一种人工蛋白骨架及其应用发明专利

专利名称：一种人工蛋白骨架及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202110465975.1

专利申请（专利权）人：中国科学院深圳先进技术研究院
权利人地址：广东省深圳市南山区深圳大学城学苑大道1068号

专利发明（设计）人：马田

专利摘要：本发明提供了一种人工蛋白骨架及其应用。本发明首先提供一种人工蛋白骨架肽段分子，其包括来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽。本发明具体提供了SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成的肽段分子及其编码核酸分子。本发明的肽段分子或核酸分子可应用于微生物体内的人工蛋白骨架技术，用于细胞膜酶之间的组装，或应用于细胞质酶和细胞膜酶之间的组装，能提高合成效率；或利用其识别特性，实现酶的特异识别、连接及共定位。

主权利要求：
1.一种构建体，其含有连接基因核酸分子及目标产物代谢途径基因核酸分子，通过表达核酸分子编码连接酶肽段及代谢途径酶；
其中，所述连接酶肽段来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽；
所述代谢途径酶为细胞膜酶，或者细胞质酶和细胞膜酶的组合酶；
所述连接酶肽段作为蛋白骨架肽段分子用于代谢途径酶的串联组装，所述连接酶肽段及代谢途径酶选自以下组合方式之一：所述连接酶肽段为两对：M2‑C与M3‑N、M4‑C与M5‑N，所述代谢途径酶为番茄红素环化酶crtY、β‑胡萝卜素羟化酶crtZ、β‑胡萝卜素酮化酶crtW；或者所述连接酶肽段为两对：M2‑C与M3‑N、M4‑C与M5‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE、八氢番茄红素合成酶crtB；或者所述连接酶肽段为两对：RapA‑C与RapB‑N、RapB‑C与RapC‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE、八氢番茄红素合成酶crtB；或者所述连接酶肽段为两对：FkbB‑C与FkbC‑N、FkbC‑C与FkbA‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE、八氢番茄红素合成酶crtB；或者所述连接酶肽段为一对：M2‑C与M3‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE；或者所述连接酶肽段为一对：RapA‑C与RapB‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE；或者所述连接酶肽段为一对：FkbB‑C与FkbC‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE；
其中，M2‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，M3‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，M4‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，M5‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，RapA‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，RapB‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示，RapB‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，RapC‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示，FkbB‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示，FkbC‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示，FkbC‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示，FkbA‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示。
2.根据权利要求1所述的构建体，其为质粒、宿主细胞或微生物。
3.一种应用人工蛋白骨架进行生物体代谢产物合成的方法，其包括：
将来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽引入目标产物代谢途径酶，构建含有人工蛋白骨架的微生物突变株；其中，所述代谢途径酶为细胞膜酶，或者细胞质酶和细胞膜酶的组合酶；
进行微生物突变株的发酵培养，得到目标代谢产物；
其中，所述所述来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽作为蛋白骨架肽段分子用于代谢途径酶的串联组装，所述连接酶肽段及代谢途径酶选自以下组合方式之一：所述非共价连接识别肽为两对：M2‑C与M3‑N、M4‑C与M5‑N，所述代谢途径酶为番茄红素环化酶crtY、β‑胡萝卜素羟化酶crtZ、β‑胡萝卜素酮化酶crtW；或者所述非共价连接识别肽为两对：M2‑C与M3‑N、M4‑C与M5‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE、八氢番茄红素合成酶crtB；或者所述非共价连接识别肽为两对：RapA‑C与RapB‑N、RapB‑C与RapC‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE、八氢番茄红素合成酶crtB；或者所述非共价连接识别肽为两对：FkbB‑C与FkbC‑N、FkbC‑C与FkbA‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE、八氢番茄红素合成酶crtB；或者所述非共价连接识别肽为一对：M2‑C与M3‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE；或者所述非共价连接识别肽为一对：RapA‑C与RapB‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE；或者所述非共价连接识别肽为一对：FkbB‑C与FkbC‑N，所述代谢途径酶为异戊二烯焦磷酸异构酶IDI、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶crtE；
其中，M2‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，M3‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，M4‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，M5‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，RapA‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，RapB‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示，RapB‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，RapC‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示，FkbB‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示，FkbC‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示，FkbC‑C的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示，FkbA‑N的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述微生物为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中任一种或多种。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述目标代谢产物为虾青素。 说明书 : 一种人工蛋白骨架及其应用技术领域[0001] 本发明是关于人工蛋白骨架技术，具体地说，是关于一种可应用于微生物体内的人工蛋白骨架、其制备方法及相关应用。背景技术[0002] 人工构建微生物合成体系时，针对一种目标产物的合成大多有多步催化反应。天然的生物催化体系通常在细胞内形成物理上、空间上组织有序的多酶复合体、酶分子脚手架或者反应微区，这种高效的组织性带来了高效的催化能力。然而人工构建的微生物合成体系多不存在这种高效的组织性，即参与合成的催化酶在细胞内的分布多有差异，最直接的影响即为中间代谢产物的传质效率较低，由此引发目标途径合成效率低、代谢流不平衡、影响细胞生长等问题，很大程度上限制了微生物合成体系的生物制造潜力(DahlR,ZhangF,Alonso‑GutierrezJ,BaidooE,BatthT,Redding‑JohansonA,PetzoldC,MukhopadhyayA,LeeT,AdamsP.Engineeringdynamicpathwayregulationusingstress‑responsepromoters.NatBiotechnol,2013,31(11):1039‑1046)。如果能够开发空间上高度有序组织酶分子的技术，即人工蛋白骨架技术，防止中间体扩散，提高中间代谢产物的传输效率，降低中间代谢产物的去往竞争途径流向的损失，减少不稳定中间体降解的损失，减少中间体通过时间，规避不利平衡，将很大程度上改善微生物合成体系合成效率低的问题。[0003] 人工蛋白骨架技术具有简便易操作性及高效性，通过简单的多肽相互作用域与其特定配体之间的工程化，即可增加总体途径通量，同时减少代谢负荷，基于此特点，目前研究人员已开发了一些用于酶组装的人工蛋白骨架技术。例如，动物细胞信号传导的配体能够和受体特异性识别，利用此特性，Dubber等人在大肠杆菌体内开发了可用于蛋白组装的支架，命名为GBDxSH3yPDZz，通过配体和受体之间的蛋白‑肽相互作用将乙酰辅酶A合成到甲羟戊酸途径的三个酶进行组装，实现了目标产物产量的显著改善(DueberJ,WuG,MalmircheginiG,MoonT,PetzoldC,UllalA,PratherK,KeaslingJ.Syntheticproteinscaffoldsprovidemodularcontrolovermetabolicflux.NatBiotechnol,2009,27(8):753‑759)。[0004] 然而，现有蛋白骨架技术组装酶的种类十分有限，主要应用于较短的代谢通路中，如大多为两种酶的组装，少有三种以上酶的组装，且已开发的蛋白骨架技术非常少，应用场景没有明确的说法。发明内容[0005] 本发明的一个目的在于提供一种人工蛋白骨架新技术。[0006] 本发明针对现有技术的不足，开发了一种应用于微生物体内的人工蛋白骨架技术(DEBS‑EAL，脱氧红霉内酯合成酶‑酶组装流水线)(图1)，其基于红霉素聚酮合酶结构，将其结构模块间可互相特异识别的非共价连接肽，作为该技术的核心，这些可互相特异识别的连接肽可分别装配表达在拟组装的催化酶上，并分别应用于虾青素代谢途径种的胞质酶和膜酶上。[0007] 具体而言，一方面，本发明提供了一种人工蛋白骨架肽段分子，其包括来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽。[0008] 根据本发明的具体实施方案，本发明的人工蛋白骨架肽段分子，其中，所述I型非迭代聚酮合酶包括红霉素聚酮合酶、雷帕霉素聚酮合酶、他克莫司聚酮合酶、金链菌素聚酮合酶、阿维菌素聚酮合酶、多杀菌素聚酮合酶、埃博霉素聚酮合酶、盐霉素聚酮合酶中的一种或多种。优选地，所述肽段分子可以来源于I型非迭代聚酮合酶的模块间的可互相识别的特异识别肽。[0009] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明开发了一种DEBS‑EAL人工蛋白骨架序列，其中：[0010] 基于I型非迭代聚酮合酶‑红霉素聚酮合酶的基因序列，其非共价连接基因序列有两对，分别位于模块2的C端(M2‑C)、模块3的N端(M3‑N)，以及模块4的C端(M4‑C)、模块5的N端(M5‑N)，且两两分别特异识别连接。雷帕霉素聚酮合酶非共价连接序列有2对，分别为RapA‑C、RapB‑N以及RapB‑C、RapC‑N。他克莫司聚酮合酶非共价连接序列有2对，分别为FkbB‑C、FkbC‑N以及FkbC‑C、FkbA‑N。这些连接酶肽段分子具有SEQIDNO:1～SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。[0011] 另一方面，本发明还提供一种编码人工蛋白骨架肽段分子(连接酶肽段)的核酸分子，其编码上述的连接酶肽段分子。在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有SEQIDNO:13～SEQIDNO:24所示的核苷酸序列。[0012] 另一方面，本发明还提供了所述的人工蛋白骨架肽段分子或所述的核酸分子在制备人工蛋白骨架中的应用，其中是将来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽作为人工蛋白骨架对目标蛋白进行组装。优选地，所述目标蛋白为非聚酮合酶。[0013] 另一方面，本发明还提供了一种构建体，其含有本发明所述的核酸分子。[0014] 根据本发明的具体实施方案，本发明中所述构建体还含有目标代谢途径基因核酸分子。[0015] 根据本发明的具体实施方案，本发明中所述构建体可以为质粒、宿主细胞或微生物。[0016] 另一方面，本发明还提供了一种应用人工蛋白骨架进行生物体代谢产物合成的方法，其包括：[0017] 将来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽引入目标产物代谢途径酶，构建含有人工蛋白骨架的微生物突变株；[0018] 进行微生物突变株的发酵培养，得到目标代谢产物。[0019] 根据本发明的具体实施方案，本发明的应用人工蛋白骨架进行生物体代谢产物合成的方法中，所述微生物可以为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中任一种或多种。[0020] 根据本发明的具体实施方案，本发明的应用人工蛋白骨架进行生物体代谢产物合成的方法中，所述的代谢产物可以为萜类化合物、维生素、聚酮化合物、非核糖体肽或核糖体肽中任一种或多种，不局限于虾青素。[0021] 根据本发明的具体实施方案，本发明的应用人工蛋白骨架进行生物体代谢产物合成的方法中，所述I型非迭代聚酮合酶包括红霉素聚酮合酶、雷帕霉素聚酮合酶、他克莫司聚酮合酶、金链菌素聚酮合酶、阿维菌素聚酮合酶、多杀菌素聚酮合酶、埃博霉素聚酮合酶、盐霉素聚酮合酶中的一种或多种。优选地，所述非共价连接识别肽来源于I型非迭代聚酮合酶的模块间的可互相识别的特异识别肽。在本发明的一些具体实施方案中，所述非共价连接识别肽包括SEQIDNO:1～SEQIDNO:12所示的氨基酸序列组成的多肽中的一种或多种。[0022] 根据本发明的具体实施方案，本发明的应用人工蛋白骨架进行生物体代谢产物合成的方法中，所述目标产物代谢途径酶可以是细胞质酶和/或细胞膜酶。[0023] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明提供一种DEBS‑EAL人工蛋白骨架技术的构建方法，并将其引入到虾青素合成途径的细胞膜酶，其包含如下步骤：[0024] 将M2‑C连接序列融合于基因crtY的C端，M3‑N和M4‑C分别融合于基因crtZ的N端和C端，M5‑N连接序列融合于基因crtW的N端，构建同时含有crtYM2C、crtZM3N‑M4C、crtWM5N的细菌突变株A2。[0025] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明提供一种DEBS‑EAL人工蛋白骨架技术的构建方法，并将其引入虾青素细胞质酶和细胞膜酶，其包含如下步骤：[0026] 将M2‑C连接序列融合于基因IDI的C端，M3‑N和M4‑C分别融合于基因crtE的N端和C端，M5‑N连接序列融合于基因crtB的N端，构建同时含有IDIM2C、crtEM3N‑M4C、crtBM5N的细菌突变株A3。[0027] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明利用所述的DEBS‑EAL人工蛋白骨架技术构建了细菌突变株A4，其包含如下步骤：将RapA‑C连接序列融合于基因IDI的C端，RapB‑N和RapB‑C分别融合于基因crtE的N端和C端，RapC‑N连接序列融合于基因crtB的N端，构建同时含有IdiRapA‑C、crtERapB‑N‑RapB‑C和crtBRapC‑N的细菌突变株A4。[0028] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明利用所述的DEBS‑EAL人工蛋白骨架技术构建了细菌突变株A5，其包含如下步骤：将FkbB‑C连接序列融合于基因IDI的C端，FkbC‑N和FkbC‑C分别融合于基因crtE的N端和C端，FkbA‑N连接序列融合于基因crtB的N端，构建同时含有IdiFkbB‑C、crtEFkbC‑N‑FkbC‑C和crtBFkbA‑N的细菌突变株A5。[0029] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明利用所述的DEBS‑EAL人工蛋白骨架技术构建了细菌突变株A6，其包含如下步骤：将M2‑C连接序列融合于基因IDI的C端，M3‑N融合于基因crtE的N端，构建同时含有IDIM2C、crtEM3N的细菌突变株A6。[0030] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明利用所述的DEBS‑EAL人工蛋白骨架技术构建了细菌突变株A7，其包含如下步骤：将RapA‑C连接序列融合于基因IDI的C端，RapB‑N融合于基因crtE的N端，构建同时含有IdiRapA‑C、crtERapB‑N的细菌突变株A7。[0031] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明利用所述的DEBS‑EAL人工蛋白骨架技术构建了细菌突变株A8，其包含如下步骤：将FkbB‑C连接序列融合于基因IDI的C端，FkbC‑N融合于基因crtE的N端，构建同时含有IdiFkbB‑C、crtEFkbC‑N的细菌突变株A8。[0032] 在本发明的一些具体实施方案中，以I型非迭代聚酮合酶‑红霉素合成的聚酮合酶的结构为出发点，开发人工蛋白骨架技术。目前已知的I型非迭代聚酮合酶有三千多种，其蛋白结构具有多样性，而这些结构中所具有的模块间特异识别肽同样具有多样性，例如，雷帕霉素的聚酮合酶(RAPS)可分为三个模块，三个模块间(RapA与RapB之间，RapB与RapC之间)由两组可互相识别的特异识别肽用于整个聚酮合酶多模块的组装。这些特异识别肽与红霉素合成的聚酮合酶结构中的特异识别肽不同，但仍然具有特异识别组装的功能。类似的埃博霉素、盐霉素等均具有同样的特点。这些特异识别肽可按本发明中人工蛋白骨架搭建方法，应用于非聚酮合酶的其他途径酶的自组装中，即有潜在三千多种I型非迭代聚酮合酶的模块间识别肽可用于多种酶的组装应用。[0033] 本发明的DEBS‑EAL人工蛋白骨架技术可应用于细胞膜酶之间的组装，也可以应用于细胞质酶和细胞膜酶之间的组装，均能提高合成效率，且后者具有非常明显的提升效果。根据本发明的一些具体实施方案，通过构建携带目标酶的人工蛋白骨架表达载体及突变株，对获得的突变株进行发酵、虾青素提取、检测和定量，实现细胞膜酶间组装虾青素产量提高45.8％，细胞膜酶与细胞质酶组装虾青素产量提高220.5％。[0034] 根据本发明的具体实施方案，本发明的作为人工蛋白骨架肽段分子可以采用来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽中的一对(一组)使用，也可以同时采用两对或更多对用于多个蛋白的串联组装。[0035] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明的作为人工蛋白骨架肽段分子可以采用来源于I型非迭代聚酮合酶的非共价连接识别肽中的一对(一组)使用，并将其引入虾青素合成途径酶两酶组装，其包含如下步骤：[0036] 将M2‑C连接序列融合于基因IDI的C端，M3‑N融合于基因crtE的N端，构建同时含有IDIM2C、crtEM3N的细菌突变株A6。[0037] 将RapA‑C连接序列融合于基因IDI的C端，RapB‑N融合于基因crtE的N端，构建同时含有IdiRapA‑C、crtERapB‑N的细菌突变株A7。[0038] 将FkbB‑C连接序列融合于基因IDI的C端，FkbC‑N融合于基因crtE的N端，构建同时含有IdiFkbB‑C、crtEFkbC‑N的细菌突变株A8。[0039] 根据本发明的具体实施方案，本发明的人工蛋白骨架肽段分子作用对具有特异识别特性，利用此特性，可用于酶与酶之间的特异识别、连接及共定位。在本发明的一些具体实施方案中，本发明构建了DEBS‑EAL识别肽特异识别连接的共定位表达菌株。[0040] 在一些更具体的实施方案中，本发明将质粒pQC005和pQC006转化到含有质粒pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得大肠杆菌突变株A9。[0041] 在另一些更具体的实施方案中，本发明将质粒pQC007和pQC008转化到含有质粒pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得大肠杆菌突变株A10。[0042] 在另一些更具体的实施方案中，本发明将质粒pQC009和pQC010转化到含有质粒pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得大肠杆菌突变株A11。[0043] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明还提供了所述的菌株的相关应用。[0044] 综上所述，本发明提出了一类能够组装多种酶的人工蛋白骨架，且明确提出该技术应用于胞质酶和膜酶有非常显著地提高催化效率的效果，且该技术的背后有上千个类似的人工蛋白骨架，能够丰富并拓展人工蛋白骨架的应用环境、适用范围、及可选使用库，为人工生物合成体系的高效合成提供一种新的策略和思路，为多酶组装的相关应用及发展提供一个新的突破口。除此之外，该人工蛋白骨架亦可应用于需特异识别、连接、共定位的其他情形。附图说明[0045] 图1为本发明的技术特征示意图。[0046] 图2A‑图2M为本发明实施例中所构建的质粒结构示意图。[0047] 图3为本发明实施例中所构建的大肠杆菌突变株示意图。[0048] 图4A‑图4B为本发明实施例中所构建的大肠杆菌突变株的发酵产物虾青素产量(mg/gDCW)对比图。[0049] 图5为本发明实施例中蛋白特异识别连接的共定位荧光显微镜结果图。具体实施方式[0050] 下面将结合具体实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。[0051] 连接酶肽段分子[0052] 在本发明的一个方面，本发明提供了红霉素聚酮合酶、雷帕霉素聚酮合酶及他克莫司聚酮合酶各个模块间非共价连接肽，即连接酶肽段分子。根据本发明的实施例，这些连接酶肽段分子具有SEQIDNO:1～SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。[0053] 连接基因核酸分子[0054] 在本发明的另一方面，本发明提供了一种连接基因核酸分子。根据本发明的实施例，所述连接基因核酸分子编码前面的连接酶肽段分子。由此，根据本发明实施例的核酸分子能够有效地编码上述连接酶肽段。根据本发明的实施例，连接基因核酸分子具有SEQIDNO:13～SEQIDNO:24所示的核苷酸序列。[0055] 构建体[0056] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体含有前面所述的连接基因核酸分子及目标代谢途径基因核酸分子。由此，根据本发明实施例的构建体可以通过表达核酸分子，编码连接酶肽段及代谢途径酶，以便获得目标化合物高效合成。[0057] DEBS‑EAL人工蛋白骨架及其建立方法[0058] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种基于红霉素聚酮合酶、雷帕霉素聚酮合酶及他克莫司聚酮合酶结构的人工蛋白骨架技术及其建立方法。根据本发明的实施例，该方法包括：在适于连接酶肽段及途径酶表达的条件下，培养前面所述构建体，以便获得培养产物；以及从培养产物中提取目标化合物。由此，以便目标化合物的定量分析，获得目标化合物高产菌株。[0059] 实施例1DEBS‑EAL人工蛋白骨架序列的确定[0060] 分析红霉素聚酮合酶的基因序列，通过蛋白结构和模块间的相互作用，界定非共价连接基因序列(Gokhale,R.S.Dissectingand exploitingintermodularcommunicationinpolyketidesynthases.[J].Science,1999,284(5413):482‑485.)。非共价连接基因序列有两对，分别位于模块2的C端(M2‑C)、模块3的N端(M3‑N)，以及模块4的C端(M4‑C)、模块5的N端(M5‑N)，且两两分别特异识别连接。同理，分析界定雷帕霉素聚酮合酶非共价连接序列有2对，分别为RapA‑C、RapB‑N以及RapB‑C、RapC‑N；他克莫司聚酮合酶非共价连接序列有2对，分别为FkbB‑C、FkbC‑N以及FkbC‑C、FkbA‑N。这些连接酶肽段分子具有SEQIDNO:1～SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。各连接基因的核酸序列如SEQIDNO:13～SEQIDNO:24所示。[0061] M2‑C氨基酸序列(SEQIDNO:1)：[0062] GTEVRGEAPSALAGLDALEGALPEVPATEREELVQRLERMLAALRPVAQAADASGTGANPSGDDLGEAGVDELLEALGRELDGD[0063] M3‑N氨基酸序列(SEQIDNO:2)：[0064] MTDSEKVAEYLRRATLDLRAARQRIRELESD[0065] M4‑C氨基酸序列(SEQIDNO:3)：[0066] FAASPAVDIGDRLDELEKALEALSAEDGHDDVGQRLESLLRRWNSRRADAPSTSAISEDASDDELFSMLDQPFGGGEDL[0067] M5‑N氨基酸序列(SEQIDNO:4)：[0068] MSGDNGMTEEKLRRYLKRTVTELDSVTARLREVEHRAGE[0069] RapA‑C氨基酸序列(SEQIDNO:5)：[0070] FAPAEPEPRLHEQELRRALAGISIDKFREAGVLDTLLRLAAMEGLAVPKPDSESDDEAFVDEMDADALIKHVLEEER[0071] RapB‑N氨基酸序列(SEQIDNO:6)：[0072] MREDQLLDALRKSVKENARLRKANTSLRAAMD[0073] RapB‑C氨基酸序列(SEQIDNO:7)：[0074] MNPRVQSTTLLAEIDRIEKMFTSVTFDDRQASAIKDRLSSVLNKWQRISSPEEVSTTALSSASASEILDFIDREFGDPTA[0075] RapC‑N氨基酸序列(SEQIDNO:8)：[0076] MPEQDKVVEYLRWATAELHTTRAKLEALAAANT[0077] FkbB‑C氨基酸序列(SEQIDNO:9)：[0078] LTLLAPDGNGTPVGGEPPAQVSVGAPATDSEVASPDDELIDDMDADALIAHVLKG[0079] FkbC‑N氨基酸序列(SEQIDNO:10)：[0080] MAENDLIEALRTSVKDNAQLRRENTALRAAAN[0081] FkbC‑C氨基酸序列(SEQIDNO:11)：[0082] DRIGELLSPDDPVTVVLAQLDRLEALVAGVDPGARQADAIGTRLDALLNRWRRETRPTTPAGVLSADATADEIFDLIDRELR[0083] FkbA‑N氨基酸序列(SEQIDNO:12)：[0084] MPEQDKTVEYLRWATTELQRTRAELAAHS[0085] M2‑C核酸序列(SEQIDNO:13)：[0086] ggtactgaagttagaggtgaagcaccatctgctttggcaggtttagatgctttggaaggtgcattaccagaagttccagctacagaaagagaagaattggttcaaagattggaaagaatgttagctgcattaagaccagttgctcaagctgcagatgcatctggtactggtgctaatccatcaggtgacgatttgggtgaagcaggtgttgatgaattgttagaagctttaggtagagaattggatggtgac[0087] M3‑N核酸序列(SEQIDNO:14)：[0088] atgactgattctgaaaaggttgcagaatatttgagaagagctacattggatttgagagctgcaagacaaagaattagagaattggaatcagat[0089] M4‑C核酸序列(SEQIDNO:15)：[0090] tttgctgcatctccagcagttgatattggtgacagattggatgaattggaaaaggctttggaagcattgtcagctgaagatggtcatgatgatgttggtcaaagattggaatctttgttaagaagatggaactctagaagagctgatgcaccatctacttcagcaatttctgaagatgcttcagatgatgaattgttttctatgttggatcaaagatttggtggtggtgaagatttg[0091] M5‑N核酸序列(SEQIDNO:16)：[0092] atgtcaggtgacaatggtatgactgaagaaaagttgagaagatatttgaagagaactgttacagaattggattctgttacagcaagattaagagaagttgaacatagagctggtgaa[0093] RapA‑C核酸序列(SEQIDNO:17)：[0094] ttcgcaccggcagaaccggaaccgcgcctgcatgaacaggaactgcgccgtgcactggccggtattagcattgataaatttcgtgaagcaggtgtgctggataccctgctgcgcctggcagcaatggaaggtctggcagtgccgaaaccggatagtgaaagtgatgatgaagcatttgtggatgaaatggatgccgatgcactgattaagcatgttctggaagaagaacgc[0095] RapB‑N核酸序列(SEQIDNO:18)：[0096] atgcgtgaagatcagctgctggatgccctgcgcaaaagcgtgaaagaaaatgcacgcctgcgtaaagccaataccagcctgcgtgcagcaatggat[0097] RapB‑C核酸序列(SEQIDNO:19)：[0098] atgaatccgcgcgttcagagcaccaccctgctggcagaaattgatcgcattgaaaaaatgtttaccagcgttacctttgatgatcgtcaggcaagcgccattaaggatcgtctgagcagcgtgctgaataagtggcagcgtattagcagcccggaagaagtgagcaccaccgcactgagcagtgcaagcgccagcgaaattctggattttattgatcgtgaatttggtgacccgaccgcc[0099] RapC‑N核酸序列(SEQIDNO:20)：[0100] atgccggaacaggataaagttgtggaatatctgcgttgggccaccgccgaactgcataccacccgcgccaaactggaagcactggcagccgcaaatacc[0101] FkbB‑C核酸序列(SEQIDNO:21)：[0102] ctgaccctgctggcaccggatggcaatggcaccccggttggtggtgaaccgccggcacaggtgagcgttggcgcacctgcaaccgatagcgaagttgcaagtccggatgatgaactgattgatgatatggatgcagatgcactgattgcacatgtgctgaaaggc[0103] FkbC‑N核酸序列(SEQIDNO:22)：[0104] atggcagaaaatgatctgattgaagccctgcgtaccagtgtgaaagataatgcccagctgcgccgtgaaaataccgccctgcgtgcagccgccaat[0105] FkbC‑C核酸序列(SEQIDNO:23)：[0106] gatcgcattggcgaactgctgagtccggatgacccggttaccgtggtgctggcacagctggatcgcctggaagcactggtggccggtgtggaccctggcgcacgtcaggctgatgccattggcacccgcctggatgccctgctgaatcgctggcgtcgcgaaacccgtccgaccaccccggcaggtgttctgagcgcagatgcaaccgccgatgaaatttttgatctgattgatcgcgaactgcgt[0107] FkbA‑N核酸序列(SEQIDNO:24)：[0108] atgccggaacaggataaaaccgttgaatatctgcgttgggcaaccaccgaactgcagcgcacccgtgccgaactggccgcacatagt[0109] 实施例2携带目标酶的人工蛋白骨架表达载体的构建[0110] 本实施例中所有核酸分子均通过PCR扩增获得，所用引物如表1中所示。所用引物均在擎科生物科技有限公司合成，所用肽段序列(M2C和M3N、M4C和M5N、RapA‑C和RapB‑N、RapB‑C和RapC‑N、FkbB‑C和FkbC‑N、FkbC‑C和FkbA‑N)均在金斯瑞生物科技有限公司合成(pERY1为携带有M2C和M3N合成基因的质粒，pERY2为携带有M4C和M5N合成基因的质粒，pET28a‑RAPS为携带有RapA‑C、RapB‑N、RapB‑C、RapC‑N合成基因的质粒，pET28a‑FK506为携带有FkbB‑C、FkbC‑N、FkbC‑C、FkbA‑N合成基因的质粒)。所用荧光蛋白基因均在通用生物科技有限公司合成(pET28a‑EGFP为携带有EGFP基因的质粒，pET28a‑mCherry为携带有mCherry基因的质粒)。使用的DNA聚合酶购于NEB公司(Q5DNApolymerase，M0491L)，DNA纯化试剂盒购于OmegaBio‑Tek公司(Gel&PCRCleanUpkitD2000，OmegaBio‑Tek)，多片段克隆试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司(VazymeC115)，质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司(DP103，TIANGEN)，限制性内切酶购于ThermoScientific公司，质粒测序均在擎科生物科技有限公司完成。[0111] 表1[0112][0113][0114][0115] 质粒具体构建方法如下：[0116] 1)pYJ407质粒构建：[0117] 用pYJ405‑1‑F/405‑1‑R引物对从质粒pERY1中扩增M3N片段，命名为F405‑1；用pYJ405‑2‑F/405‑2‑R引物对从质粒pFZ153(MaT,ZhouY,LiX,etal.GenomeminingofastaxanthinbiosyntheticgenesfromSphingomonassp.ATCC55669forheterologousoverproductioninEscherichiacoli[J].BiotechnologyJournal,2016,11(2):228‑237)中扩增CrtE基因片段，命名为F405‑2；用pYJ405‑3‑F/405‑3‑R引物对从质粒pERY2中扩增M4C片段，命名为F405‑3；pYJ405‑4‑F/405‑4‑R引物对从质粒pERY2中扩增M5N片段，命名为F405‑4；pYJ405‑5‑F/405‑5‑R引物对从质粒pFZ153中扩增CrtI+CrtB+Idi片段，命名为F405‑5；pYJ405‑6‑F/405‑6‑R引物对从质粒pERY1中扩增M2C片段，命名为F405‑6；pYJ405‑7‑F/405‑7‑R引物对从质粒pFZ153中扩增CrtY+CrtZ+CrtW+载体片段，命名为F405‑7。随后，用pYJ405‑1‑F/405‑3‑R引物对进行overlapPCR扩增，获得F405‑1、F405‑2和F405‑3的拼接片段F405‑OL1；用pYJ405‑4‑F/405‑6‑R引物对进行overlapPCR扩增，获得F405‑4、F405‑5和F405‑6的拼接片段F405‑OL2，最后，使用多片段克隆试剂盒对F405‑OL1、F405‑OL2和F405‑7进行三片段拼接，获得pYJ405质粒。用pYJ405‑2‑F/407‑1‑R引物对从质粒pYJ405中扩增M3N+CrtE+M4C片段，命名为F407‑1；用407‑2‑F/407‑2‑R引物对从质粒pFZ153中扩增rtI片段，命名为F407‑2；用407‑3‑F/407‑3‑R引物对从质粒pERY2中扩增M5N，命名为F407‑3；用407‑4‑F/1536‑1‑R引物对从质粒pYJ405中扩增rtB片段，命名为F407‑4；用1536‑2‑F/1536‑2‑R引物对从质粒pYJ405中扩增M2C+IDI+CrtY+CrtZ片段，命名为F407‑5；用1536‑3‑F/pYJ405‑1‑R引物对从pYJ405质粒中扩增CrtW+载体片段，命名为F407‑6。之后用pYJ405‑2‑F/1536‑1‑R引物对进行overlapPCR扩增，获得F407‑1、F407‑2、F407‑3和F407‑4的拼接片段F407‑OL。最后，使用多片段克隆试剂盒，对F407‑OL、F407‑5和F407‑6片段进行拼接，获得pYJ407质粒(图2A)。[0118] 2)pYJ408质粒构建：[0119] 用pYJ408‑1‑F/1536‑1‑R引物对从质粒pFZ153中扩增出CrtE+CrtI+CrtB片段，命名为F408‑1；用1536‑2‑F/pYJ408‑2‑R引物对从质粒pFZ153中扩增出Idi+CrtY片段，命名为F408‑2；用pYJ408‑3‑F/pYJ408‑3‑R引物对从质粒pERY1中扩增出M2C片段，命名为F408‑3；用pYJ408‑4‑F/pYJ408‑4‑R引物对从质粒pYJ407中扩增出M3N片段，命名为F408‑4；用pYJ408‑5‑F/pYJ408‑5‑R引物对从质粒pYJ407中扩增出CrtZ片段，命名为F408‑5；用pYJ408‑6‑F/pYJ408‑6‑R引物对从质粒pYJ407中扩增出M4C片段，命名为F408‑6；用pYJ408‑7‑F/pYJ408‑7‑R引物对从质粒pYJ407中扩增出M5N片段，命名为F408‑7；用pYJ408‑8‑F/pYJ408‑8‑R引物对从质粒pFZ153中扩增出载体片段，命名为F408‑8。之后用pYJ408‑1‑F/pYJ408‑2‑R引物对进行overlapPCR扩增，获得F408‑1、F408‑2的拼接片段F408‑OE；用pYJ408‑3‑F/pYJ408‑7‑R引物对进行overlapPCR扩增，获得F408‑3、F408‑4、F408‑5、F408‑6和F408‑7的拼接片段F408‑OL。最后，使用多片段克隆试剂盒，对F408‑OE、F408‑OL、F408‑8片段进行拼接，获得pYJ408质粒(图2B)。[0120] 3)pXS33质粒构建：[0121] 用pXS33‑1‑F/R引物对从pET28a‑RAPS质粒中扩增RapB‑N片段，命名为33F1；用pXS33‑2‑F/R引物对从pFZ153质粒中扩增CrtE‑CrtI‑CrtB‑Idi片段，命名为33F2；用pXS33‑3‑F/R引物对从pET28a‑RAPS质粒中扩增RapA‑C片段，命名为33F3；用pXS33‑4‑F和pLS12‑11‑R引物对从pFZ153质粒中扩增CrtY‑CrtW‑CrtZ片段，命名为33F4；用pLS12‑12‑F和pXS33‑5‑R引物对从pFZ153质粒中扩增质粒载体片段，命名为33F5。之后用pXS33‑1‑F/pXS33‑2‑R引物对33F1和33F2进行overlapPCR扩增，获得33OE1片段；用pXS33‑3‑F/pLS12‑11‑R引物对对33F3和33F4进行overlapPCR扩增，获得33OE2片段。最后，使用Gibson组装的方法对33OE1、33OE2和33F5片段进行克隆，获得pXS33质粒(图2C)。[0122] 4)pXS35质粒构建：[0123] 用pXS35‑1‑F/R引物对从pET28a‑FK506质粒中扩增FkbC‑N片段，命名为35F1；用pXS35‑3‑F/R引物对从pET28a‑FK506质粒中扩增FkbB‑C片段，命名为35F3。之后用pXS35‑1‑F/pXS33‑2‑R引物对35F1和33F2进行overlapPCR扩增，获得35OE1片段；用pXS35‑3‑F/pLS12‑11‑R引物对对35F3和33F4进行overlapPCR扩增，获得35OE2片段。最后，使用Gibson组装的方法对35OE1、35OE2和33F5片段进行克隆，获得pXS35质粒(图2D)。[0124] 5)pXS36质粒构建：[0125] 用pXS33‑1‑F/R引物对从pET28a‑RAPS质粒中扩增RapB‑N片段，命名为33F1；用pXS33‑3‑F/R引物对从pET28a‑RAPS质粒中扩增RapA‑C片段，命名为33F3；用pXS33‑4‑F和pLS12‑11‑R引物对从pFZ153质粒中扩增CrtY‑CrtW‑CrtZ片段，命名为33F4；用pLS12‑12‑F和pXS33‑5‑R引物对从pFZ153质粒中扩增质粒载体片段，命名为33F5；用pXS33‑2‑F/pXS36‑2‑R引物对从pFZ153质粒中扩增CrtE片段，命名为36F2；用pXS36‑3‑F/R引物对从pET28a‑RAPS质粒中扩增RapB‑C片段，命名为36F3；用pXS36‑4‑F/R引物对从pFZ153质粒中扩增CrtI片段，命名为36F4；用pXS36‑5‑F/R引物对从pET28a‑RAPS质粒中扩增RapC‑N片段，命名为36F5；用pXS36‑6‑F和pXS33‑2‑R引物对从pFZ153质粒中扩增CrtB‑CrtI片段，命名为36F6。之后用pXS33‑1‑F/pXS36‑4‑R引物对33F1、36F2、36F3和36F4进行overlapPCR扩增，获得36OL1片段；用pXS36‑5‑F/pLS12‑11‑R引物对对36F5、36F6、33F3和33F4进行overlapPCR扩增，获得33OL2片段。最后，使用Gibson组装的方法对36OL1、36OL2和33F5片段进行克隆，获得pXS36质粒(图2E)。[0126] 6)pXS38质粒构建：[0127] 用pXS35‑1‑F/R引物对从pET28a‑FK506质粒中扩增FkbC‑N片段，命名为35F1；用pXS35‑3‑F/R引物对从pET28a‑FK506质粒中扩增FkbB‑C片段，命名为35F3；用pXS33‑4‑F和pLS12‑11‑R引物对从pFZ153质粒中扩增CrtY‑CrtW‑CrtZ片段，命名为33F4；用pLS12‑12‑F和pXS33‑5‑R引物对从pFZ153质粒中扩增质粒载体片段，命名为33F5；用pXS38‑3‑F/R引物对从pET28a‑FK506质粒中扩增FkbC‑C片段，命名为38F3；用pXS38‑5‑F/R引物对从pET28a‑FK506质粒中扩增FkbA‑N片段，命名为38F5。之后用pXS35‑1‑F/pXS36‑4‑R引物对对35F1、36F2、38F3、和36F4进行overlapPCR扩增，获得38OL1片段；用pXS38‑5‑F/pLS12‑11‑R引物对对38F5、36F6、35F3和33F4进行overlapPCR扩增，获得38OL2片段。最后，使用Gibson组装的方法对38OL1、38OL2和33F5片段进行克隆，获得pXS38质粒(图2F)。[0128] 7)pLS22质粒构建：[0129] 用pYJ405‑2‑F/pYJ405‑5‑R引物对从pFZ153质粒中扩增CrtE‑CrtI‑CrtB‑Idi片段，命名为22F1；用pYJ405‑6‑F/pLS12‑11‑R引物对从pYJ407质粒中扩增M3N‑CrtY‑CrtZ‑CrtW片段，命名为22F2；用pLS12‑12‑F/pYJ405‑1‑R引物对从pYJ407质粒中扩增载体，命名为22F3。之后，使用Gibson组装的方法对22F1、22F2和22F3片段进行克隆，获得pLS22质粒(图2G)。[0130] 8)pQC005质粒构建：[0131] 用F005‑1F/F005‑1R引物对从pYJ407质粒中扩增M3N片段，命名为F005‑1；用F005‑2F/F005‑2R引物对从pFZ153质粒中扩增CrtE片段，命名为F005‑2；用F005‑3F/F005‑3R引物对从pET28a‑EGFP质粒中扩增EGFP片段，命名为F005‑3；用F005‑4F/F005‑4R引物对从pFZ153质粒中扩增载体，命名为F005‑4。之后，使用Gibson组装的方法对F005‑1、F005‑2、F005‑3和F005‑4片段进行克隆，获得pQC005质粒(图2H)。[0132] 9)pQC006质粒构建：[0133] 用F006‑1F/F006‑1R引物对从pET28a‑mCherry质粒中扩增mCherry片段，命名为F006‑1；用F006‑2F/F006‑2R引物对从pYJ407质粒中扩增M2C片段，命名为F006‑2；用F006‑3F/F006‑3R引物对从pFZ81质粒(MaT,ZhouY,LiX,etal.Genomemining ofastaxanthinbiosyntheticgenesfromSphingomonassp.ATCC55669forheterologousoverproductioninEscherichiacoli[J].BiotechnologyJournal,2016,11(2):228‑237)中扩增载体，命名为F006‑3。之后，使用Gibson组装的方法对F006‑1、F006‑2和F006‑3片段进行克隆，获得pQC006质粒(图2I)。[0134] 10)pQC007质粒构建：[0135] 用F007‑1F/F007‑1R引物对从pYJ407质粒中扩增M5N片段，命名为F007‑1；用F007‑4F/F007‑4R引物对从pFZ153质粒中扩增载体，命名为F007‑4。之后，使用Gibson组装的方法对F007‑1、F005‑2、F005‑3和F007‑4片段进行克隆，获得pQC007质粒(图2J)。[0136] 11)pQC008质粒构建：[0137] 用F006‑1F/F008‑1R引物对从pET28a‑mCherry质粒中扩增mCherry片段，命名为F008‑1；用F008‑2F/F008‑2R引物对从pYJ407质粒中扩增M4C片段，命名为F008‑2；之后，使用Gibson组装的方法对F008‑1、F008‑2和F006‑3片段进行克隆，获得pQC008质粒(图2K)。[0138] 12)pQC009质粒构建：[0139] 用F005‑4F/F005‑2R引物对从pFZ153质粒中扩增载体，命名为F009‑2。之后，使用Gibson组装的方法对F005‑3和F009‑2片段进行克隆，获得pQC009质粒(图2L)。[0140] 13)pQC010质粒构建：[0141] 用F006‑1F/F010‑1R引物对从pET28a‑mCherry质粒中扩增mCherry片段，命名为F010‑1；用F010‑2F/F006‑3R引物对从pFZ81质粒中扩增载体，命名为F010‑2；之后，使用Gibson组装的方法对F010‑1和F010‑2片段进行克隆，获得pQC010质粒(图2M)。[0142] 实施例3合成虾青素的大肠杆菌突变株的构建[0143] 为了开发DEBS‑EAL人工蛋白骨架技术及探究其适用性，本实施例设计构建了一系2+列大肠杆菌突变株。在菌株构建中，均是采用Ca 化学转化的方法(《分子克隆实验指南》(第三版)：大肠杆菌感受态细胞的制备及转化)将含有不同基因的质粒转化到大肠杆菌中。首先将pFZ81和pMH1转化到大肠杆菌BL21(DE3)，制备含有质粒pFZ81和pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，随后将目标质粒转化到上述感受态细胞，涂布含有卡那霉素(50mg/L)、氯霉素(34mg/L)和氨苄青霉素(100mg/L)的LA平板，37℃生化培养箱过夜培养。本实施例中制备感受态所用的CaCl2、甘油等试剂均购于国药集团，所用抗生素均购于生工生物工程有限公司。[0144] A1菌株构建：将质粒pFZ153转化到含有质粒pFZ81和pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得大肠杆菌突变株A1(图3)。[0145] A2菌株构建：将质粒pYJ408转化到含有质粒pFZ81和pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得同时含有CrtYM2C、CrtZM3N‑M4C、CrtWM5N的大肠杆菌突变株A2(图3)。[0146] A3菌株构建：将质粒pYJ407转化到含有质粒pFZ81和pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得同时含有IdiM2C、CrtEM3N‑M4C、CrtBM5N的大肠杆菌突变株(图3)。[0147] A4菌株构建：将质粒pXS36转化到含有质粒pFZ81和pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得同时含有IdiRapA‑C、CrtERapB‑N‑RapB‑C和CrtBRapC‑N的大肠杆菌突变株A4(图3)。[0148] A5菌株构建：将质粒pXS38转化到含有质粒pFZ81和pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得同时含有IdiFkbB‑C、CrtEFkbC‑N‑FkbC‑C和CrtBFkbA‑N的大肠杆菌突变株A5(图3)。[0149] A6菌株构建：将质粒pLS22转化到含有质粒pFZ81和pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得同时含有IDIM2C、CrtEM3N的大肠杆菌突变株A6(图3)。[0150] A7菌株构建：将质粒pXS33转化到含有质粒pFZ81和pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得同时含有IdiRapA‑C、CrtERapB‑N的大肠杆菌突变株A7(图3)。[0151] A8菌株构建：将质粒pXS35转化到含有质粒pFZ81和pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得同时含有IdiFkbB‑C、CrtEFkbC‑N的大肠杆菌突变株A8(图3)。[0152] 实施例4合成虾青素的大肠杆菌突变株的发酵[0153] 为了评估引入人工蛋白骨架对虾青素代谢合成的影响，将实施例3中构建好的菌株A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8培养后，挑取单菌落，接种到含有卡那霉素(50mg/L)、氯霉素(34mg/L)和氨苄青霉素(100mg/L)的10mLLB培养基，37℃，220rpm过夜培养，获得种子液。将种子液按1％的接种量转接到200mL含有相应抗生素的LB培养基中，30℃，200rpm培养。待OD600达到0.7‑0.9时，加入终浓度0.1mMIPTG(异丙基‑β‑d‑硫代半乳糖苷)(购于生工生物工程有限公司)诱导表达。[0154] 实施例5虾青素的提取、检测及定量[0155] 本实施例中所用甲醇和丙酮购于国药集团，乙腈和三氟乙酸购于Thermo公司，虾青素标准品(A141428)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。[0156] 将实施例4中取样的发酵液(2mL)离心收集，在避光环境中以1:4(v:v)甲醇和丙酮涡旋提取虾青素，直至菌体无色。萃取液以13,000rpm离心10min，取上清至样品瓶中，进行HPLC检测。使用Agilent高效液相系统(1260)，配置色谱柱AgilentC18(5μm×150mm×4.6mm)进行虾青素检测及定量。样品采用流动相A(H2O，0.1％三氟乙酸)和B(乙腈，0.1％三氟乙酸)，流速为1.0mL/min，按如下梯度进行洗脱：0min，50％B；5min，100％B；23min，100％B；24min，50％B；30min，50％B。柱温为25℃，检测波长474nm。根据峰面积，定量分析虾青素产量。检测结果表明，同对照菌株A1(5mg/gDCW)相比，在携带细胞膜酶(A2)或同时携带细胞质酶和细胞膜酶(A3、A4、A5和A6)的人工蛋白骨架表达的突变株中，虾青素的产量均有提高，其中A2菌株虾青素产量提高46％(7.3mg/gDCW)，A3菌株虾青素的产量提升尤为显著，达222％(16.1mg/gDCW)，A4菌株中虾青素产量提高148％(12.4mg/gDCW)，A5菌株中虾青素产量提高127％(11.3mg/gDCW)(图4A)。另外，仅单独一对识别肽在使用时亦有提高产量的效果，其中A6菌株虾青素产量提高139％(12.0mg/gDCW)，A7菌株虾青素的产量提高114％(10.7mg/gDCW)，A8菌株中虾青素产量提高137％(11.9mg/gDCW)(图4B)。[0157] 实施例6DEBS‑EAL识别肽特异识别连接的共定位表达菌株构建[0158] 本实施例设计构建了一系列大肠杆菌突变株。在菌株构建中，均是采用Ca2+化学转化的方法《( 分子克隆实验指南》(第三版)：大肠杆菌感受态细胞的制备及转化)将含有不同基因的质粒转化到大肠杆菌中。首先将pMH1转化到大肠杆菌BL21(DE3)，制备含有质粒pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，随后将目标质粒转化到上述感受态细胞，涂布含有卡那霉素(50mg/L)、氯霉素(34mg/L)和氨苄青霉素(100mg/L)的LA平板，37℃生化培养箱过夜培养。本实施例中制备感受态所用的CaCl2、甘油等试剂均购于国药集团，所用抗生素均购于生工生物工程有限公司。[0159] A9菌株构建：将质粒pQC005和pQC006转化到含有质粒pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得大肠杆菌突变株A9(图3)。[0160] A10菌株构建：将质粒pQC007和pQC008转化到含有质粒pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得大肠杆菌突变株A10(图3)。[0161] A11菌株构建：将质粒pQC009和pQC010转化到含有质粒pMH1的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得大肠杆菌突变株A11(图3)。[0162] 实施例7DEBS‑EAL识别肽特异识别连接的共定位观察[0163] 本实施例中显微镜浸油为NikonImmersionOilF30cc(MXA22168)，擦镜纸为KimtechScienceKimwipes，世泰标准级显微镜盖玻片24*50mm(80340‑3610)购于Easybio/柏奥易杰公司，显微镜载玻片‑世泰标准级为国产，荧光观察使用NikonA1R激光共聚焦显微镜。[0164] 取培养好的菌株A9、A10和A11菌液于载玻片上，盖上盖玻片。选择100X(滴有浸油)物镜进行荧光观察，EGFP通道激发波长和发射波长分别为488/509nm，mCheery通道激发波长和发射波长分别为587/610nm。共聚焦显微镜成像结果表明，在表达融合蛋白Idi～mCherry‑M2C/CrtE～EGFP‑M3N的菌株中，红色荧光和绿色荧光主要聚集在细胞两级，实现特异识别连接的共定位(图5中的图片b)，而在未引入识别肽的Idi～mCherry/CrtE～eGFP对照菌株中，红色荧光弥散在细胞质中(图5中的图片a)。同时，M4C‑M5N识别肽在大肠杆菌中也表现出红色荧光向细胞两级聚集现象(图5中的图片c)。由此表明，M2C‑M3N或M4C‑M5N识别肽均具有特异识别、连接、共定位的作用。

专利地区：广东

专利申请日期：2021-04-28

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114686452B