2[0012] Heavychain:DNAsequence(372bp)[0013] Signalsequence‑FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACACCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGCTCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTGACGGATTCTATTACTACAATACTAACTACAGAGACTACTTTGACCACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA[0014] SEQIDNO.3[0015] Lightchain:Aminoacidsequence(111AA)[0016] Signalpeptide‑FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4ENVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVLYDGDNYMNWYQQKPGQSPKLLIYAASNLQSGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK[0017] SEQIDNO.4[0018] Lightchain:DNAsequence(333bp)[0019] Signalsequence‑FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4GAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCCTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTCTTTATGATGGTGATAATTACATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGTCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTACAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA[0020] SEQIDNo.5[0021] Heavychain:Aminoacidsequence(120AA)[0022] Signalpeptide‑FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTYTGEPTYDDHFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCAREDNYAPSWFTHWGQGTLVTVSA[0023] SEQIDNo.6[0024] Heavychain:DNAsequence(360bp)[0025] Signalsequence‑FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACAAATTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAGGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGATGATCATTTTAAGGGACGATTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACATGGCTACATATTTCTGTGCAAGGGAGGATAATTACGCCCCTTCCTGGTTTACTCACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA[0026] SEQIDNo.7[0027] Lightchain:Aminoacidsequence(108AA)[0028] Signalpeptide‑FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4QIVLSQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQRPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGHSIPYTFGGGTKLEIK[0029] SEQIDNo.8[0030] Lightchain:DNAsequence(324bp)[0031] Signalsequence‑FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAGGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTCATAGTATACCATACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA[0032] 本发明的第二个目的提供双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的制备方法,通过以下步骤和技术方案实现:[0033] (1)通过杂交瘤技术筛选得到靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2的鼠源单克隆抗体ZJU11‑01和靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb的鼠源单克隆抗体ZCMU‑H1N1。[0034] (2)对鼠源单克隆抗体ZJU11‑01和ZCMU‑H1N1的重、轻链可变区基因进行测序。[0035] (3)采用分子生物学方法构建双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1:将ZJU11‑01、ZCMU‑H1N1的轻重链可变区氨基酸序列与人IgG1抗体轻重链恒定区氨基酸序列拼接构建获得双特异性抗体的四条重、轻链序列,同时进行克隆重组,构建双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1重组载体。将目的质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂板,挑取阳性单克隆进行测序比对,选取测序结果正确的保菌进行扩增并保存。[0036] (4)将四种目的质粒共转染CHO‑S细胞进行表达,低温离心取培养上清,利用ProteinA亲和纯化法分离纯化上清中的抗体,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物表达及装配是否正确。[0037] (5)本发明得到一株抗H1N1流感病毒双特异性中和抗体,即Bis‑Hu11‑1,并通过ELISA实验分析抗体与抗原的亲和能力,体外中和实验分析抗体在细胞水平的抗病毒能力,同时在小鼠体内检验抗体的预防和治疗效果。结果显示Bis‑Hu11‑1能有效结合、中和H1N1流感病毒。[0038] 本发明公开了一种用于抗H1N1流感病毒的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1及其应用,属基因工程抗体技术领域。本发明以靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2的抗体ZJU11‑01和靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb的抗体ZCMU‑H1N1为亲本抗体,依据CrossMab平台利用基因工程技术将双特异性IgG抗体Fab臂功能域(CH1‑CL)的交换,哺乳动物真核表达体系表达Bis‑Hu11‑1。本发明还提供表达和纯化双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的方法,通过CHO‑S细胞分泌表达,亲和层析纯化获得目的蛋白。此双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1能够特异性同时结合于H1N1流感病毒血凝素蛋白的抗原位点Ca2和Sb,通过中和作用抑制H1N1流感病毒。本发明为H1N1亚型季节性流感病毒感染的预防和治疗提供了有效的工具,并可推广用于与其他药物联合应用以及其他研究。[0039] 本发明中双特异性中和抗体的两个亲本单克隆抗体ZJU11‑01与ZCMU‑H1N1,其中一端ZJU11‑01的特征为能够特异性的靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2;另一端ZCMU‑H1N1能特异性的靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb。采用人源IgG1抗体为骨架对双特异性抗体进行人源化,减少由鼠源抗体带来的可能的免疫原性,同时采用“Crossover”对ZCMU‑H1N1的轻链CL与重链CH1进行交换,这样避免双特异性抗体组装过程中的异源错配,并且不会改变抗体本身的结构,可以保持抗体与抗原的亲和力;哺乳动物细胞表达系统进行蛋白表达,保证双特异性抗体的生物学活性。[0040] 本发明的另一个目的是提供该双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1能有效结合、中和H1N1流感病毒及其使用方法。[0041] 抗H1N1流感病毒的双特异中和抗体Bis‑Hu11‑1在制备预防和治疗H1N1季节性流感病毒药物中的应用。[0042] 本发明的优点在于提供了一种抗H1N1流感病毒的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1,并在细胞及动物体内验证了该抗体的抗病毒效应,将为抗H1N1流感病毒的预防与治疗提供新的参考方案。附图说明[0043] 图1为双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的基因表达载体的构建示意图。[0044] 图2为双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的表达纯化鉴定图。[0045] 图3为双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1体外中和效应检测。[0046] 图4为双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1体内预防作用。[0047] 图5为双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1体内治疗作用。具体实施方式[0048] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。[0049] 实施例1.双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的构建[0050] (1)通过杂交瘤技术筛选得到靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2的鼠源单克隆抗体ZJU11‑01和靶向H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb的鼠源单克隆抗体ZCMU‑H1N1:①选择6周龄的BALB/C小鼠,以纯化的H1N1流感病毒血凝素蛋白对小鼠进行免疫;②处死①中备好的小鼠并获取脾脏淋巴细胞,将小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞通过聚乙二醇融合法进行细胞融合。融合后的细胞适当稀释,接种至饲养细胞培养板培养;③将上述培养物在次黄嘌呤‑磷酸核糖转移酶选择性培养基中培养。待细胞集落长到大小合适时,吸取细胞培养上清液做抗体鉴定,筛选阳性克隆;④以有限稀释法克隆杂交瘤细胞,取培养上清液做酶联免疫吸附实验鉴定阳性克隆。重复有限稀释克隆若干次,直至杂交瘤细胞的阳性孔率达到100%。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定及理化性状分析。⑤将6阳性杂交瘤细胞接种到BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油每只0.5毫升,然后每只接种5×10个,10天后收集腹水离心,测定抗体效价,并纯化单克隆抗体;⑧通过ProteinG亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。[0051] (2)对鼠源单克隆抗体ZJU11‑01和ZCMU‑H1N1的重、轻链可变区基因进行测序:①6收集5×10个目标单克隆杂交瘤细胞,用1毫升的Trizol裂解后提取RNA;②以提取的RNA为模板,通过反转录试剂盒合成cDNA;③以反转录获得的cDNA为模板,通过特异性引物进行PCR扩增,将扩增的片段插入到表达载体上并测序。该双特异性中和抗体抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2的亲本抗体ZJU11‑01的重链的氨基酸序列如SEQID NO.1所示、所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Ca2亲本抗体ZJU11‑01的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示;所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示,所述抗H1N1流感病毒血凝素蛋白抗原位点Sb亲本抗体ZCMU‑H1N1的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。[0052] (3)双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1四条链的设计和合成:①通过overlapPCR技术将ZJU11‑01的重链可变区和人IgG1的重链恒定区(CH1+CH2+CH3),ZJU11‑01的轻链可变区和人IgG1的轻链恒定区(CL),ZCMU‑H1N1的重链可变区、人IgG1的轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH2+CH3),ZJU11‑01的轻链可变区和人IgG1的重链恒定区(CH1)进行连接构建成双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1重轻链基因;②将目的基因分别克隆入真核表达载体pcDNA3.4中;③分别将质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,将转化菌液涂于LB平板,在37℃孵箱中倒置培养过夜;④分别随机挑选10个单克隆加入4毫升液体LB培养基中,37℃条件下震荡扩增培养8小时后,吸取2微升菌液进行菌液PCR并测序以鉴定和筛选重组质粒DNA;⑤将测序正确的菌液进行扩大培养并保存;⑥用质粒提取试剂盒分别提取质粒,得到四组重组质粒pcDNA3.4‑ZJU11‑01‑H/L‑Chain、pcDNA3.4‑ZCMU‑H1N1‑H/L‑Chain。[0053] 结果见附图1。[0054] 实施例2.双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1的表达纯化与鉴定[0055] 将表达双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1四条链的重组质粒进行共转染,表达细胞为CHO‑S细胞。[0056] (1)转染质粒的线性化:将构建好的四组重组质粒线性化,37℃过夜酶切后回收质粒,1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的线性化程度,紫外分光光度计检测质粒DNA浓度后于‑20℃保存待用。[0057] (2)细胞传代培养:CHO‑S细胞培养于FreeStyleTMCHO表达培养基中,于37℃,8%CO2条件下培养,待细胞长至对数生长期备用。[0058] (3)通过电转染法将四种重组质粒pcDNA3.4‑ZJU11‑01‑H/L‑Chain、PcDNA3.4‑ZCMU‑H1N1‑H/L‑Chain按1:1:1:1的比例共转染至CHO‑S细胞中,次日换液并对细胞进行传代,逐步扩大细胞培养规模,收集细胞培养液,0.22微米滤膜过滤样品后进行ProteinA柱亲和层析纯化,最终大量获得目的蛋白。分别进行8%非还原以及12%还原聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其分子量与装配情况,对目的蛋白进行初步验证。[0059] 结果见附图2,双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑01成功表达且装配正确。[0060] 实施例3.双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1抗病毒效应[0061] (1)微量中和实验:①H1N1流感病毒(A/Michigan/45/2015)进行半数组织细胞感4染剂量(TCID50)滴定;②接种MDCK细胞接种于96孔培养板,每孔2×10 个细胞,于含5%二氧化碳饱和37℃孵箱中培养24小时;③用含0.2%胰酶的病毒培养液稀释病毒至100TCID50每50微升;④在96孔培养板中将10微克每毫升的单克隆抗体ZJU11‑01用病毒培养液倍比稀释至不同浓度(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:521),每孔50微升;⑤在加有抗体的孔中加入50微升的100TCID50每50微升的病毒液,混匀,每一稀释度做4个复孔;倒数第二列做病毒回滴,病毒从100TCID50每100微升倍比稀释(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128),每孔100微升;最后一列做对照,4孔做为阴性细胞对照(每孔加入100微升的病毒培养液)和4孔做为阳性细胞对照(每孔加入100微升的100TCID50每100微升的病毒液),于含5%二氧化碳饱和37℃孵箱中孵育2小时;⑥取出准备好的96孔MDCK细胞培养板,磷酸盐缓冲液洗细胞1遍,将⑤中96孔板中的准备好的液体转入细胞培养板中,于含5%二氧化碳饱和37℃孵箱中孵育2小时;⑦取出上述96孔细胞板,用磷酸盐缓冲液洗细胞2遍;每孔加入200微升病毒培养液,于含5%二氧化碳饱和37℃孵箱中孵育72小时;⑧取培养72小时后的96孔细胞板,每孔取培养上清液50微升,转至血凝板,再在血凝板中每孔加入50微升的1%鸡红细胞;⑨30分钟后观察结果。[0062] 结果见附图3,Bis‑Hu11‑1对H1N1流感病毒具有较好的体外中和效应[0063] (2)小鼠预防实验:①H1N1流感病毒(A/Michigan/45/2015)小鼠半数致死量滴定;②小鼠分组:7周龄雌性BALB/C小鼠,每组5只,共五组,分别编号为第一组至第五组;③每只小鼠称重并记录;④第一组和第三组小鼠通过腹腔注射3毫克每千克体重的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1,第二组和第四组小鼠通过腹腔注射30毫克每千克体重的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1,第五组注射50微升的磷酸盐缓冲液;⑤将H1N1流感病毒稀释至5倍半数致死量每50微升,第一、二、五组在注射双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1或磷酸盐缓冲液6小时后,通过鼻内接种H1N1流感病毒,50微升每只;⑥第三、四组在注射单抗48小时后,通过鼻内接种H1N1流感病毒,50微升每只;⑥每天观察并记录体重。[0064] 结果见附图4,双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1在小鼠体内可以有效预防H1N1流感病毒的感染,在30毫克每千克体重的浓度下可达到100%的保护效率。[0065] (3)小鼠治疗实验:①小鼠分组:7周龄雌性BALB/C小鼠,每组5只,共七组,分别编号为第一组至第七组;②每只小鼠称重并记录;②将H1N1流感病毒稀释至10倍半数致死量每50微升,第一组至第七组中所有小鼠通过鼻内接种H1N1流感病毒,50微升每只;③感染6小时后,第一、二、三组小鼠分别通过腹腔注射3、10、30毫克每千克体重的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1,第七组腹腔注射50微升的磷酸盐缓冲液;④感染48小时后,第四、五、六组小鼠分别通过腹腔注射3、10、30毫克每千克体重的双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1;⑤每天观察并记录体重。[0066] 结果见附图5,双特异性中和抗体Bis‑Hu11‑1在小鼠体内可以有效治疗H1N1流感病毒的感染,并且治疗效果与治疗时间密切相关,在30毫克每千克体重的浓度下,在感染48小时后仍能达到100%的保护效率。[0067] 应理解,本发明是结合最佳实施例进行描述的,然而在阅读了本发明的上述内容后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

专利地区:浙江

专利申请日期:2022-05-28

专利公开日期:2024-06-18

专利公告号:CN114957479B

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