磁纳米化趋化因子SDF-1及其制备方法和应用

专利名称：磁纳米化趋化因子SDF-1及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210253027.6

专利申请（专利权）人：东莞市东南部中心医院
权利人地址：广东省东莞市塘厦镇蛟坪大道113号

专利发明（设计）人：孙建波

专利摘要：本发明涉及再生医学领域，具体涉及磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法。本发明的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，包括以下步骤：制备重组质粒；制备重组菌株，并诱导重组菌株表达目的蛋白；利用表面修饰链霉亲合素的磁性纳米颗粒，制备磁纳米化SDF‑1。本发明制备得到带有生物素标签的基质细胞衍生因子SDF‑1，借助大肠杆菌表达目的蛋白，细菌培养简单易操作，而且成本低。利用亲和层吸方法一步纯化得到重组SDF‑1蛋白，操作简单，成本低，目的蛋白纯度高；本发明制备得到磁纳米化趋化因子SDF‑1，其搭载效率高，具有生物学活性，生物相容性好，可以被外部磁场操控，具有良好的生物学应用前景。

主权利要求：
1.一种磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备重组质粒birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1；
(2)制备重组菌株，对重组菌株进行诱导表达，得到诱导后的菌液；
(3)对步骤(2)得到的菌液进行纯化，得到纯化后蛋白样品，对所述纯化后蛋白样品进Biotin行透析和复性，得到目的蛋白BAP ‑SDF‑1；
Biotin
(4)向磁性纳米颗粒溶液中加入目的蛋白BAP ‑SDF‑1，超声后，进行孵育，得到混合体系；使用磁力架对所述混合体系进行吸附，弃上清后，加入蛋白保存液进行洗涤，加入蛋白保存液进行重悬，得到所述磁纳米化趋化因子MNPs‑SDF‑1；
所述磁性纳米颗粒溶液为表面修饰链霉亲合素的磁性纳米颗粒SA‑MNPs，加入目的蛋Biotin白BAP ‑SDF‑1的体积为所述磁性纳米颗粒溶液体积的5～15倍；
所述孵育条件为2～40℃、50～250rpm，所述孵育时间为0.1～3h；
所述蛋白保存液为TENG；
所述TENG由以下成分组成：0.05MTris‑base，0.5mMEDTA，0.05M氯化钠，5％甘油。
2.根据权利要求1所述的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，其特征在于，步骤(1)制备重组质粒包括以下步骤：(1‑1)制备bap‑sdf‑1重组基因序列；
(1‑2)将步骤(1‑1)得到的bap‑sdf‑1重组基因序列整合到pCDFDuet‑1中，得到重组质粒bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1；
(1‑3)将birA基因序列整合到步骤(1‑2)得到的重组质粒bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1中，得到重组质粒birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1。
3.根据权利要求1或2所述的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将步骤(1)得到的重组质粒birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1转化到BL21(DE3)pLysS大肠杆菌，得到所述重组菌株。
4.根据权利要求1所述的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，对重组菌株进行诱导表达包括以下步骤：(2‑1)制备所述重组菌株的单克隆，并培养得到培养菌液；
(2‑2)将所述培养菌液转接至LB液体培养基中，在25‑39℃下150‑250rpm培养2‑3h，得到二次培养菌液；所述培养菌液与LB液体培养基的体积比为(1‑5):100；
(2‑3)当所述二次培养菌液OD600值达到0.6‑1.2时，加入0.1‑5mM的IPTG，在30℃、150‑
250rpm下诱导4‑8h，即完成重组菌株的诱导表达。
5.根据权利要求1所述的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，对得到的菌液进行纯化包括以下步骤：(3‑1)取所述菌液进行离心，得到菌体沉淀；使用PBS对所述菌体沉淀进行洗涤后，用缓冲液进行重悬，得到菌体重悬液；
(3‑2)取所述菌体重悬液进行超声破碎，并进行离心，过滤离心所得上清液，得到滤液；
(3‑3)使用层析柱对步骤(3‑2)所得滤液进行层析纯化，得到纯化后蛋白样品。
6.根据权利要求1或5所述的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，对所述纯化后蛋白样品进行透析和复性包括以下步骤：取所述纯化后蛋白样品装入透析袋，排出空气，在冰浴下透析液进行透析，同时进行搅拌，得到透析后蛋白；将所述透析后蛋白加入蛋白保存液中，2‑8℃保存过夜，之后冰浴下搅拌40‑80min进行复性，离心后获得的上清液，即为目的蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白浓度为0.1‑0.3mg/mL。
8.根据权利要求6所述的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，其特征在于，所述透析液为0.1M磷酸氢二钠溶液，其pH为11，所述透析液中含有0.01MTris‑base，和/或200‑
300mM咪唑、2‑6M尿素。
9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的磁纳米化趋化因子SDF‑1。
10.根据权利要求9所述的磁纳米化趋化因子SDF‑1应用，其特征在于，所述磁纳米化趋化因子SDF‑1在制备用于抗炎、免疫调节、成血管或组织损伤修复的药物中的应用。 说明书 : 磁纳米化趋化因子SDF‑1及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明属于再生医学领域，具体涉及磁纳米化趋化因子SDF‑1及其制备方法和应用。背景技术[0002] 间充质干细胞具有成骨、成脂、成软骨的多向分化潜能，被广泛地应用在再生医学领域，但是组织再生效果，与迁移到损伤部位的间充质干细胞数目有密切关系，达到一定的数目才会有好的治疗效果。动员更多的间充质干细胞达到损伤部位，一直是学者研究的焦点。[0003] SDF‑1是招募CXCR4+间充质干细胞的一个重要趋化因子。受损组织会高表达SDF‑1，SDF‑1与CXCR4受体结合后，激活一系列相关的信号通道，诱导间充质干细胞顺着SDF‑1浓度梯度迁移，到达损伤部位，并滞留在损伤部位，发挥抗炎、免疫调节、成血管和组织损伤修+ +复功能。目前很多文献从SDF‑1/CXCR4信号轴出发，探讨招募更多CXCR4 干细胞的方法，有的从基因水平上改造，使干细胞表面高表达CXCR4受体。有的直接在损伤部位注射SDF‑1蛋白，或者将SDF‑1搭载到支架或者水凝胶中，再移植到损伤部位。但是前者会带来基因风险，后者SDF‑1会扩散到正常组织中，引起非特异性地招募，降低治疗效果。[0004] 鉴于上述问题，特提出本发明。发明内容[0005] 本发明提供提供一种磁纳米化趋化因子SDF‑1。[0006] 本发明的再一目的在于提供上述磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法。[0007] 本发明的再一目的在于提供上述磁纳米化趋化因子SDF‑1的应用。[0008] 根据本发明具体实施方式的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，包括以下步骤：[0009] (1)制备重组质粒birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1；[0010] (2)制备重组菌株，对重组菌株进行诱导表达，得到诱导后的菌液；[0011] (3)对步骤(2)得到的菌液进行纯化，得到纯化后蛋白样品，对所述纯化后蛋白样Biotin品进行透析和复性，得到目的蛋白BAP ‑SDF‑1；[0012] (4)向磁性纳米颗粒溶液中加入目的蛋白BAPBiotin‑SDF‑1，超声后，进行孵育，得到混合体系；使用磁力架对所述混合体系进行吸附，弃上清后，加入蛋白保存液进行洗涤，加入蛋白保存液进行重悬，得到所述磁纳米化趋化因子SDF‑1。[0013] 本发明中，生物素连接酶BirA与生物素受体多肽BAP共表达时，BirA可将生物素结Biotin合到BAP上，得到BAP 复合物。当BAP与SDF‑1融合表达，可间接地使SDF‑1带上生物素标Biotin签，最终得到His‑BAP ‑SDF‑1重组蛋白。[0014] 其中，pET‑28a(+)质粒上有表达His‑tag的基因，可使SDF‑1的N端修饰上His‑tag；具有双启动子的pCDFDuet‑1质粒，有两个多克隆位点MCS1、MCS2，可以同时插入bap、birA基因，实现两个基因的共表达，而且质粒上也有表达His‑tag的基因。[0015] 根据本发明具体实施方式的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，步骤(1)制备重组质粒包括以下步骤：[0016] (1‑1)制备bap‑sdf‑1重组基因序列；[0017] (1‑2)将步骤(1‑1)得到的bap‑sdf‑1重组基因序列整合到pCDFDuet‑1中，得到重组质粒bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1；[0018] (1‑3)将birA基因序列整合到步骤(1‑2)得到的重组质粒bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1中，得到重组质粒birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1。[0019] 更为具体的，步骤(Ⅰ)中，[0020] 设计并合成带有基因序列bap的引物A，以含有人、小鼠或其他物种Sdf‑1α基因的质粒为模板扩增得到bap‑sdf‑1基因序列，插入T载体后进行酶切，获得的具有粘性末端的bap‑sdf‑1重组基因与具有相同粘性末端的质粒pCDFDuet‑1(或其他具有蛋白原核双表达功能的质粒)进行连接，得到重组质粒bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1；[0021] 对重组质粒bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1进行酶切，得到酶切后重组质粒bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1；设计并合成引物B，以大肠杆菌基因组为模板扩增得到基因序列birA，插入T载体后进行酶切，并与酶切后重组质粒bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1进行连接，得到重组质粒birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1。[0022] 所述引物A的特征为：正向引物F由“保护性碱基+限制性酶切位点序列+Bap序列+目的蛋白(实施例中为Sdf‑1)起始密码子后部分连续序列”组成，实施例中用于Sdf‑1的引物A的正向引物序列为：“cgGAATTCgGGCCTGAACGATATTTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATAAACCAGTCAGCCTGAGC”[“GAATTC”为EcoRI限制性酶酶切位点序列，“GGCCTGAACGATATTTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCAT”是Bap序列，Bap序列前的g为保证正确编码所必需且可换成CTA中任一个碱基，Bap序列后的序列为Sdf‑1基因起始密码子ATG后的连续序列(不含ATG)]；反向引物R由“目的蛋白(实施例中为Sdf‑1)终止密码子及之前的连续序列+限制性内切酶位点序列+保护碱基”的反向互补序列组成，实施例中用于Sdf‑1的引物A的反向引物序列为：“ataagaatGCGGCCGCTTACTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACTC”“GCGGCCGC”为NotI限制性酶的酶切位点序列，该序列右边的序列为Sdf‑1基因末端编码序列(含有终止子)])。所述酶切使用的为所设计引物上的限制性内切酶来决定，实施例中采用EcoRⅠ和NotⅠ两个限制性核酸内切酶；所述连接使用的为DNA连接酶。[0023] 所述引物B的基因序列为：正向引物F由“保护性碱基+限制性酶切位点序列+birA起始密码子及以后部分连续序列”组成，具体序列为“gaAGATCTcATGAAGGATAACACCGTGCCA”[“AGATCT”为BglII限制性酶酶切位点序列，“AGATCT”后的c为保证正确编码所必需且可换成GTA中任一个碱基，c后的序列为birA基因起始密码子ATG后的连续序列(含ATG)]；反向引物R由“birA终止密码子及之前的连续序列+限制性内切酶位点序列+保护碱基”的反向互补序列组成：“ccgCTCGAGTTATTTTTCTGCACTACGCAGGG”[“CTCGAG”为XhoI限制性酶的酶切位点序列，“CTCGAG”右边的序列为birA基因末端编码序列(含有终止子)]。所述酶切使用的为BglⅡ和XhoⅠ两个限制性核酸内切酶；所述连接使用的为DNA连接酶。[0024] 根据本发明具体实施方式的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，步骤(2)中，将步骤(1)得到的重组质粒birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1转化到BL21(DE3)pLysS大肠杆菌，得到所述重组菌株。[0025] 将构建好的birA/sa‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1表达载体，转化到BL21(DE3)pLysS大肠杆菌中，大肠杆菌生长到对数期，加入适宜浓度的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(isopropyl‑β‑D‑thiogalactoside，IPTG)，继续在恒温摇床上培养，目的蛋白就可以在大肠杆菌中表达。[0026] 根据本发明具体实施方式的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，步骤(2)获得目Biotin Biotin的蛋白BAP ‑SDF‑1后，对目的蛋白BAP ‑SDF‑1进行纯化和复性。[0027] 用含Ni2+/Co2+/Cu2+的材料填充层析柱，当带His‑tag的目的蛋白流经柱子时，His‑tag会与填料中的金属离子结合，从而使目的蛋白停留在层析柱上。当用高浓度的咪唑洗脱层析柱时，咪唑与His‑tag竞争性结合金属离子，从而使目的蛋白从层析柱上洗脱下来，达到纯化带有His‑tag蛋白的目的。[0028] 根据本发明具体实施方式的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，步骤(2)中，对重组菌株进行诱导表达包括以下步骤：[0029] (2‑1)制备所述重组菌株的单克隆，并培养得到培养菌液；[0030] (2‑2)将所述培养菌液转接至LB液体培养基中，在25‑39℃下150‑250rpm培养2‑3h，得到二次培养菌液；所述培养菌液与LB液体培养基的体积比为(1‑5):100；[0031] (2‑3)当所述二次培养菌液OD600值达到0.6‑1.2时，加入0.1‑5mM的IPTG，在16‑35‑39℃、150‑250rpm下诱导4‑8h，即完成重组菌株的诱导表达。[0032] 更为具体的，诱导表达的操作步骤：[0033] 取重组菌株接种于LB固体培养基中，25‑39℃温箱中过夜，得到单克隆；挑取单克隆接种在LB液体培养基中，在25‑39℃下150‑250rpm培养4‑16h，得到培养菌液；所述LB液体培养基中含有40‑60μg/ml的硫酸链霉素或相应载体携带抗性基因对应的抗生素；[0034] 将所述培养菌液转接至LB液体培养基中，在25‑39℃下150‑250rpm培养2‑3h，得到二次培养菌液；所述培养菌液与LB液体培养基的体积比为(1‑5):100；[0035] 当所述二次培养菌液OD600值达到0.6‑1.2时，加入0.1‑5mM的IPTG，在16‑35‑39℃、150‑250rpm下诱导4‑8h，即完成重组菌株的诱导表达。[0036] 根据本发明具体实施方式的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，步骤(3)中，对得到的菌液进行纯化包括以下步骤：[0037] (3‑1)取所述菌液进行离心，得到菌体沉淀；使用PBS对所述菌体沉淀进行洗涤后，用缓冲液进行重悬，得到菌体重悬液；[0038] (3‑2)取所述菌体重悬液进行超声破碎，并进行离心，过滤离心所得上清液，得到滤液；[0039] (3‑3)使用层析柱对步骤(3‑2)所得滤液进行层析纯化，得到纯化后蛋白样品。[0040] 本发明利用His‑tag与层析柱的亲和作用，其中，优选Ni2+亲和层析柱，或Co2+亲和2+层析柱，或Cu 的材料填充层析柱，纯化出生物素化趋化因子SDF‑1。[0041] 更为具体的，纯化操作步骤为：[0042] 取所述诱导后菌液进行离心，得到菌体沉淀；使用PBS对所述菌体沉淀洗涤两次，之后用体积为所述诱导后菌液5％‑15％的结合缓冲液进行重悬，得到菌体重悬液；[0043] 取所述菌体重悬液进行超声破碎，并在2‑8℃下以5000‑18000rpm离心20‑40min，所得上清液用0.1‑0.3μm的滤菌器过滤，得到滤液；所述超声功率为仪器最大功率的15％‑45％，所述超声破碎过程为超声1‑5s、间歇2‑10s，总计超声3‑10min；[0044] 将所述滤液上Ni2+层析柱进行层析纯化，得到纯化后蛋白样品。[0045] 根据本发明具体实施方式的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，步骤(3)中，步骤(3)中，对所述纯化后蛋白样品进行透析和复性包括以下步骤：取所述纯化后蛋白样品装入透析袋，排出空气，在冰浴下透析液进行透析，同时进行搅拌，得到透析后蛋白；将所述透析后蛋白加入蛋白保存液中，2‑8℃保存过夜，之后冰浴下搅拌40‑80min进行复性，离心后获得的上清液，即为目的蛋白；优选的，所述目的蛋白浓度为0.1‑0.3mg/mL。[0046] 根据本发明具体实施方式的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，步骤(3)中，所述透析液为0.1M磷酸氢二钠溶液，其pH为11，所述透析液中含有0.01MTris‑base，和/或200‑300mM咪唑、2‑6M尿素，[0047] 具体的，透析过程中依次使用五种透析液进行透析，透析液为0.1M磷酸氢二钠溶液(pH＝11)，含有0.01MTris‑base，并加不同浓度的尿素和咪唑，分别为①含有200‑300mM咪唑和2‑6M尿素的透析液，②150‑250mM咪唑和1‑3M尿素的透析液，③含有40‑60mM咪唑和0.5‑1.5M尿素的透析液，④含有20‑30mM咪唑和0.1‑0.9M尿素的透析液，⑤含有0mM咪唑和0M尿素的透析液。其中，使用上述五种透析液透析时，每次所述透析时间均为0.5‑2.5h。[0048] 根据本发明具体实施方式的磁纳米化趋化因子SDF‑1的制备方法，步骤(4)中，[0049] 所述向磁性纳米颗粒溶液中加入目的蛋白进行超声前需要对磁性纳米颗粒溶液中的磁性纳米颗粒进行清洗；[0050] 所述清洗过程为：取浓度为0.05‑2.0mg/ml的磁性纳米颗粒溶液加入体积为所述磁性纳米颗粒溶液体积5‑15倍的PBS中，超声10‑200s，之后使用磁力架吸附0.1‑3h，弃上清后加入为所述磁性纳米颗粒溶液体积5‑15倍的PBS超声10‑200s，再次使用磁力架进行吸附0.1‑3h，弃上清，得到清洗后的磁性纳米颗粒；[0051] 所述加入目的蛋白的体积为所述磁性纳米颗粒溶液体积的5‑15倍，所述超声时间为30‑90s，所述孵育条件为2‑40℃、50‑250rpm，所述孵育时间为0.1‑3h；[0052] 所述磁力架对所述混合体系吸附的时间为0.1‑3h；[0053] 所述洗涤的操作为：弃上清后加入与目的蛋白同体积的蛋白保存液，超声30‑90s，利用磁力架吸附0.1‑3h后弃上清，再加入与目的蛋白同体积的蛋白保存液，超声10‑200s，利用磁力架吸附0.1‑3h后弃上清，即完成所述洗涤操作；所述蛋白保存液pH为9‑13，组份包含0.01‑0.09MTris‑base、0.2‑0.8mMEDTA、0.01‑0.09M氯化钠和3‑7％甘油；[0054] 所述重悬加入的蛋白保存液的体积为所述目的蛋白体积的5‑15％。[0055] 本发明还提供由上述制备方法得到的磁纳米化趋化因子SDF‑1，其可用于损伤部位招募/富集外源性或内源性干细胞，或者通过混杂或包裹等药学上常用的方式加入其他制剂中，用于招募干细胞，从而可以达到促进组织损伤修复和再生的作用。[0056] 本发明的有益效果：[0057] 1.本发明成功构建了生物素化重组趋化因子SDF‑1(BAPBiotin‑SDF‑1)大肠杆菌表达菌株，表达并纯化出具有生物学活性的、生物素化的重组SDF‑1，并借助生物素‑链霉亲合素的亲和作用，构建高搭载率的磁纳米化SDF‑1，其纯度在90％以上，浓度可达0.5mg/mL。诱Biotin导1L菌液，可获得8.5mgBAP ‑SDF‑1。[0058] 2.BAPBiotin‑SDF‑1与生物合成的生物素化的磁性纳米颗粒Biotin‑BMPs进行偶联，构建了磁纳米化SDF‑1(BMPs‑SDF‑1),其中，1mgMNPs可搭载150μgSDF‑1。[0059] 3.MNPs‑SDF‑1在蛋白保存液TENG中的水合粒径均匀，平均值为131.5nm，方差为28.2nm。在PBS中的水合粒径平均值为208.3nm，方差为79.2nm。普鲁士蓝染色显示，50ug/mlMNPs‑SDF‑1在蛋白保存液TENG中不聚集，而在PBS中聚集。与空白对照组相比，MNPs‑SDF‑1浓度为1μg/mL时，促进间充质干细胞增殖(P〈0.01)，浓度增加到5μg/ml时，促进效果更显著(P〈0.0001)。MNPs‑SDF‑1在0‑10μg/ml(以搭载的SDF‑1浓度计算)范围内，随着蛋白浓度增高，体外招募活性逐渐增强。[0060] 4.MNPs‑SDF‑1在体内表现出明显的招募CXCR4+间充质干细胞的活性。附图说明[0061] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0062] 图1显示PCR验证质粒birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1构建情况，其中，bap‑sdf‑1，～250bp；birA，～1000bp；+，阳性对照；‑，阴性对照；线条，目的基因。)；[0063] 图2重组蛋白BAPBiotin‑SDF‑1的诱导表达条件，A：开始加入IPTG时，测量大肠杆菌Biotin浓度OD600值；B：在不同pH值的lysisbuffer中，BAP ‑SDF‑1的溶解性差异，其中，(BirA，Biotin35kDa；BAP ‑SDF‑1，12kDa；a，诱导后；b，诱导前；s，诱导后菌液超声破碎，离心后的上Biotin清；p，诱导后菌液超声破碎，离心后的沉淀；红色线条，BAP ‑SDF‑1蛋白；红色箭头，BirA蛋白。)；[0064] 图3变性后的SA‑SDF‑1与Ni2+亲和层析柱结合后，用含不同浓度咪唑的洗脱液，对2+SA‑SDF‑1的洗脱效果；(SA‑SDF‑1，29kDa；F，结合后并流出Ni 亲和层析柱的蛋白溶液；W，用washingbuffer洗脱杂蛋白；红色线条，SA‑SDF‑1蛋白；[0065] 图4显示BAPBiotin‑SDF‑1纯化结果，其中，BirA，35kDa；BAPBiotin‑SDF‑1，12kDa；[0066] 图5显示CCK‑8实验检测MNPs(A)，BAPBiotin‑SDF‑1(B)，MNPs‑SDF‑1(C)对iPSC‑MSCs的细胞毒性。(n＝5；****，P＜0.0001；***，P＜0.001；**，P＜0.01；ns(notsignificant)，P＞0.05)；[0067] 图6显示造模后第一天、第三天、第九天，通过荧光成像检测MNPs‑SDF‑1对iPSC‑MSCs的体内招募效果；[0068] 图7显示iPSC‑MSCs对磁纳米化SDF‑1的吸附情况；[0069] 图8显示MNPs‑SDF‑1对外源性iPSC‑MSCs的招募效果情况。具体实施方式[0070] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。[0071] 本发明中，鼠源SDF‑1α的cDNA开放阅读框有270bp，去掉信号肽，仅克隆成熟肽序列210bp，编码69个氨基酸。[0072] 目的蛋白纯化中用到的各种试剂的配方：[0073] lysisbuffer(pH＝8)：20mM磷酸氢二钠，0.5M氯化钠，0.5％TritonX‑100；[0074] bindingbuffer(pH＝11)：0.1M磷酸氢二钠，0.01MTris‑base，8M尿素，20mM咪唑；[0075] washingbuffer(pH＝11)：0.1M磷酸氢二钠，0.01MTris‑base，8M尿素，50mM咪唑；[0076] elutionbuffer(pH＝11)：0.1M磷酸氢二钠，0.01MTris‑base，8M尿素，500mM咪唑；[0077] 透析液(pH＝11)：0.1M磷酸氢二钠，0.01MTris‑base，根据需要加不同浓度的尿素和咪唑；[0078] 蛋白保存液TENG(pH＝11)：0.05MTris‑base，0.5mMEDTA，0.05M氯化钠，5％甘油。[0079] 实施例1构建重组质粒(birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1)[0080] 1)设计合适的引物(正向引物序列为：cgGAATTCgGGCCTGAACGATATTTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATAAACCAGTCAGCCTGAGC；反向引物序列为：ataagaatGCGGCCGCTTACTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACTC)，引物中带有生物素受体多肽BAP的基因序列bap。以含有小鼠sdf‑1基因的质粒为模板，进行重组PCR技术扩增得到bap‑sdf‑1重组基因序列。[0081] 2)将扩增得到的bap‑sdf‑1基因序列插入到T载体中，插入成功后，用EcoRⅠ、NotⅠ两个限制性核酸内切酶将bap‑sdf‑1基因序列从T载体上剪切下来，此时bap‑sdf‑1基因序列带有两个黏性末端。[0082] 3)将质粒pCDFDuet‑1也用EcoRⅠ、NotⅠ两个限制性核酸内切酶进行酶切，得到与bap‑sdf‑1基因序列相同的黏性末端。[0083] 4)将酶切好的bap‑sdf‑1基因序列和pCDFDuet‑1用DNA连接酶连接起来。最终bap‑sdf‑1成功整合到pCDFDuet‑1其中的一个开放阅读框中。[0084] 5)设计引物(正向引物序列为：gaAGATCTcATGAAGGATAACACCGTGCCA；反向引物序列为：ccgCTCGAGTTATTTTTCTGCACTACGCAGGG)，以大肠杆菌基因组为模板，利用PCR技术得到生物素连接酶的基因序列birA。插入T载体上后，用BglⅡ、XhoⅠ限制性核酸内切酶将birA基因序列从T载体上酶切下来。[0085] 6)pCDFDuet‑1质粒也用BglⅡ、XhoⅠ限制性核酸内切酶切开。[0086] 7)将酶切好的birA基因序列和pCDFDuet‑1用DNA连接酶连接起来，最终birA成功整合到pCDFDuet‑1的另一个开放阅读框中。[0087] 8)成功构建得到重组质粒(birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1)后，将其转化到BL21(DE3)pLysS大肠杆菌中。[0088] 以选取的单克隆菌落为模板，进行PCR验证，结果如图1所示，质粒birA/bap‑sdf‑1‑pCDFDuet‑1构建成功。[0089] 实施例2诱导大肠杆菌表达目的蛋白BAPBiotin‑SDF‑1[0090] 1)在生物安全柜中，将甘油管中保存的菌种接种到含硫酸链霉素的LB固体培养基中，37℃温箱中过夜，待长出单克隆。[0091] 2)挑取单克隆，接种到LB液体培养基中(硫酸链霉素工作浓度为50μg/mL)中，37℃，200rpm，培养10h。[0092] 3)再将培养好的菌液按照菌液：LB＝3:100的比例转接到LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养2‑3h，直到OD600值达到0.6‑1.2。[0093] 4)取出1mL菌液，作为诱导前的对照样品。加入IPTG(最终工作浓度为0.5mM)，30℃，200rpm，诱导4h。[0094] 5)离心(8000rpm，5min)分别收集诱导前的和诱导后的菌体，以10:1的比例加入lysisbuffer重悬菌体(如100mL的菌液离心后加10mLlysisbuffer)。[0095] 6)超声破碎，功率35％，超声3s，间歇3s，总计超声4min，破碎液离心(8000rpm、30min、4℃)移走上清，沉淀用等体积的lysisbuffer重悬。[0096] 7)将诱导前的菌液，诱导后的总的超声破碎液，以及破碎后的上清和沉淀分别进行SDS‑PAGE凝胶电泳，并进行考马斯亮蓝染色，检测目的蛋白是否表达，以及溶解性。[0097] 本发明同时比较了起始诱导时，大肠杆菌浓度OD600值的范围、不同pH值的lysisBiotinbuffer对BAP ‑SDF‑1(12kDa)的溶解性的影响。[0098] 结果如图2所示，OD600在0.68‑1.63范围内，都可以成功诱导BAPBiotin‑SDF‑1表达，Biotin Biotin且BAP ‑SDF‑1与BirA(35kDa)共表达，如图2A所示。当缓冲液pH＝11时，BAP ‑SDF‑1溶解性最好，几乎全都是可溶性蛋白，如图2B所示。[0099] 实施例3纯化目的蛋白BAPBiotin‑SDF‑1[0100] 1)500mL诱导后的菌液离心收集菌体后，用PBS洗涤两次，最后用50mLbindingbuffer重悬沉淀。[0101] 2)超声破碎，离心(8000rpm、30min、4℃)，上清用0.22μm的滤菌器过滤，即为待上2+Ni 层析柱的蛋白样品。[0102] 3)连接好恒流泵，紫外检测仪，Ni2+层析柱。[0103] 4)先用蒸馏水3‑5mL上Ni2+层析柱，去除Ni2+层析柱中含有20％酒精的保存液，并调整恒流泵的速度为1mL/min。[0104] 5)然后elutionbuffer上Ni2+层析柱，至少5mL，并将紫外检测仪校零。[0105] 6)蛋白样品上Ni2+层析柱，并收集流出液(flowingbuffer)。[0106] 7)用washingbuffer洗掉杂蛋白，直到紫外检测仪示数降低到一个稳定值，并收集。[0107] 8)用elutionbuffer洗脱目的蛋白，当紫外检测仪示数开始上升时，开始用EP管接目的蛋白，每管1mL，当紫外检测仪示数降低到一个稳定值时，停止接目的蛋白。[0108] 9)换用蒸馏水上Ni2+层析柱(20ml)，除掉Ni2+层析柱残留的缓冲液，最后用20％酒2+ 2+精(10ml)上Ni 层析柱，取下Ni 层析柱保存。[0109] 10)将上Ni2+层析柱前的蛋白样品，流出液(flowingbuffer)，从柱子中流出的washingbuffer，和每个EP管接到的elutionbuffer。[0110] 进行SDS‑PAGE凝胶电泳，并进行考马斯亮蓝染色，检测蛋白与Ni2+层析柱结合效果，以及蛋白纯度，如图3所示。[0111] 实施例4蛋白的透析及复性[0112] 1)透析袋预处理：剪去合适大小的透析袋，在500mL含2％(W/V)碳酸氢钠和1mMEDTA(pH＝8.0)的缓冲液中将透析袋煮沸10分钟，再在500mL含1mMEDTA(pH＝8.0)的缓冲液中煮沸10分钟，最后用蒸馏水彻底清洗透析袋，注意将气泡赶出。[0113] 2)样品装进透析袋中，排走空气，用透析夹夹住。[0114] 3)依次用含250mM咪唑，4M尿素；100mM咪唑，2M尿素；50mM咪唑，1M尿素；25mM咪唑，0.5M尿素；0mM咪唑，0M尿素的透析液透析，每个浓度透析1.5h，磁力搅拌器不断搅拌，始终冰浴。[0115] 4)将蛋白放入蛋白保存液，4℃过夜，第二天再透析1h，最后，将蛋白收集到离心管中，离心(4℃，12000rpm)，留取上清，即得到纯化的蛋白。[0116] 如图4所示，先用8M尿素对诱导后大肠杆菌的所有蛋白进行变性，然后按照上述方Biotin法对其进行纯化，最终去除BirA和其他杂蛋白，得到纯度高达90％的BAP ‑SDF‑1。[0117] 实施例5制备磁纳米化SDF‑1[0118] 1)取100μg表面修饰链霉亲合素的磁性纳米颗粒SA‑MNPs(1mg/ml)于EP管中，加入1mLPBS，超声1min，使颗粒分散均匀。磁力架吸附颗粒2h后，弃去上清，再加入1mLPBS，超声1min，使颗粒分散均匀，磁力架吸附2h后，弃去上清，得到清洗后的MNPs颗粒。[0119] 2)加入1mL纯化得到的BAPBiotin‑SDF‑1(0.26mg/mL)，超声1min，使颗粒分散均匀，在摇床上孵育2h(30℃，200rpm)。[0120] 3)磁力架吸附磁纳米颗粒2h后，移走上清，加入1mL蛋白保存液，同步骤1将残留的蛋白液洗涤干净。最后加入100μL蛋白保存液重悬颗粒，即得到偶联好的SDF‑1(MNPs‑SDF‑1)。[0121] 实施例6检测磁性纳米颗粒上SDF‑1搭载效率[0122] 先将待检测的SDF‑1蛋白吸附在固相载体表面后，加抗SDF‑1抗体(一抗)与待测蛋白结合，随后再加入HRPGoatanti‑mouseFab二抗，与一抗发生抗原抗体结合，最后加入TMB单组分底物显色液，显色后加入终止液，测量OD450值，计算SDF‑1搭载效率。具体步骤如下：[0123] 1)偶联好的MNPs‑SDF‑1样品即为待测样品。[0124] 2)用包被液将标准品His‑SA(1mg/mL)梯度稀释到0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625，0μg/mL，MNPs‑SDF‑1稀释到1μg/mL。[0125] 3)包被：稀释好的标准品和待测样品加入到ELISA包被板中，每个样品加三个复孔，每孔100μL，注意不要产生气泡，放于4℃冰箱12‑16h。[0126] 4)封闭：用PBST配5％BSA，将包被好的样品甩出去，每孔加200μLPBST，立即甩出去，将板扣在干净的吸水纸上，轻轻拍打，将残留的液体吸干净，重复3‑5次进行洗涤后，每孔加200μL5％BSA，室温放置1h。[0127] 5)加一抗：用PBST配抗His‑tag抗体(1μg/mL)封闭液甩出去后，将板扣在干净的吸水纸上，轻轻拍打，将残留的液体吸干净。加入一抗，每孔100μL，室温放置1.5h。[0128] 6)加二抗：用PBST配HRPGoatanti‑mouseFab抗体。残余的一抗甩出去后，将板扣在干净的吸水纸上，轻轻拍打，将残留的液体吸干净。每孔加200μLPBST，立即甩出去，将板扣在干净的吸水纸上，轻轻拍打，将残留的液体吸干净，重复3‑5次进行洗涤后，每孔加100μL二抗，室温放置1.5h。[0129] 7)加显色液：残余的二抗甩出去后，将板扣在干净的吸水纸上，轻轻拍打，将残留的液体吸干净。每孔加200μLPBST，立即甩出去，将板扣在干净的吸水纸上，轻轻拍打，将残留的液体吸干净，重复3‑5次进行洗涤后，每孔加100μLTMB单组份显色液，室温放置20‑30min。[0130] 8)加终止液：配好1MH2SO4溶液，每孔加100μL。[0131] 9)测量：用酶标仪测量OD450值，计算SDF‑1的搭载效率。[0132] 用ELISA测量MNPs‑SDF‑1的SDF‑1搭载效率，结果显示，MNPs‑SDF‑1搭载效率为Biotin15％，即1mgMNPs可搭载150μgBAP ‑SDF‑1。[0133] 实施例7检测磁纳米化SDF‑1的趋化活性[0134] 1)待iPSC‑MSCs细胞密度长到70％‑80％。[0135] 2)用CCM培养基配制不同浓度的MNPs‑SDF‑1，总体积800μL，加入24孔细胞培养板中。[0136] 3)拆开Transwell小室，用无菌镊子，将小室放在孔中，避免在小室下面产生气泡。(倾斜24孔板，先让小室的一侧浸入培养基中，再慢慢放入，使小室完全放入24孔板中。)[0137] 4)接种细胞，每个小室接种100μL细胞悬液：2×105cells/mL。[0138] 5)培养24小时，待细胞贴壁。[0139] 6)丢弃孔中和小室中的培养基。[0140] 7)小室用PBS清洗两次。[0141] 8)用棉签抹去小室上层的细胞。[0142] 9)用4％多聚甲醛固定半小时，PBS洗涤两次。[0143] 10)1％结晶紫染液染色半小时后，用蒸馏水冲洗干净，并晾干。[0144] 11)彩色倒置荧光显微镜观察，每个样品选择3‑5个视野进行拍照。[0145] 如图5所示，Transwell迁移实验检测MNPs‑SDF‑1，BAPBiotin‑SDF‑1和SA‑SDF‑1对BiotiniPSC‑MSCs的体外趋化活性。在0‑10μg/ml范围之内(SA‑SDF‑1，BAP ‑SDF‑1，MNPs‑SDF‑1都是以重组SDF‑1的浓度计算)，SDF‑1的浓度越高，对iPSC‑MSCs的招募效果越明显。[0146] 实施例8检测MNPs‑SDF‑1的细胞毒性[0147] 1)在平底96孔板中接种100μLiPSC‑MSCs细胞(1×105cells/ml)。在细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养4小时，待细胞贴壁。[0148] 2)向培养板加入10μL不同浓度的SDF‑1，MNPs，MNPs‑SDF‑1。[0149] 3)将培养板在培养箱孵育24h。[0150] 4)每孔加入10μLCCK‑8溶液(注意不要生成气泡，气泡会影响OD值的读数)。[0151] 5)细胞继续在培养箱内孵育2.5h。[0152] 6)酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算细胞活力。[0153] 注：10μL，1.375mg/mL的磁性纳米颗粒加到100μL的细胞溶液中，最终浓度就是125μg/mL其他浓度的就将1.375mg/ml的储存液梯度稀释五倍用。[0154][0155][0156] 游离的MNPs浓度增高到125μg/ml时，与空白对照组相比，MNPs对iPSC‑MSCs细胞毒性无统计学差异，如图6A所示，说明磁性纳米颗粒的细胞毒性低。[0157] 在0‑25μg/ml范围内，随着BAPBiotin‑SDF‑1浓度升高，促进iPSC‑MSCs增值的效果越显著，如图6B所示。SDF‑1自身具有促进细胞增殖的生物学活性。[0158] MNPs‑SDF‑1的SDF‑1搭载效率为20％，在0‑5μg/ml范围之内(以MNPs的浓度计算)，MNPs‑SDF‑1的浓度越高，促进iPSC‑MSCs增值的效果越明显，但是MNPs‑SDF‑1浓度达到5μg/mL后，促进细胞增殖的效果不再随浓度的增加而增加，如图6C所示。[0159] 实施例9检测iPSC‑MSCs对磁纳米化SDF‑1的吸附情况(普鲁士蓝染色法)[0160] 1)接种细胞：用48孔细胞培养板，接种iPSC‑MSCs细胞7.5×104cells/well，同时加入含0、25、50、100μg/mLMNPs/MNPs‑SDF‑1的CCM培养基500μl。[0161] 2)细胞培养：在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。[0162] 3)普鲁士蓝染色：弃去培养基，每孔加500μLPBS洗涤两次；加500μL4％多聚甲醛固定10‑20min；弃去甲醛，每孔加500μLPBS洗涤两次；加300μL配制好的普鲁士蓝染液，37℃孵育30min；自来水冲洗2次，每次2min；加300μL普鲁士蓝复染液复染30‑60s；蒸馏水冲洗、室温晾干。[0163] 4)彩色荧光倒置显微镜观察，每个样品选3‑5个视野拍照。[0164] 如图7A所示，用50μg/ml的MNPs/MNPs‑SDF‑1与iPSC‑MSCs共培养时，偶联SDF‑1后，MNPs‑SDF‑1容易聚集；且与保存在PBS中相比，MNPs‑SDF‑1保存在蛋白保存液TENG中，分散性更好。[0165] 如图7B所示，在0‑100μg/ml范围之内，随着MNPs，MNPs‑SDF‑1浓度增高，iPSC‑MSCs对MNPs，MNPs‑SDF‑1吸附量越多；但是在相同浓度时，细胞对MNPs‑SDF‑1吸附能力强于MNPs。[0166] 实施例10检测MNPs‑SDF‑1对外源性iPSC‑MSCs的招募效果(小鼠活体成像法)[0167] 1)细胞染色：根据荧光染料试剂盒说明书对细胞进行荧光标记。标记方法如下：[0168] a，将细胞消化离心弃去上清后，用无菌PBS或者无血清培养基洗涤2次，去除残留的血清蛋白和脂质，避免对后续染色的干扰。[0169] b，细胞计数后，PBS重悬细胞，将细胞浓度调整到250×106cells/mL，总体积2ml。[0170] c，将荧光染料加入1.3mL无菌PBS(37℃)，震荡混匀直到充分溶解，最终得到2ml的荧光染料，避光保存待用。[0171] d，将2mL的荧光染料加入到细胞悬液中，涡旋震荡，轻柔混匀(染料用量根据实际标记效果进行优化)，避光室温染色15分钟。[0172] e，加15‑20mLPBS(含1％FBS)，洗涤三次，去除残留的荧光染料。[0173] f，用PBS重悬细胞，并计数，将细胞浓度调整到10×106cells/mL[0174] 2)尾静脉注射细胞：每只小鼠注射2×106cells/200μL。[0175] 3)麻醉小鼠：腹腔注射麻醉(0.3％戊巴比妥钠，250μL/10g)。[0176] 4)备皮：小鼠全身备皮。[0177] 5)骨损伤模型构建：将2.5mL注射器针头(直径0.45mm)在股骨踝间切迹处插入骨髓腔，并扩髓到股骨粗隆部位。然后慢慢退出注射器针头，换用1mL胰岛素注射器在骨髓腔中注射50μL蛋白保存液TENG、SDF‑1、MNPs或[0178] MNPs‑SDF‑1。其中磁颗粒浓度为1mg/mL；MNPs‑SDF‑1搭载的SDF‑1浓度与游离的SDF‑1浓度一样。[0179] 6)固定磁铁：在注射MNPs或MNPs‑SDF‑1的腿部绑上环形磁铁(外经15mm，内径8mm，厚度3mm)，半小时后撤掉磁铁。[0180] 7)在第1天，3天，第7天，第9天，用小动物活体成像仪检测荧光标记间充质干细胞在体内分布情况。[0181] 两组间计量资料比较采用两个独立样本T检验。P＜0.05被认为有统计学差异。所有分析均采用GraphPadPrism7.00软件进行分析并绘制图片。[0182] 结果表明，MNPs‑SDF‑1组小鼠腿部荧光强度比MNPs组的强，表明MNPs‑SDF‑1招募iPSC‑MSCs的效果明显好于MNPs，而且在第九天时荧光强度达到最强，如图8所示。[0183] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

专利地区：广东

专利申请日期：2022-03-15

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114516911B