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一种甲型流感病毒检测试剂盒及其检测方法发明专利

更新时间:2024-07-01
一种甲型流感病毒检测试剂盒及其检测方法发明专利 专利申请类型:发明专利;
源自:上海高价值专利检索信息库;

专利名称:一种甲型流感病毒检测试剂盒及其检测方法

专利类型:发明专利

专利申请号:CN202110437901.7

专利申请(专利权)人:上海之江生物科技股份有限公司
权利人地址:上海市浦东新区张江高科技产业东区瑞庆路528号20幢乙号1层、21幢甲号1层

专利发明(设计)人:邵俊斌,张含嫣,刘燕,舒锋,詹晓明

专利摘要:本发明属于病毒检测领域,具体涉及如SEQ ID NO.1所示的序列作为靶标用于制备甲型流感病毒检测产品的用途。本发明的靶序列特异性较好,在blast结果中高于80%相似性没有其他相近物种;保守性可达100%,远远大于其他靶区域;梯度稀释后灵敏度较高。引物和探针考虑了甲型流感病毒中的保守性,可以实现在所有已知甲型流感病毒全基因组样本中全覆盖,解决了临床实际检测中出现的样本漏检问题,大大提高试剂盒的检出率。特异性引物和探针的设计使检测对象可以精确到种水平,探针技术的高特异性和光谱技术的高精确定量的优点大大降低检测的假阳性率。避免了交叉反应。大大缩短了检测时间,操作简便。避免扩增产物污染造成的假阳性结果。

主权利要求:
1.一种甲型流感病毒检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针;所述甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针的靶序列如SEQIDNO.1所示;
所述甲型流感病毒检测引物包括第一引物组和第二引物组,所述第一引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的下游引物;所述第二引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物;所述甲型流感病毒检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示;
所述甲型流感病毒检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒检测试剂盒,其特征在于,还包括以下特征中的一项或多项:a.所述试剂盒还含有RT‑PCR酶、DEPC‑H2O、阳性对照或阴性对照中的一种或多种;
b.所述试剂盒包括甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液,所述混合液中包括所述甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针。
3.根据权利要求2所述的甲型流感病毒检测试剂盒,其特征在于,特征b中,所述甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液中还包括buffer、Mg2+、dNTP、水中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的甲型流感病毒检测试剂盒,其特征在于,所述甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液中的引物、探针配方如下:第一引物组:上游引物:0.5μl/test;下游引物:0.9μl/test;第二引物组:上游引物:
0.4μl/test;
下游引物:0.7μl/test;探针0.35μl/test。
5.根据权利要求4所述的甲型流感病毒检测试剂盒,其特征在于,所述甲型流感病毒核
2+
酸荧光PCR检测混合液中还包括如下成分:10×buffer2.5μl/test;25mMMg 2.5μl/test;
10mMdNTP0.5μl/test;水11.75μl/test。
6.如权利要求1~5任一权利要求所述的甲型流感病毒检测试剂盒的使用方法,所述方法为非疾病诊断目的的方法,所述方法包括如下步骤:a)提取样品基因组DNA;
b)加样:将样品基因组DNA、阳性对照和阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中,获得对应的样品反应管、阳性反应管和阴性反应管,所述PCR反应体系中含有如权利要求1~5任一权利要求所述试剂盒中的甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针;
c)PCR反应:反应管置于PCR仪上,设置循环参数,进行PCR反应;
d)PCR反应结束后,分析结果。 说明书 : 一种甲型流感病毒检测试剂盒及其检测方法技术领域[0001] 本发明属于病毒检测领域,具体涉及一种甲型流感病毒检测试剂盒及其检测方法。背景技术[0002] 人类最常见且发病率最高的疾病即急性呼吸道感染ARIs,其中甲型流感在引发ARIs及肺部感染中最为常见。甲型流感能够引发世界性流行,在过去100年间发生过数起,如1918年的西班牙H1N1流感,1957年的亚洲流感H2N2,1968年的香港流感H3N2,以及2009年的猪流感H1N1。这类疾病能够感染所有年龄段人群并且在人群中较易快速传播。据2018年全球卫生组织WHO官方报道,甲型流感作为美国致死率第8大病原体已经感染世界近4‑6亿儿童和2‑50亿成年人,每年病死人数近0.5‑1百万人群且仍在递增。甲型流感病毒包含两端极易发生漂变的基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)编码的糖蛋白分布在病毒表面,高频率的遗传变异随时会引发大流行,产生的大部分新流感病毒突变都来自于抗原基因漂变。因此,主要难题就是能够落实和提供高质量的诊断产品来检测甲型流感患者的样本,从而降低假阴性率,避免漏检导致延误感染患者的最佳治疗时间。[0003] 目前对甲型流感病毒检测诊断方法主要有以下几种:[0004] (一)细胞培养分离鉴定[0005] 传统细胞培养方法主要有鸡胚分离方法和MDCK细胞分离方法,检测时间为2‑14天(中位数为3‑5天)。这类方法虽然是最可靠的确诊方法,所需时间较长,技术要求高,很难在大面积流行时实现临床的快速诊断。[0006] (二)血清学检测[0007] 最常见的方法主要有:血细胞凝集抑制试验(HAI)、微量中和/病毒中和试验(VN)、单次径向溶血(SRH),补体固定试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western杂交。由于患者发病初期血液中甲型流感病毒抗体多为阴性或者抗体滴度很低,经两周后抗体滴度才会有显著提高,灵敏度不够显然不适用于甲型流感患者的快速及时诊断。这类方法的灵敏度受限于种种因素,例如收集样本类型、患者年龄、流行阶段以及技术人员经验等。[0008] (三)核酸检测[0009] 核酸检测是甲型流感病原学诊断的重要参考。与其他检测方法相比,核酸检测的优势在于:1)可快速鉴别甲型流感病毒,提高检测特异性;2)与血清学检测比较,灵敏度较高,可提高甲型流感病毒的阳性检出率;3)与细胞培养相比,操作简便,可及早出报告,为及时准确的诊断和治疗提供科学依据。[0010] 综上所述,当前市场上的检测缺乏灵敏度和特异性、耗时且成本较高。因此,能够在疑似流感患者中实现快速、准确、方便地检测甲型流感病毒显得尤为重要和迫切。发明内容[0011] 针对现有技术所存在的问题,本发明的目的在于提供一种甲型流感病毒检测试剂盒及其检测方法。[0012] 为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:[0013] 本发明的第一方面,提供如SEQIDNO.1所示的多核苷酸序列作为靶标用于制备甲型流感病毒检测产品的用途。[0014] 本发明的第二方面,提供如SEQIDNO.1所示的多核苷酸序列的特异性检测物用于制备甲型流感病毒检测产品的用途。[0015] 本发明的第三方面,提供一种甲型流感病毒检测试剂盒,所述试剂盒中包括甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针;所述甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针的靶序列如SEQIDNO.1所示。[0016] 本发明的第四方面,提供前述甲型流感病毒检测试剂盒的使用方法,所述方法为非疾病诊断目的的方法,所述方法包括如下步骤:[0017] e)提取样品基因组DNA;[0018] f)加样:将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中,获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管,所述PCR反应体系中含有如前所述试剂盒中的甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针;[0019] g)PCR反应:反应管置于PCR仪上,设置循环参数,进行PCR反应;[0020] h)PCR反应结束后,分析结果。[0021] 本发明的甲型流感病毒检测试剂盒及其检测方法,具有如下有益效果:[0022] (1)靶序列特异性较好,在blast结果中高于80%相似性没有其他相近物种;保守性可达100%(141285/141291),远远大于其他靶区域;梯度稀释后灵敏度较高。[0023] (2)引物和探针考虑了甲型流感病毒中的保守性,可以实现在所有已知甲型流感病毒全基因组样本中全覆盖,解决了临床实际检测中出现的样本漏检问题,大大提高试剂盒的检出率。[0024] (3)特异性引物和探针的设计使检测对象可以精确到种水平,探针技术的高特异性和光谱技术的高精确定量的优点大大降低检测的假阳性率;[0025] (4)甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液里的探针和引物序列考虑了自身形成二聚体和相互作用,避免了交叉反应。[0026] (5)大大缩短了检测时间,整个过程所需时间只需2小时左右,操作简便。[0027] (6)在检测过程中采用闭管体系,以及全自动定量分析,不需要普通定性PCR的后处理,避免了扩增产物污染造成的假阳性结果。附图说明[0028] 图1阳性对照品扩增曲线图。[0029] 图21例已知甲流(未分型)样本扩增曲线图。[0030] 图31例已知H1N1样本扩增曲线图。[0031] 图41例已知H3样本扩增曲线图。[0032] 图51例已知H5样本扩增曲线图。[0033] 图61例已知H7样本扩增曲线图。[0034] 图71例已知H9样本扩增曲线图。[0035] 图81例已知甲流样本的稀释梯度扩增曲线图。(稀释倍数曲线是从左向右数共计5条曲线,第一条曲线是原始样本,第二条曲线稀释倍数是原始样本的10倍,第三条曲线稀释倍数是第二条曲线对应样本的4倍,第四条曲线稀释倍数是第三条曲线对应样本的4倍,第五条曲线稀释倍数是第四条曲线对应样本的4倍;即,梯度稀释倍数:10倍,4倍,4倍,4倍)。[0036] 图91例检测体系梯度稀释质粒的线性关系图(R2:0.993,扩增效率为95.2%)。[0037] 图10利用S1组探针引物组合检测1例已知甲流(未分型)样本扩增曲线图。[0038] 图11利用S2组探针引物组合检测1例已知甲流(未分型)样本扩增曲线图。[0039] 图12利用S3组探针引物组合检测1例已知甲流(未分型)样本扩增曲线图。[0040] 图131例已知乙型流感Victoria亚型样本扩增曲线图。(图中BV代表乙型流感Victoria亚型,BY代表乙型流感Yamaga亚型,FluA代表甲型流感,FluB代表乙型流感)。[0041] 图141例已知乙型流感Yamaga亚型样本扩增曲线图。(图中BV代表乙型流感Victoria亚型,BY代表乙型流感Yamaga亚型,FluA代表甲型流感,FluB代表乙型流感)。具体实施方式[0042] 在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。[0043] 当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。[0044] 如SEQIDNO.1所示的序列作为靶标用于制备甲型流感病毒检测产品的用途。具体地:[0045] TCACCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCT(SEQIDNO.1)。[0046] 所述SEQIDNO.1所示的多核苷酸序列作为靶标在制备甲型流感病毒检测产品的用途,具体是指:将SEQIDNO.1作为作用对象,采用特异性扩增或检测SEQIDNO.1的引物或探针制备甲型流感病毒检测产品。[0047] 如SEQIDNO.1所示的多核苷酸序列的特异性检测物可以用于制备甲型流感病毒检测产品。[0048] 所述特异性检测物选自:甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针。[0049] 本发明的靶序列特异性好,可以根据本发明所述的靶序列,采用本领域常规的引物探针设计软件,进行引物探针设计合成和调试,以进行病毒检测。[0050] 在一种优选的实施方式中,所述甲型流感病毒检测引物包括第一引物组和第二引物组,所述第一引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的下游引物;所述第二引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物;所述甲型流感病毒检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。[0051] 在一种实施方式中,所述甲型流感病毒检测引物包括第三引物组和第四引物组,所述第三引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的下游引物;所述第四引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的下游引物;所述甲型流感病毒检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。[0052] 在一种实施方式中,所述甲型流感病毒检测引物包括第五引物组和第六引物组,所述第五引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.12所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.13所示的下游引物;所述第六引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.14所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.15所示的下游引物;所述甲型流感病毒检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示。[0053] 在一种实施方式中,所述甲型流感病毒检测引物包括第七引物组和第八引物组,所述第七引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.17所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.18所示的下游引物;所述第八引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.19所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.20所示的下游引物;所述甲型流感病毒检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示。[0054] 本发明一实施例的甲型流感病毒检测试剂盒,所述试剂盒中包括甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针;所述甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针的靶序列如SEQIDNO.1所示。[0055] 在一种优选的实施方式中,所述甲型流感病毒检测引物包括第一引物组和第二引物组,所述第一引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的下游引物;所述第二引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物;所述甲型流感病毒检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。[0056] 具体地,[0057] 上游引物F1:TCACCTCTGACNAARGG(SEQIDNO.2)[0058] 下游引物R1:AGGGCATTTTGGAYRAA(SEQIDNO.3)[0059] 上游引物F2:TCACCTCTGACTNNGGG(SEQIDNO.4)[0060] 下游引物R2:AGGGCATTTTGNACAAA(SEQIDNO.5)[0061] 探针:5’‑CCTCGCTCACTGGGCACG‑3’(SEQIDNO.6)[0062] 其中,Y表示简并碱基C或者T,R表示简并碱基A或者G,N表示简并碱基A或G或C或T。[0063] 在一种实施方式中,所述甲型流感病毒检测引物包括第三引物组和第四引物组,所述第三引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的下游引物;所述第四引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的下游引物;所述甲型流感病毒检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。(本发明中,本实施例中的探针引物组合称为S1组)[0064] 具体地(S1组),[0065] 上游引物F1:CCCTCAAAGCCGAGAT(SEQIDNO.7)[0066] 下游引物R1:TGGACAAAGCGTCTACG(SEQIDNO.8)[0067] 上游引物F2:CCCTCAAAGCCGAGVSC(SEQIDNO.9)[0068] 下游引物R2:TGGACAAAGCGTCBRC(SEQIDNO.10)[0069] 探针:5’‑AGTCCTCGCTCACTGGGCAC‑3’(SEQIDNO.11)[0070] 其中,V表示简并碱基A或者C或者G,S表示简并碱基C或者G,B表示简并碱基C或者G或者T,R表示简并碱基A或者G。[0071] 在一种实施方式中,所述甲型流感病毒检测引物包括第五引物组和第六引物组,所述第五引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.12所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.13所示的下游引物;所述第六引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.14所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.15所示的下游引物;所述甲型流感病毒检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示(本发明中,本实施例中的探针引物组合称为S2组)。[0072] 具体地(S2组),[0073] 上游引物F1:AGGGGATTTTAGGGNTNG(SEQIDNO.12)[0074] 下游引物R1:TGCACCAGCAGARTANC(SEQIDNO.13)[0075] 上游引物F2:AGGGGATTTTAGGGYBTG(SEQIDNO.14)[0076] 下游引物R2:TGCACCAGCAGDVTAAC(SEQIDNO.15)[0077] 探针:5’‑ACCGTGCCCAGTGAGCG‑3’(SEQIDNO.16)[0078] 其中,V表示简并碱基A或者C或者G,D表示简并碱基A或者G或者T,Y表示简并碱基C或者T,N表示简并碱基A或者C或者G或者T,B表示简并碱基C或者G或者T,R表示简并碱基A或者G。[0079] 在一种实施方式中,所述甲型流感病毒检测引物包括第七引物组和第八引物组,所述第七引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.17所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.18所示的下游引物;所述第八引物组包括核苷酸序列如SEQIDNO.19所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.20所示的下游引物;所述甲型流感病毒检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示(本发明中,本实施例中的探针引物组合称为S3组)。[0080] 具体地(S3组),[0081] 上游引物F1:TCACCTCTGACNANGGG(SEQIDNO.17)[0082] 下游引物R1:GAGCTTCTTGTATAGTTTNACNG(SEQIDNO.18)[0083] 上游引物F2:TCACCTCTGACHNAGGG(SEQIDNO.19)[0084] 下游引物R2:GAGCTTCTTGTATAGTTTDRC(SEQIDNO.20)[0085] 探针:5’‑CGCTCACCGTGCCCAGT‑3’(SEQIDNO.21)[0086] 其中,H表示简并碱基A或者C或者T,N表示简并碱基A或者C或者G或者T,D表示简并碱基A或者G或者T,R表示简并碱基A或者G。[0087] 在一种实施方式中,所述甲型流感病毒检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。[0088] 一种实施方式中,所述甲型流感病毒检测探针的5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团。[0089] 一种实施方式中,所述甲型流感病毒检测探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团,3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ‑1。即:5’FAM荧光基团‑CCTCGCTCACTGGGCACG‑BHQ13’。[0090] 本发明的试剂盒采用多重荧光PCR技术在进行甲型流感病毒的检测,根据扩增及检测情况可分析判断样本的甲型流感病毒感染情况。[0091] 基于本发明所述试剂盒是采用多重荧光PCR技术来进行检测的,所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂,如:RT‑PCR酶、DEPC‑H2O等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置,因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒,可以根据客户实际需要配置,为方便起见,也可全部装配入试剂盒。[0092] 在一种实施方式中,所述试剂盒还含有RT‑PCR酶、DEPC‑H2O、阳性对照或阴性对照中的一种或多种。[0093] 阳性对照为甲型流感病毒标准品。[0094] 阴性对照可为PCR反应缓冲液、DEPC‑H2O、生理盐水等。[0095] 在一种实施方式中,所述试剂盒包括甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液,所述混合液中包括所述甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针。[0096] 所述甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液可自行配置,也可直接以市售的不含引物及探针的通用PCR反应液加入引物及探针获得。[0097] 在一种实施方式中,所述甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液中还包括buffer、2+Mg 、dNTP、水中的一种或多种。[0098] 在一种实施方式中,所述甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液中的引物、探针配方选自以下任一:[0099] (1)第一引物组:上游引物:0.5μl/test;下游引物:0.9μl/test;第二引物组:上游引物:0.4μl/test;下游引物:0.7μl/test;探针0.35μl/test;[0100] (2)第三引物组:上游引物:0.5μl/test,下游引物:0.5μl/test;第四引物组:上游引物:0.5μl/test,下游引物:0.5μl/test,探针:0.15μl/test;[0101] (3)第五引物组:上游引物:0μl/test,下游引物:0.4μl/test;第六引物组:上游引物:0.9μl/test,下游引物:0.4μl/test,探针:0.15μl/test;[0102] (4)第七引物组:上游引物:0μl/test,下游引物:0.4μl/test;第八引物组:上游引物:0.9μl/test,下游引物:0.4μl/test,探针:0.15μl/test。[0103] 可选的,所述甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液的中还包括如下成分:10×2+buffer2.5μl/test;Mg (25mM)2.5μl/test;dNTP(10mM)0.5μl/test;工艺用水11.75μl/test。[0104] 前述的甲型流感病毒检测试剂盒的使用方法,所述方法为非疾病诊断目的的方法,所述方法包括如下步骤:[0105] (1)提取样品基因组DNA;[0106] (2)加样:将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中,获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管,所述PCR反应体系中含有前述试剂盒中的甲型流感病毒检测引物及甲型流感病毒检测探针;[0107] (3)PCR反应:反应管置于PCR仪上,设置循环参数,进行PCR反应;[0108] PCR反应结束后,分析结果。[0109] 前述的甲型流感病毒检测试剂盒可以用于制备甲型流感病毒检测产品。[0110] 实施例1[0111] 采用Taqman荧光定量PCR原理,设计针对甲型流感病毒特异性引物,扩增甲型流感病毒特异性核酸序列,同时设计Taqman探针,针对甲型流感病毒特异性序列,位于上下游引物之间。针对甲型流感病毒序列的探针其5’端标记荧光报告基团,3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整时,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号。[0112] Ⅰ.样本、阳性对照品的核酸提取:[0113] 样本全部为医院及疾控中心CDC获得的咽拭子样本或者痰液样本,阳性对照品为委托合成的甲型流感病毒标准质粒(阳性对照品具体序列为SEQIDNO.1)。DEPC‑H2O为阴性对照。[0114] 利用商品化的提取试剂盒提取。推荐使用商品化的提取试剂盒:①Qiagen:QIAampViralRNAMiniKit,②之江生物:核酸提取试剂(MVR01)。按生产厂商的说明书进行操作。也可使用Trizol法进行提取。[0115] 提取后即可获得样本核酸和阳性对照品核酸。[0116] Ⅱ.试剂配制:[0117] 取n×19μl甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液,以及n×1μlRT‑PCR酶(n为反应管数),混合,振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒,获得混合试剂。[0118] 甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液的配方如下:[0119] 第一引物组:上游引物(SEQIDNO.2):0.5μl/test;下游引物(SEQIDNO.3):0.9μl/test;[0120] 第二引物组:上游引物(SEQIDNO.4):0.4μl/test;下游引物(SEQIDNO.5):0.7μl/test;[0121] 探针(SEQIDNO.6)0.35μl/test;[0122] 10×buffer2.5μl/test;[0123] Mg2+(25mM)2.5μl/test;[0124] dNTP(10mM)0.5μl/test;[0125] 工艺用水11.75μl/test。[0126] Ⅲ.加样:[0127] 取上述混合试剂20μl置于薄壁PCR反应管或PCR反应板中,然后将样本核酸、阳性对照品核酸、DEPC‑H2O各5μl分别加入薄壁PCR反应管或PCR反应板中,盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜,离心数秒后立即进行PCR扩增反应。[0128] Ⅳ.PCR扩增:[0129] 反应管置于定量荧光PCR仪上,推荐循环参数设置:[0130] 45℃×10min;95℃×3min;再按95℃×15sec→58℃×30sec,循环45次;单点荧光检测在58℃,反应体系为25μl。[0131] 荧光通道检测选择:选用FAM通道。[0132] 备注:如使用ABI系列PCR仪,请务必于passivereference和quencher处均选择“none”。[0133] Ⅴ.基线和阈值设定:[0134] 基线调整取6‑15个循环的荧光信号,阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC‑H2O检测荧光曲线的最高点。[0135] Ⅵ.质量控制:[0136] H2O、阳性对照品检测结果应符合下表要求,否则实验视为无效。[0137][0138] Ⅶ.试验结果的解释:[0139][0140][0141] 如图1‑图7所示,分别单独列出阳性对照品、已知甲流(未分型)样本、已知H1N1样本、已知H3样本、已知H5样本、已知H7样本、已知H9样本的扩增曲线图,结果显示,本发明所述产品可以检出不同种类的甲型流感病毒;说明本发明试剂盒检测范围覆盖了当前甲型流感的所有型别。[0142] 将1例已知甲流样本稀释后进行扩增,结果如图8所示,从左向右数第一条曲线为原始样本,后面四条曲线梯度稀释倍数依次为:10倍,4倍,4倍,4倍。稀释多次后,产品依然2能够检出稀释后的样本;并且该例检测体系质粒在梯度稀释后的线性相关R :0.993,扩增效率为95.2%(图9),说明该试剂盒检测灵敏度较高。[0143] 实施例2[0144] 实施例2采用与实施例1相同的实验方法,区别在于,本发明所采用的探针引物组合分别为S1组、S2组和S3组,探针引物组合的配方分别为:(1)S1组:第三引物组:上游引物:0.5μl/test,下游引物:0.5μl/test;第四引物组:上游引物:0.5μl/test,下游引物:0.5μl/test,探针:0.15μl/test;(2)S2组:第五引物组:上游引物:0μl/test,下游引物:0.4μl/test;第六引物组:上游引物:0.9μl/test,下游引物:0.4μl/test,探针:0.15μl/test;(3)S3组:第七引物组:上游引物:0μl/test,下游引物:0.4μl/test;第八引物组:上游引物:0.9μl/test,下游引物:0.4μl/test,探针:0.15μl/test。样本为甲流(未分型)样本,结果分别如图10、图11、图12所示,表明S1组、S2组和S3组引物探针组合也能检测出甲流样本的病毒,采用SEQIDNO.1作为靶标进行检测效果好。[0145] 对照例[0146] 本对照例采用与实施例1相同的实验方法,区别在于,本对照例使用的样本分别为乙型流感Victoria亚型的病毒样本、乙型流感Yamaga亚型的病毒样本,本例所使用的检测引物是联合检测产品,所述联合检测产品包括本发明所述产品乙流通用检测试剂盒、乙流Victoria亚型检测试剂盒、乙流Yamaga亚型检测试剂盒。结果如图13‑14所示,图中可以看出本发明产品并不会检出乙流通用和分型的病毒,表明本发明靶标的特异性好,灵敏度更高。[0147] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。

专利地区:上海

专利申请日期:2021-04-22

专利公开日期:2024-06-18

专利公告号:CN114686619B

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