一种合生元组合物及其制备方法发明专利

专利名称：一种合生元组合物及其制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210326813.4

专利申请（专利权）人：天津科技大学,山东泰山生力源集团股份有限公司
权利人地址：天津市滨海新区经济开发区十三大街29号

专利发明（设计）人：宋亚囝,张宛怡,包莉媛,李军训,王楠,罗学刚,张同存

专利摘要：本发明公开了一种合生元组合物的制备方法，所述方法包括：步骤一、以半乳甘露聚糖为底物，酶解获得含有单糖和甘露寡糖的混合液；步骤二、将干酪乳杆菌加入至所述混合液中培养并消耗单糖，冷冻干燥获得含有甘露寡糖和干酪乳杆菌的合生元组合物，所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LH23，保藏编号为CGMCCNo.16656。本发明利用干酪乳杆菌LH23处理掉混合液中的单糖，纯化得到甘露寡糖，并且，适宜的底物浓度和菌浓度，能够在完全消耗掉单糖的同时，还能够在冷冻干燥的过程中对干酪乳杆菌LH23起到最大的保护作用，大大提高了合生元组合物的冻干粉制剂中甘露寡糖纯度和活菌数量。

主权利要求：
1.一种合生元组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：步骤一、以半乳甘露聚糖为底物，酶解获得含有单糖和甘露寡糖的混合液；
所述底物的浓度为9‑20g/L；
所述酶解的步骤包括：向底物中先加入α‑半乳糖苷酶于36～38℃下反应6.5～7.5h，再加入β‑甘露聚糖酶于36～38℃下反应0.5～1.5h；
所述底物与α‑半乳糖苷酶的添加比例为底物：α‑半乳糖苷酶＝1g：45～55U；所述底物与β‑甘露聚糖酶的添加比例为底物：β‑甘露聚糖酶＝1g：600～700U；
步骤二、将干酪乳杆菌加入至所述混合液中培养并消耗单糖，冷冻干燥获得含有甘露寡糖和干酪乳杆菌的合生元组合物，所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）LH23，保藏编号为CGMCCNo.16656；
10
所述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LH23加入后，混合液中菌的浓度为2.4×10
10
～2.8×10 CFU/mL；
将干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）LH23加入至混合液中后，共同培养10～15h；
冷冻干燥的具体步骤包括：将重悬液放置于‑80℃冰箱中12h后取出，迅速放入预冷的‑
80℃冻干机中进行冷冻干燥12h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述半乳甘露聚糖来源于瓜尔豆胶或槐豆胶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述底物的浓度为10g/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LH23在加入前采用以下方法活化：将干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LH23接种至培养基中，于培养箱内活化10～
15h，反复活化三次后，再扩大培养10～15h，离心收集菌泥，并洗涤菌体。
5.如权利要求1‑4任一所述的方法制备获得的合生元组合物。 说明书 : 一种合生元组合物及其制备方法技术领域[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种合生元组合物及其制备方法。背景技术[0002] 益生元是促进益生菌生长繁殖的物质，合生元是益生菌与益生元的组合制剂，起到益生菌和益生元的双重作用，既可发挥益生菌的生理性细菌活性，又可选择性的增加这种菌的数量，使益生菌作用更显著持久。[0003] 甘露寡糖是一类功能性低聚糖，具有较好的稳定性、热值低以及安全无毒性等特点。甘露寡糖可被用作膳食纤维和益生元，它具有多种生理作用功能，如调节肠道微生态、促进有益菌的增值、减缓系统性炎症、提高机体免疫应答能力、吸附或结合霉菌毒素、降低血糖，血脂及胆固醇水平、具有减肥功效等。已有研究表明，功能性低聚糖作为冻干保护剂可增强乳酸菌对冻干损伤的抵御能力，从而提高其存活率。[0004] 干酪乳杆菌是重要的益生菌之一，它能够耐受有机体的防御机制，其中包括口腔中的酶、胃液中低PH值和小肠的胆汁酸等。所以干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用。同时，干酪乳杆菌具有高效降血压、降胆固醇，产生抗体免疫，增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等功能；还具有缓解乳糖不耐症、过敏等益生保健作用。由于干酪乳杆菌对其宿主营养、免疫、防病等具有显著的益生功效，越来越成为人们研究、开发、生产的重点。目前，干酪乳杆菌已被广泛地应用于营养保健、食品、医药等行业中。[0005] 专利CN111560A公开了一种干酪乳杆菌LH23，该干酪乳杆菌具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌的作用。然而，该干酪乳杆菌在制备合生元制剂特别是冻干粉剂时，其存活率较低，影响其功效发挥。发明内容[0006] 为了解决上述问题，本申请旨在提供一种具有显著提升的菌存活率，以更好地发挥益生菌和益生元双重功效的合生元组合物。[0007] 一方面，本申请提供了一种合生元组合物的制备方法，所述方法包括：[0008] 步骤一、以半乳甘露聚糖为底物，酶解获得含有单糖和甘露寡糖的混合液；[0009] 步骤二、将干酪乳杆菌加入至所述混合液中培养并消耗单糖，冷冻干燥获得含有甘露寡糖和干酪乳杆菌的合生元组合物，所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LH23，保藏编号为CGMCCNo.16656。[0010] 其中，本申请采用的干酪乳杆菌，名称为：LH23，分类名称为：Lactobacilluscasei，保藏编号为：CGMCCNo.16656，保藏日期为：2018年10月30日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。[0011] 进一步地，所述半乳甘露聚糖来源于瓜尔豆胶或槐豆胶。[0012] 进一步地，所述底物的浓度为4‑40g/L，优选8‑22g/L，更优选9‑20g/L，更优选10g/L。[0013] 进一步地，所述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LH23加入后，混合液中菌的浓10 11 10 10 10度为1×10 ～1.5×10 CFU/mL，优选1.3×10 ～3×10 CFU/mL，更优选2.4×10 ～2.8×1010 CFU/mL。[0014] 进一步地，所述步骤一中酶解的步骤包括：向底物中先加入α‑半乳糖苷酶于36～38℃下反应6.5～7.5h，再加入β‑甘露聚糖酶于36～38℃下反应0.5～1.5h。[0015] 进一步地，所述底物与α‑半乳糖苷酶的添加比例为底物：α‑半乳糖苷酶＝1(g)：45～55(U)。[0016] 进一步地，所述底物与β‑甘露聚糖酶的添加比例为底物：β‑甘露聚糖酶＝1(g)：600～700(U)。[0017] 进一步地，所述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LH23在加入前采用以下方法活化：[0018] 将干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LH23接种至培养基中，于培养箱内活化10～15h，反复活化三次后，再扩大培养10～15h，离心收集菌泥，并洗涤菌体。[0019] 进一步地，所述步骤二中，将干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LH23加入至混合液中后，共同培养10～15h。[0020] 另一方面，本申请还提供了采用上述方法制备获得的合生元组合物。[0021] 优选的，所述合生元组合物的剂型为冻干粉剂。[0022] 本申请的有益效果在于：[0023] 1、本发明提供的合生元组合物的制备方法，该方法先将干酪乳杆菌菌液离心获得菌泥，将洗涤后的菌泥重悬于成分包含单糖和甘露寡糖的混合液中共培养吸收利用掉单糖，再将重悬液进行冷冻干燥，得到合生元制剂，该合生元制剂含有甘露寡糖(益生元)和干酪乳杆菌LH23(益生菌)，使其同时具有益生菌和益生元的双重功效。[0024] 2、本发明在制备合生元组合物的过程中，利用干酪乳杆菌LH23处理掉混合液中的单糖，纯化得到甘露寡糖，即该方法还可以用于制备纯化的甘露寡糖；并且，在本申请的制备方法中，适宜的底物浓度和菌浓度，能够在完全消耗掉单糖的同时，还能够在冷冻干燥的过程中对干酪乳杆菌LH23起到最大的保护作用，大大提高了合生元组合物的冻干粉制剂中甘露寡糖纯度和活菌数量。[0025] 3、本发明的提供的制备工艺还具有操作简单、易于产业化应用等优点。附图说明[0026] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：[0027] 图1是本申请合生元组合物的制备方法的流程图；[0028] 图2是微生物发酵法制备甘露寡糖结果图，其中，G组为半乳糖，M组为甘露糖，对照组为含有单糖的半乳甘露聚糖酶解产物(底物浓度为10g/L，未加干酪乳杆菌LH23)，1组为10纯化得到的甘露寡糖(底物浓度为10g/L，混合液中干酪乳杆菌LH23的浓度为2.6×10 CFU/mL)。具体实施方式[0029] 为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。[0030] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0031] 下述实施例中的干酪乳杆菌LH23，保藏编号为CGMCCNo.16656，保藏日期为：2018年10月30日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。[0032] 下述实施例中，干酪乳杆菌活菌数的检测方法采用国标《GB4789.35‑2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中所述的方法进行，计算其存活率，存活率为冷冻干燥后的益生菌的总数与冷冻干燥前的益生菌总数的比值。[0033] 下述实施例中涉及的培养基如下：[0034] MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、酵母粉4g/L、柠檬酸氢三铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、MnSO40.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。[0035] MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、酵母粉4g/L、柠檬酸氢三铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、MnSO40.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L、琼脂20g/L。[0036] 实施例1[0037] 本实施例提供了一种合生元组合物，其制备方法包括以下步骤：[0038] 一、底物浓度的筛选[0039] (1)用蒸馏水分别配制浓度为2g/L、4g/L、10g/L、20g/L、40g/L的半乳甘露聚糖(槐豆胶或瓜尔豆胶)底物，每毫升底物先分别加入α‑半乳糖苷酶0.1U、0.2U、0.5U、1U、2U搅拌均匀并在37℃水浴锅中反应7h后，再分别加入β‑甘露聚糖酶1.325U、2.65U、6.625U、13.25U、26.5U搅拌均匀并在37℃水浴锅中反应1h，离心取上清得到5种不同浓度的含有单糖和甘露寡糖的混合液。[0040] (2)将干酪乳杆菌LH23接种至MRS液体培养基中在37℃培养箱中活化12h，反复活化三次后，再按照2％接种量将其转接至MRS液体培养基中在37℃培养箱中扩大培养12h，离10心收集菌泥，并用无菌生理盐水洗涤菌体，此时干酪乳杆菌LH23的浓度是2.6×10 CFU/mL。[0041] (3)将上述步骤(2)中得到的菌泥分别重悬于上述步骤(1)中得到的5种混合液中共同培养12h，菌泥(按未离心前体积)与混合液的体积比为0.5：1(V/V)，把菌接种到上述混10合液中之后，混合液中菌的浓度是1.3×10 CFU/mL，即得到5种含有甘露寡糖和干酪乳杆菌LH23的重悬液。[0042] (4)将上述步骤(3)中的5种含有甘露寡糖和干酪乳杆菌的重悬液进行冷冻干燥，具体步骤包括：将重悬液放置于‑80℃冰箱中12h后取出，迅速放入预冷的‑80℃冻干机中进行冷冻干燥12h。冻干后即得甘露寡糖和干酪乳杆菌LH23的合生元制剂。[0043] 对上述不同底物浓度获得的合生元制剂中干酪乳杆菌LH23的存活数量进行检测，计算存活率，所得结果如下：[0044] 表1干酪乳杆菌LH23的冻干存活率[0045]底物浓度(g/L) 冻干后的存活率(％)2 35.44 42.310 86.920 83.840 43.1[0046] 由表1可知，当底物半乳甘露聚糖的浓度为10g/L时，组合物中干酪乳杆菌的冻干存活率最高，高达86.9％。[0047] 二、菌的最适添加量[0048] (1)用蒸馏水配制浓度为10g/L的半乳甘露聚糖(槐豆胶或瓜尔豆胶)底物，每毫升底物先加入α‑半乳糖苷酶0.5U搅拌均匀并在37℃水浴锅中反应7h后，再加入β‑甘露聚糖酶6.625U搅拌均匀并在37℃水浴锅中反应1h，离心取上清得到含有单糖和甘露寡糖的混合液。[0049] (2)将干酪乳杆菌LH23接种至MRS液体培养基中在37℃培养箱中活化12h，反复活化三次后，再按照2％接种量将其转接至MRS液体培养基中在37℃培养箱中扩大培养12h，离10心收集菌泥，并用无菌生理盐水洗涤菌体，此时干酪乳杆菌LH23的浓度是2.6×10 CFU/mL。[0050] (3)将上述步骤(2)中得到的菌泥按照不同的添加量重悬于上述步骤(1)中得到的混合液中共同培养12h，菌泥(按未离心前体积)与混合液的体积比分别为为0.5：1、1：1、2：101、5：1(V/V)，把菌接种到上述混合液中之后，混合液中菌的浓度分别是1.3×10 CFU/mL、10 10 112.6×10 CFU/mL、5.2×10 CFU/mL、1.3×10 CFU/mL，即得到4种含有甘露寡糖和干酪乳杆菌的重悬液。[0051] (4)将上述步骤(3)中的4种含有甘露寡糖和干酪乳杆菌LH23的重悬液进行冷冻干燥，即得甘露寡糖和干酪乳杆菌LH23的合生元制剂。[0052] 对上述不同菌用量获得的合生元制剂中干酪乳杆菌LH23的存活数量进行检测，计算存活率，所得结果如下：[0053] 表2干酪乳杆菌LH23的冻干存活率及混合液中单糖消耗率[0054][0055][0056] 由表2可知，当底物浓度为10g/L，混合液中干酪乳杆菌LH23的浓度为2.6×1010 CFU/mL时，组合物中干酪乳杆菌LH23的冻干存活率最高并可达89％，同时在此条件下混合物中的单糖被完全消耗(如图2中1组结果所示)。[0057] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

专利地区：天津

专利申请日期：2022-03-30

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114606280B