一种抗hu-OX40抗原的纳米抗体及其应用

专利名称：一种抗hu-OX40抗原的纳米抗体及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111558888.7

专利申请（专利权）人：安徽安科生物工程(集团)股份有限公司
权利人地址：安徽省合肥市高新区海关路K-1

专利发明（设计）人：刘浩,许文娟,徐婷,周伟,崔智强,叶洪涛,鲍文英,范清林,宋礼华

专利摘要：本发明属于生物技术领域，具体一种抗hu‑OX40抗原的纳米抗体，所述抗体为单克隆纳米抗体，包括重链可变区；所述重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39所示氨基酸序列的任意一种或与其任意一种具有至少80％序列同一性的同源序列。本发明从已构成的大容量的全合成人源噬菌体抗体库中，筛选并优化获得了9株特异性的全人源抗人OX40纳米抗体A1、B7、C4、C7、C10、D1、D2、D7和D12，可以增强T效应细胞的免疫刺激、促进细胞因子的分泌，并在小鼠肿瘤模型中表现出了显著的肿瘤抑制效果。

主权利要求：
1.一种抗hu‑OX40抗原的纳米抗体，其特征在于：所述抗体为单克隆纳米抗体，包括重链可变区；所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1氨基酸序列为SEQIDNO:34、CDR2氨基酸序列为SEQIDNO:35、CDR3氨基酸序列为SEQIDNO:36。
2.根据权利要求1所述的抗hu‑OX40抗原的纳米抗体，其特征在于：所述单克隆纳米抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:11。
3.权利要求1所述的抗hu‑OX40抗原的纳米抗体，其特征在于：所述抗体是IgG1Fc、IgG2Fc和IgG4Fc融合形式。
4.一种双特异性分子或免疫交联物或嵌合抗原受体或基因改造T细胞受体或溶瘤病毒，包含权利要求1‑3中任一项所述抗体。
5.一种核酸，编码权利要求1‑3任一项所述抗体。
6.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体包括权利要求5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求1‑3所述抗体的核酸。
8.一种试剂盒，其包含权利要求1‑3所述的抗体。 说明书 : 一种抗hu‑OX40抗原的纳米抗体及其应用技术领域[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及与人OX40特异结合的抗体、及其制备和用途，尤其是其在治疗与OX40相关疾病中的用途，例如癌症等。背景技术[0002] 抗体库技术的出现为人源抗体的开发提供了一条新的途径，Winter等在1994年就创建了噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，而且不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全利用基因工程技术制备人源性抗体。其中GeorgeP.Smith是噬菌体展示技术的搭建者，其创造性的开创了这个技术的平台化方法，而GregoryP.Winter利用此技术开发了第一个全人的抗体药物，用于治疗类风湿性关节炎，银屑病等，也就是大名鼎鼎的药王阿达木单抗。[0003] 噬菌体抗体库技术具有多个快优获取人源性抗体的优势，噬菌体展示技术是复制生物的某单一性状多样性和选择单一筛选压力进行相互作用，有目的的获得能够适应该筛选压力的性状的技术；其主要技术原理是通过大肠杆菌丝状噬菌体M13的基因工程改造复制生物的抗体的遗传基因的多样性，并将基因编码的抗体和噬菌体的膜蛋白融合展示在噬菌体表面，选择适当的筛选压力，从而有目的的得到和该特定靶点蛋白结合的抗体及其遗传信息的技术。[0004] OX40(也称为CD134、TNFRSF4和ACT35)最初被描述为大鼠CD4T细胞上的T细胞激活标志物，并且随后显示为在TCR招募中被上调。OX 40(CD134)是TNFR超家族成员之一，为I型跨膜糖蛋白，并与其他TNF受体家族成员如CD30、4‑1BB等成簇排列在人染色体h36的远侧带。但OX40表达于活化的T细胞表面，且主要是CD4+T细胞，CD8+T细胞表面有少量表达，在癌症中，在肿瘤浸润淋巴细胞中发现了表达OX40的活化T细胞，而OX40及其配体OX40L在诱导及维持T细胞反应中起关键作用，因此OX40成为肿瘤免疫治疗的一个重要靶点。此外，OX40与OX40L节结合后可对炎性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤以及移植免疫的发生发展中起非常重要的调控作用。虽然OX40作为二代免疫检查点的代表性靶点成为研究的热点，但是并没有针对OX40的药物上市，虽然早期布局的国外药企的多个抗OX40的单抗在临床实验中遇到不同问题而终止，但仍有众多药企争相进入OX40靶点抗体类药物生物类似药及创新制品研发领域。[0005] OX40和OX40L的相互作用能够在OX40的胞内区域内招募TNFR相关(TRAFs)分子，形成包含IKKα和IKKβ以及PI3k和PKB(Akt)的信号传导复合物；OX40还与TCR信号协同作2+用，通过未知机制增强细胞内Ca ，从而增强NFAT入核。OX40可激活经典的NF‑κB1途径或非经典的NF‑κB2途径、PI3k/PKB和NFAT途径，进而调控制T细胞分裂和存活的基因，以及促进细胞因子基因的转录以及细胞因子受体的表达，对于细胞存活至关重要。OX40信号传导会引起包括CTLA‑4和Foxp3的下调。[0006] 靶向OX40的药物与其他疗法的组合也有相关研究和评估。在临床前模型中，与抗OX40和抗CTLA‑4联合治疗可显著提高CD4+和CD8+T细胞的增殖和活性，与抗OX40单药治疗相比，可转化为更好的治疗结果。当联合使用抗PD‑1和/或抗PD‑L1时，抗OX40显著增加了dLN和肿瘤自身分化T细胞的扩张和效应器特性，CD8+/Treg比值增加，表现为肿瘤迅速萎缩和持久反应。在另一个小鼠模型中，与对照组相比，抗OX40和靶向CD73(在TME中负责免疫抑制和促血管生成)的联合治疗使生存期延长，免疫应答和肿瘤反应增强。与抗PD‑1和抗OX40单药治疗相比，给予ATOR‑1015可使小鼠膀胱癌模型的生存期延长、肿瘤缩小以及完全缓解率提高。当OX40与其配体OX40L结合时，有助于提高免疫系统应答能力：1.增加效应T细胞和记忆T细胞的存活和扩增，增加细胞因子(例如IL‑2和IFN‑γ)的分泌；2.降低Tregs的免疫抑制活性，进一步放大T细胞活化效应。在肿瘤微环境中，免疫激活可导致OX40表达，可增强效应T细胞的活化和增殖，并抑制Tregs，从而导致复杂的抗肿瘤免疫反应。[0007] 以OX40为靶点的药物对免疫细胞的调节和抗肿瘤活性已在一些临床前癌症模型中得到证实。在携带B细胞淋巴瘤的小鼠模型中，将刺激APC的TLR9激动剂与OX40小鼠单克隆抗体和/或抗CTLA4抗体联合给药，均可有效地根除大部分全身和中枢神经系统(CNS)转移，并减少注射部位肿瘤特异性Treg，即使剂量低于全身治疗。这些结果更令人印象深刻的是，三种药物联合使用，肿瘤特异性Treg减少，并治愈了大多数小鼠。在这项研究中，肿瘤内注射与全身注射相比产生了完全而持久的反应，并且似乎改善了免疫记忆，因为在注入新的淋巴瘤细胞系后，局部治疗的小鼠不会复发，并且对中枢神经系统的转移有抵抗力。发明内容[0008] 本发明的目的在于提供一种全人源抗人huOX40单克隆纳米抗体，可以增强T效应细胞的免疫刺激、促进细胞因子的分泌，并在小鼠肿瘤模型中表现出了显著的肿瘤抑制效果。[0009] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种抗hu‑OX40抗原的纳米抗体，所述抗体为单克隆纳米抗体，包括重链可变区；所述重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含SEQIDNO:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39所示氨基酸序列的任意一种或与其任意一种具有至少80％序列同一性的同源序列。本发明从已构成的大容量的全合成人源噬菌体抗体库中，筛选并优化获得了9株特异性的全人源抗人OX40纳米抗体A1、B7、C4、C7、C10、D1、D2、D7和D12。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体具有激动剂活性。上述抗体均能在ELISA水平结合人源OX40，部分能在细胞水平结合人源OX40。优选抗体D2和D7能够刺激CD4+T细胞的细胞因子分泌。[0010] 所述huOX40单克隆纳米抗体为A1(重链可变区包括SEQIDNO:4所示)，B7(重链可变区包括SEQIDNO:5所示)，C4(重链可变区包括SEQIDNO:6所示)，C7(重链可变区包括SEQIDNO:7所示)，C10(重链可变区包括SEQIDNO:8所示)，D1(重链可变区包括SEQIDNO:9所示)，D2(重链可变区包括SEQIDNO:10所示)，D7(重链可变区包括SEQIDNO:11所示)，D12(重链可变区包括SEQIDNO:12所示)。[0011] 所述抗体是IgG1、IgG2Fc和IgG4Fc融合形式。其分离的抗体或其抗原结合部分，其中A1、D1、D2、D7可在细胞水平与人OX40结合。其分离的抗体或其抗原结合部分，其中D2、D7可刺激人CD4+T细胞分泌IL‑2和IFN‑γ。[0012] 在一些实施方案中，抗OX40抗体的激动剂活性由OX40信号传导(例如监测NFκB下游信号传导)来评估。因此，本发明提供了与用IgG1对照抗体相比，提高NFκB介导的转录活性水平的抗OX40抗体或其片段。优选地，与相应的对照IgG1相比，本发明的抗OX40抗体或其片段能够将NFκB介导的转录活性水平提高数倍。[0013] 在一些实施方案中，本发明的抗OX40纳米抗体相比已知的抗OX40抗体具有更好的抗肿瘤活性，例如相比于IgG1对照或已知的抗OX40抗体，本发明的抗OX40抗体能够降低受试者中的肿瘤体积，优选地同时不影响受试者的体重。[0014] 本发明中通过淘筛获得的抗体分子均是VHH形式的，这种形式可以通过本领域的技术人员熟知的基因工程技术方便地进一步转换成Fc融合蛋白以及与共同轻链组合成IgG抗体等其他形式。[0015] 本发明的纳米抗体在各项评价中均为IgG1Fc融合形式，也可以是IgG2和IgG4Fc融合形式。[0016] 本发明中优选地抗人OX40单克隆抗体D7‑Fc，通过SPR法分析测定，其以1.68×‑810 平衡解离常数KD(M)结合huOX40。[0017] 本发明涉及的Fc区，以及人OX40序列是直接或间接从人体得到的。所述的直接方法包括但不限于基因组DNA克隆或cDNA文库。所述的间接方法包括但不限于Genbank或其他出版物或网站提供的生物信息为基础部分，合成或完全从头合成完整的DNA。DNA合成技术包括但不限于以PCR为基础的DNA合成方法。[0018] 为了获得稳定的纳米Fc抗体融合蛋白，可以把编码VHH区的DNA整合到重链的恒定区。重链恒定区可以从以下几种中选择，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD。优先选择的是IgGl的恒定区。[0019] 全人源抗人huOX40单克隆纳米抗体，所述抗体能特异性地与人huOX40抗原结合；所述huOX40单克隆纳米抗体只包括重链；重链可变区包括SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9所示氨基酸序列的任意一种或与其任意一种具有至少80％序列同一性的同源序列。即包括上述的9个优选的全人源抗人OX40纳米抗体A1、B7、C4、C7、C10、D1、D2、D7和D12。[0020] 进一步，筛选候选药物的步骤如下：首先加入待筛选物质处理含有Jurkat‑OX40‑NFκB‑Luc和人CHO‑DG44‑FcγIIB细胞株的体系；然后加入荧光素酶检测试剂进行酶标检测；其中，若荧光检测值增加，说明该待筛选物质为候选药物。[0021] 作为可选择的实施方式，培养箱中培养的时间为为5‑20h，作为优选的实施方式，培养时间为18h。[0022] 为了探索抗OX40抗体生物活性测定的最优方法，本发明对检测时间以及细胞密度进行了摸索。作为可选择的实施方式中，作为可选择的实施方式，Jurkat‑OX40‑NFκB‑4 4Luc细胞的数目为1×10 ～5×10个/孔；作为优选的实施方式，CHO‑DG44‑FcγIIB细胞数4目为5×10个/孔。[0023] 本发明还涉及所述抗体的用途：本发明的抗hu‑OX40单克隆纳米抗体能识别人huOX40抗原。[0024] 本发明所述全人源抗huOX40单克隆纳米抗体，部分可以阻断OX40L与OX40结合。[0025] 为了表达本发明所述的抗体或抗体的片段，可以把其相应的重链编码序列插入到表达载体的转录和翻译控制序列之间。本发明所述的表达载体包含调控序列如启动子、增强子等。所述的表达载体及其控制序列应当与受体细胞兼容。[0026] 本发明中纳米的表达可以通过瞬时表达或稳定表达来实现。该表达策略包括用一种或多种带有编码抗体重链DNA片段的表达载体转染哺乳动物细胞，从而使VHH重链在受体细胞中表达并组装,优选的表达方式是分泌到培养基中,可以用本领域技术人员熟知的层析等方法从中回收抗体。附图说明[0027] 图1为pCD‑OX40‑Avi‑His质粒构建图解；[0028] 图2为ELISA法测定9株抗人OX40纳米抗体的结合活性；[0029] 图3为FACS法测定9株抗人OX40纳米抗体在细胞水平的结合活性；[0030] 图4为ELISA法测定优选克隆D7阻断OX40L与OX40结合的活性；[0031] 图5为ELISA法测定优选克隆D7‑Fc与OX40的结合活性；[0032] 图6‑a为OX40纳米抗体促进CD4+T细胞释放IL‑2分泌；[0033] 图6‑b为OX40纳米抗体促进CD4+T细胞释放IFN‑γ分泌；[0034] 图7报告基因法检测OX40抗体的激动活性；[0035] 图8为SPR测定D7‑Fc纳米抗体的亲和力；[0036] 图9为OX40纳米抗体对体内移植瘤作用，其中9‑a为抗体对小鼠体重的影响，9‑b为抗体对肿瘤体积大小的影响，9‑c为各组单只小鼠肿瘤体积变化的变化；[0037] 图10‑a至10‑c分别为用分子排阻的方式检测A1‑Fc、D2‑Fc、D7‑Fc双特异性抗体纯度的示图。具体实施方案[0038] 以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。实施例不包括对传统方法的详细描述，如构建载体和质粒的方法等对于本领域中具有普通技术的人员所众所周知的。实施例中未注明的技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。[0039] 实施例1：膜表达人OX40稳转细胞株制备[0040] 全基因合成人OX40全长基因，包括信号肽、胞外段、跨膜区和胞内段，两端设置合适的酶切位点。使用酶切的方式，将OX40全长基因构建到真核表达载体GC‑ID(改造自pMH3质粒，杭州安普)，获得GC‑ID‑OX40质粒后转染到CHO‑DG44细胞中，从而构建膜表达人OX40稳转细胞株CHO‑DG44‑OX40，用于流式细胞检测OX40单抗的结合活性；同样的过程制备了Jurkat‑OX40‑NFκB‑Luc细胞，用于OX40抗体细胞水平结合OX40检测或OX40抗体NFκB细胞通路活化检测。[0041] 实施例2：rhOX40‑Avi‑His‑bio抗原蛋白制备[0042] 针对合成的OX40全长基因，设计合适的引物，将胞外段的免疫球蛋白可变区(IgV,29aa‑214aa)结构域构建到用于重组蛋白真核表达的载体pCD‑Avi‑His(改造自pCDNA3.1+，Invitrogen公司)中，获得真核表达质粒pCD‑OX40‑Avi‑His(图1)。图1为pCD‑OX40‑Avi‑His质粒构建图解，该质粒经转染进入真核细胞，可获得表达的rhOX40‑Avi‑His蛋白。[0043] 利用BirA生物素化酶将Biotin共价连接到含有Avi标签肽序列的rhOX40‑Avi‑His蛋白，完成生物素化酶标记，BiaA酶和Biotinsolution都来自GeneCopoeia公司，HitrapDesalting除盐柱来自GE公司，得到浓度较高，标记效率较好的rhOX40‑Avi‑His‑bio蛋白，用于抗体淘筛。[0044] 实施例3：OX40单抗筛选[0045] 利用制备好的rhOX40‑Avi‑His‑bio抗原蛋白，对3个本单位自建的全合成人源纳米抗体库进行3轮液相筛选，从第2和第3轮的细菌培养板上挑取大量的单克隆，制备可溶性纳米抗体。[0046] 实施例4：初筛抗体ELISA水平结合检测[0047] 将表达纯化的rhOX40‑Avi‑His蛋白稀释至1μg/ml铺96孔ELISA板并4℃冰箱过夜；第二天TPBS(PBS+0.1％Tween20)洗三遍，3％脱脂奶粉溶于TPBS，37℃封闭1小时；然后TPBS洗三遍，加可溶性表达上清，室温震荡温育2小时；TPBS洗三遍，加入1:5000稀释的Anti‑Flag‑HRP二抗(购自Sigma，货号A8592)，每孔100μl，室温震荡温育30min；TPBS洗三遍，每孔加入混有0.1％过氧化氢的OPD邻苯二胺(购自Sigma公司，货号78412)底物工作液100μl进行显色，约3‑7分钟后加入100μl1M硫酸终止，酶标仪(购自Biotek公司，货号ELX800)测定OD490值。[0048] 实施例5：9株纳米抗体的IgG1Fc融合形式真核表达质粒构建[0049] 用于抗体真核表达的载体为pCD‑VHH‑Fc，改造自pCDNA3.1+(Invitrogen公司)。针对纳米序列设计合适的引物，PCR体系为4μl2.5mM dNTPs，5μlFastPfuBuffer，1μlForwardPrimer，1μlReversePrimer，1μl FastPfuDNAPolymerase，适量的基因模板，以及ddH2O补齐到50μl，PCR反应程序为，95℃，2min；95℃20s，56℃20s，72℃15s，30cycles；72℃，5min。单一条带产物回收后使用BamHI和KpnI或BsiWI酶切，预混50μl的酶切体系，取适量的回收产物通过T4DNALigase(购自Thermo)将纳米抗体基因构建到IgG1Fc融合形式真核载体，瞬时共转染到Expi293悬浮细胞后，使用GE公司的ProteinA/MabselectSuRe亲和层析胶纯化瞬转后的上清液，得到9株抗体的纯蛋白。[0050] 实施例6：OX40纳米抗体Fc融合形式下(下称OX40纳米抗体)与OX40抗原结合[0051] 用ELISA法检测纳米抗体与抗原蛋白OX40的结合情况，将表达纯化的抗原蛋白rhOX40‑Avi‑His以1μg/ml浓度铺ELISA板并4℃放置过夜，第二天ELISA板用PBS+0.1％Tween20溶液冲洗3次，用PBS+3％脱脂奶粉溶液37℃封闭1h。用PBS+0.1％Tween20溶液冲洗3次，用浓度梯度的纳米抗体(首孔10μg/ml，5倍梯度稀释)与抗原结合，再用羊抗人Fc‑HRP的第二抗体孵育，OPD显色，1MH2SO4终止。显色ELISA板用酶标仪在OD490下读数，利用读数与浓度制图(图2，图5)。[0052] 实施例7：初筛候选纳米抗体细胞水平结合OX40检测[0053] 用流式细胞仪(FACS)法检测纳米抗体与表达于Jurkat细胞表面的OX40抗原的结合情况。将纳米抗体(首孔10μg/ml)与表达OX40抗原的Jurkat细胞系孵育，然后用带有荧光染料的羊抗人Fc‑FITC的第二抗体检测。在Beckman流式细胞仪上分析检测抗体的细胞结合。将数值与抗体浓度制图(图3)。其中A1、D1、D2和D7可在细胞水平结合OX40。[0054] 实施例8：OX40纳米抗体阻断活性检测[0055] 在ELISA水平检测OX40抗体是否可以阻断OX40L与OX40的结合；将OX40抗原以1μg/ml浓度铺板于96孔ELISA板，4℃静置过夜，第二天ELISA板用PBS+0.1％Tween20溶液冲洗3次，用PBS+3％脱脂奶粉溶液37℃封闭1h。用PBS+0.1％Tween20溶液冲洗3次，以10μg/ml的OX40L‑mouseFc为稀释buffer将D7‑Fc进行梯度稀释(首孔10μg/ml，5倍梯度稀释)，分别加入对应ELISA孔中室温孵育2h；再用羊抗鼠Fc‑HRP的第二抗体孵育1h，OPD显色，1MH2SO4终止。显色ELISA板用酶标仪在OD490下读数，利用读数与浓度制图(图4)。数据显示，D7‑Fc可以在ELISA水平阻断OX40L与OX40的结合，此外由于OX40L与OX40结合活性较低，阻断实验数据没有达到结合上限。[0056] 实施例9：亲和力常数测定[0057] 根据表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance，SPR)方法，利用T200分子间相互作用仪测定有潜力的优化后抗体OX40单抗的亲和力，具体操作如下：使用SA芯片(GE；BR‑1005‑31)，用PBS稀释生物素标记的抗原rhOX40‑Avi‑His‑bio至100ng/ml，抗原标记至200RU，每个样品测试7梯度，用PBS稀释D7‑Fc蛋白至：8μg/mL，4，0.5，0.1，0.02，0.004，0.0008，0。测试结合、解离和Glycine2.0(GE；BR‑1003‑55)再生条件。最后确定结合2分钟，解离10分钟，再生1分钟。计算纳米抗体D7‑Fc的平衡解离常数。如图8，浓度越高的曲线在浓度低的曲线上面，最下面一条曲线为baseline，理论浓度为0。测得D7‑Fc平衡解离常‑8数KD(M)值约为1.68×10 (图8)。[0058] 实施例10：本发明的抗OX40纳米抗体的激动剂活性[0059] 测试1：可溶性抗体T细胞活化测定法[0060] 测量T细胞活化后由T细胞释放的炎性细胞因子评估本发明的抗OX40抗体的激动剂活性。用抗‑CD3(0.25μg/ml)抗体(Biolegend)和抗‑OX40(6μg/ml)抗体包被96孔平底板(Corning),37℃孵育3小时。PBS洗涤后，将1.0+10E5个Jurkat‑OX40‑NFκB‑21C6细胞(含有2μg/ml抗‑CD28抗体)的加入到对应的96孔细胞培养板中；3天后，检测IL‑2分泌水平。[0061] 在如上测定法所述进行的实验中，优选抗体D2‑Fc和D7‑Fc比IgG1对照显著增加了IL‑2分泌，IFN‑γ的分泌量也有所提升，另外两个优选抗体A1和D1未能明显刺激Jurkat‑OX40‑NFκB‑21C6细胞的IL‑2和IFN‑γ分泌(图6‑a,图6‑b),数据说明D2‑Fc和D7‑Fc具有相对较强的激动剂活性。[0062] 测试2：荧光素酶报告基因T细胞活化测定法：[0063] 可以通过在荧光素酶报告基因测定法中测量NFκB介导的转录活化的促进来评估本发明的抗‑OX40抗体的激动剂活性。各收集一定数量的CHO‑DG44‑FcγIIB(44F10)和Jurkat‑OX40‑NFκB‑Luc(21C6)细胞置于离心管中，用理论buffer(含指定终浓度的CD3或CD28抗体)重悬细胞；将混合细胞加入白底96孔板中，每孔50uL；配制单抗稀释液：用理论buffer稀释抗体浓度至首孔浓度0.48μM，再做2倍梯度稀释，共10个梯度备用，加入上述铺有细胞的96孔板中，50μL/well；将上述细胞‑抗体混合悬液置于混匀仪上充分混合2min，随后放入CO2培养箱培养18h，提前1‑2h取出PromegaBio‑GloTMLuciferaseAssarySystem在避光条件下平衡至室温，取出96孔板室温平衡10min后加入80ulLuciferaseAssary，轻轻加入后室温避光反应3‑5min，上机检测RLU信号(图7)。[0064] 在如上实验方法中，测得优选抗体D7‑Fc与对照IgG1抗体相比，表现出了显著激动剂活性。[0065] 实施例11：本发明的抗OX40纳米抗体的纯度检测[0066] 用分子排阻的方式检测双特异性抗体的纯度，结果表明A1‑Fc的纯度较差，D2和D7的纯度较高，考虑聚体情况，D7分子的纯度更好。[0067] 实施例12：OX40纳米抗体在人源化小鼠肿瘤模型中展现抗肿瘤活性[0068] 使用OX40人源化C57小鼠模型来评价纳米抗体D7‑Fc抑制体内肿瘤生长的能力。从百奥赛图基因生物技术有限公司购买OX40人源化C57小鼠。在第七天，使用注射器给动6物皮下种植小鼠结肠癌细胞系MC38(1×10细胞/动物)，随后每周两次检测动物体重及肿3瘤大小。待肿瘤平均体积达到50mm后分组并开始IP给药，用OX40纳米抗体和对照抗体进行一周2次的给药处理，并一周2次测量肿瘤体积和称量动物体重，共给药四周。实验结果显示测试的OX40纳米抗体D7‑Fc能够比对照抗体更好地抑制肿瘤的生长(图9‑a，图9‑c)；并且整体实验均对小鼠体重没有产生明显的影响(图9b)。数据表明纳米抗体D7‑Fc在皮下小鼠MC38肿瘤模型中展示出了强有力的抗肿瘤活性。[0069] 本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何OX40抗体或其片段、方法和用途。

专利地区：安徽

专利申请日期：2021-12-20

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114656564B