一种基于微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法及应用

专利名称：一种基于微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法及应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210077122.5

专利申请（专利权）人：中国人民解放军海军军医大学
权利人地址：上海市杨浦区翔殷路800号

专利发明（设计）人：洪战英,施艺玮,乐健,叶晓霞,陈啸飞,吴颖,蔡颖,何晓莉,柴逸峰

专利摘要：本发明涉及生物技术领域，具体是一种基于微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法及应用，所述芯片由血管通道、脑实质通道、三维肿瘤通道和介质通道组成。利用本方法提供的技术方案，成功整合了结构功能完整的血脑屏障与脑胶质瘤三维培养微环境，实现体外脑胶质瘤生长微环境重构，与其他肿瘤模型相比，该模型将血脑屏障引入脑肿瘤微环境，更适用于抗脑肿瘤药物筛选以及肿瘤行为研究等。

主权利要求：
1.一种用于建立血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括第一细胞培养室、第二细胞培养室、第三细胞培养室和培养基通道；在第一细胞培养室、第二细胞培养室、第三细胞培养室和培养基通道一侧均设有液体注入口；在第一细胞培养室和培养基通道的另一侧分别对应设置液体出口；
第一细胞培养室用于注入人周细胞和脑微血管内皮细胞；
第二细胞培养室用于注入星形胶质细胞的纤维蛋白原和凝血酶混合液；
第三细胞培养室用于注入脑胶质瘤细胞的基质胶混合液；
培养基通道用于注入细胞培养基；
所述的微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法，包括以下步骤：(A)芯片内细胞接种培养‑血脑屏障：配制人脑微血管内皮细胞悬液、人星型胶质细胞悬液和人周细胞悬液，配制纤维蛋白原和凝血酶母液；将人星型胶质细胞混悬于纤维蛋白原与凝血酶的混合溶液中，注入芯片中的第二细胞培养室，恒温凝胶化；
在第一细胞培养室依次加入人周细胞和人脑微血管内皮细胞，倾斜芯片使细胞粘附于第一细胞培养室与第二细胞培养室交界面，形成人脑微血管内皮细胞‑人周细胞‑人星型胶质细胞三细胞共培养的血脑屏障微结构；
(B)芯片内细胞接种培养‑脑胶质瘤：隔天配制脑胶质瘤细胞悬液，与预冷基质胶混合后加入第三细胞培养室；
(C)在第一细胞培养室液体注入口注入细胞培养基以模拟体内血管动态微环境。
2.一种基于如权利要求1所述的微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养体外模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(A)芯片内细胞接种培养‑血脑屏障：配制人脑微血管内皮细胞悬液、人星型胶质细胞悬液和人周细胞悬液，配制纤维蛋白原和凝血酶母液；将人星型胶质细胞混悬于纤维蛋白原与凝血酶的混合溶液中，注入芯片中的第二细胞培养室，恒温凝胶化；
在第一细胞培养室依次加入人周细胞和人脑微血管内皮细胞，倾斜芯片使细胞粘附于第一细胞培养室与第二细胞培养室交界面，形成人脑微血管内皮细胞‑人周细胞‑人星型胶质细胞三细胞共培养的血脑屏障微结构；
(B)芯片内细胞接种培养‑脑胶质瘤：隔天配制脑胶质瘤细胞悬液，与预冷基质胶混合后加入第三细胞培养室；
(C)在第一细胞培养室液体注入口注入细胞培养基以模拟体内血管动态微环境。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养体外模型的建立方法，其特征在于，步骤A中，将星型胶质细胞、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，星型胶质7
细胞终浓度为1×10cells/ml，纤维蛋白原最终浓度为6mg/ml，凝血酶最终浓度为2U/ml。
4.根据权利要求2所述的微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养体外模型的建立方法，其特征在于，步骤A中，在第一细胞培养室加入基质胶(1:50，v/v)包被第一细胞培养室表面40min，使用PBS冲洗血管通道3次，每次5min；
6
将细胞终浓度为1×10cells/ml人周细胞加入第一细胞培养室，垂直放置芯片，使细胞粘附于芯片侧面30min后，冲洗掉多余细胞；
7
将细胞终浓度为1×10cells/ml的人脑微血管内皮细胞加入第一细胞培养室，垂直放置芯片，使细胞粘附于芯片侧面4h后，冲洗掉多余细胞，每24h换液20μL。
5.根据权利要求2所述的微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养体外模型的建立方7
法，其特征在于，步骤B中，隔天接种脑胶质瘤U251细胞，细胞密度为1×10 cells/ml，将U251与基质胶(冷)混合(1:1,v/v)，加入第三细胞培养室。
6.一种采用如权利要求2‑5任一所述的方法构建得到的血脑屏障与脑胶质瘤共培养体外模型。
7.一种如权利要求6所述的血脑屏障与脑胶质瘤共培养体外模型在药物渗透性、药效评价、肿瘤行为研究以及治疗脑胶质瘤新药筛选中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过血管通道加入一定浓度的中药活性单体成分溶液，在介质通道收集渗透液体，分析药物跨血脑屏障转运。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过血管通道加入一定浓度的中药活性单体成分溶液用活/死细胞检测试剂盒检测芯片内U251细胞活性。 说明书 : 一种基于微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建
立方法及应用技术领域[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及将微流控芯片技术应用到体内器官结构和功能的模拟和应用，是一种基于微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法及应用。背景技术[0002] 血脑屏障是分布于脑部血管和脑实质之间的紧密界面，该屏障可以精确地控制物质在脑部的进出从而维持中枢神经系统的稳态并保护大脑免受病原体和毒素的侵害。血脑屏障是一层由多细胞相互联系与作用的具有选择通透性的生理屏障，包括：脑微血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞以及神经细胞。单独的内皮细胞可以履行血脑屏障的初级功能，与相邻细胞的相互作用对血脑屏障的结构和功能具有维持和调节的作用。[0003] 脑胶质瘤是脑内常见的侵袭性原发性脑肿瘤，占颅内肿瘤的30％～60％。在脑胶质瘤中，肿瘤组织中往往富含血管并且血管呈浸润性生长。受肿瘤影响，血脑屏障会出现内皮细胞间精密连接部分开放，毛细血管基膜增厚，星形细胞突起形成的毛细血管基底膜鞘缺失，尽管脑胶质瘤血管的通透性高于血脑屏障，但一定程度上也保留了血脑屏障的特性，明显限制了药物进入肿瘤组织，这些特点促使脑肿瘤中血管的异质性与通透性。[0004] 由于体内存在这层特殊的屏障，许多针对人中枢神经系统疾病的新药在动物阶段就以失败告终。动物与人之间存在的物种差异同样也会影响新药药效的预测。因此，对人体血脑屏障功能及结构的深入了解对药物研发具有重要意义，同时构建体外高保真的生理及病理模型对药物研发具有深远影响。微流控芯片由于其低消耗、高通量、贴近体内生理环境、可提供更加可靠的相互作用常数等特点在生命科学与药物研究领域飞速发展。微流控芯片技术由于其可模拟体内微环境且可控行较强，为仿生生物及生理疾病功能研究提供了一个重要平台。目前用于治疗肿瘤的药物筛选通常是通过体外细胞模型，但是大多数体外有效而体内无法达到治疗效果，其最主要的原因在于其无法跨血脑屏障渗透达到有效剂量。[0005] 中国专利文献CN103583960A公开了一种基于液滴微流控技术的个性化肿瘤类组装体构建方法及装置，可实现药物的高通量筛选。中国专利文献CN112852708A公开了一种hiPSCs来源的体外脑肿瘤的建立方法，通过施加乳腺癌来源的外泌体建立新型的脑肿瘤模型。但是目前利用微流控芯片技术模拟血脑屏障结构和功能以及脑胶质瘤微环境，特别是在肿瘤模型中结合人脑高度相似的动态血脑屏障，用于筛选药物跨血脑屏障抗脑胶质瘤药效研究尚处于空白。发明内容[0006] 本发明的目的在于提供一种基于微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法及应用，旨在提供一种高保真的血脑屏障‑脑胶质瘤共培养的体外模型的构建方法，并应用于抗脑胶质瘤中药活性成分的渗透性和药效评价研究。[0007] 本发明的第一方面，提供一种用于建立血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的微流控芯片(结构参见图1)，所述微流控芯片包括第一细胞培养室(血管通道)、第二细胞培养室(脑实质通道)、第三细胞培养室(三维肿瘤通道)和培养基通道(介质通道)；在第一细胞培养室、第二细胞培养室、第三细胞培养室和培养基通道一侧均设有液体注入口；在第一细胞培养室和培养基通道的另一侧分别对应设置液体出口；[0008] 第一细胞培养室用于注入人周细胞和脑微血管内皮细胞；[0009] 第二细胞培养室用于注入星形胶质细胞的纤维蛋白原和凝血酶混合液；[0010] 第三细胞培养室用于注入脑胶质瘤细胞的基质胶混合液；[0011] 培养基通道用于注入细胞培养基。[0012] 进一步的，所述第一细胞培养室和培养基通道中培养基每天定时更换。更换培养基时，缓慢谨慎向第一细胞培养室液体注入口和第二细胞培养室液体注入口注入培养基，从第一细胞培养室液体出口和培养基通道液体出口吸取培养基。[0013] 进一步的，所述第一细胞培养室、第二细胞培养室、第三细胞培养室和培养基通道的相邻通道间由多个微形柱分隔，微形柱间距离为150μm，通道高度为200～250μm，微形柱提供细胞三维培养支架和细胞间相互作用的桥梁。第一细胞培养室、第二细胞培养室和培养基通道的通道宽度为2mm，第三细胞培养室的通道宽度为1mm。[0014] 进一步的，本发明提供的微流控芯片，该微流控芯片由上下两层不可逆键合形成，两层均为聚二甲基硅氧烷聚合物，上层含有通道，下层是空白层。所述微流控芯片的上下两层分别进行等离子体处理120s后进行键合，键合后的芯片进行高温高压灭菌处理。[0015] 本发明的第二方面，提供一种基于如上所述的微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法，包括以下步骤：[0016] (A)芯片内细胞接种培养‑血脑屏障：配制人脑微血管内皮细胞悬液、人星型胶质细胞悬液和人周细胞悬液，配制纤维蛋白原和凝血酶母液；将人星型胶质细胞混悬于纤维蛋白原与凝血酶的混合溶液中，注入芯片中的第二细胞培养室(脑实质通道)，恒温凝胶化；[0017] 在第一细胞培养室(血管通道)依次加入人周细胞和人脑微血管内皮细胞，倾斜芯片使细胞粘附于第一细胞培养室与第二细胞培养室交界面，形成人脑微血管内皮细胞‑人周细胞‑人星型胶质细胞三细胞共培养的血脑屏障微结构；[0018] (B)芯片内细胞接种培养‑脑胶质瘤：隔天配制脑胶质瘤细胞悬液，与预冷基质胶混合后加入第三细胞培养室(三维肿瘤通道)；[0019] (C)在第一细胞培养室(血管通道)液体注入口连接软管，与蠕动泵相连，参考体内脑部血管流体剪切应力，以一定速度注入细胞培养基以模拟体内血管动态微环境。[0020] 所述的细胞培养基为内皮细胞培养基(EndothelialCellMedium，简称ECM培养基)。培养基注入速度为由1μL/min至6μL/min逐渐增加，动态培养7天。[0021] 进一步的，步骤A中，纤维蛋白原和凝血酶溶解于PBS，配置纤维蛋白原母液和凝血酶母液。[0022] 进一步的，步骤A中，将星型胶质细胞、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，星型胶7质细胞终浓度为1×10 cells/ml，纤维蛋白原最终浓度为6mg/ml，凝血酶最终浓度为2U/ml。[0023] 进一步的，步骤A中，将上述细胞混悬液加入微流控芯片中的脑实质通道，在二氧化碳恒温孵育箱中孵育15min至纤维蛋白原凝胶化。[0024] 进一步的，步骤A中，在血管通道加入基质胶(1:50，v/v)包被血管通道表面40min，使用PBS冲洗血管通道3次，每次5min；[0025] 将人周细胞(细胞终浓度为1×106cells/ml)加入血管通道，垂直放置芯片，使细胞粘附于芯片侧面30min后，冲洗掉多余细胞；[0026] 将人脑微血管内皮细胞(细胞终浓度为1×107cells/ml)加入血管通道，垂直放置芯片，使细胞粘附于芯片侧面4h后，冲洗掉多余细胞，每24h换液20μL。[0027] 进一步的，步骤B中，隔天接种脑胶质瘤U251细胞，细胞密度为1×107cells/ml，将U251与基质胶(冷)混合(1:1,v/v)，加入肿瘤三维通道。肿瘤细胞在基质胶中呈三维生长。置于二氧化碳恒温孵育箱中孵育20min，将U251细胞培养基加入介质通道。[0028] 本发明的第三方面，提供一种采用如上所述的方法构建得到的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型。[0029] 本发明的第四方面，提供一种如上所述的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型在药物渗透性、药效评价、肿瘤行为研究以及治疗脑胶质瘤新药筛选中的应用。[0030] 进一步的，所述的应用中，通过血管通道加入一定浓度的中药活性单体成分溶液，在介质通道收集渗透液体，分析药物跨血脑屏障转运。[0031] 进一步的，所述的应用中，通过血管通道加入一定浓度的中药活性单体成分溶液用活/死细胞检测试剂盒检测芯片内U251细胞活性。[0032] 本发明优点在于：[0033] 1、本发明采用微流控芯片技术发明了一种血脑屏障与脑胶质瘤共培养的模型，结合血脑屏障功能与脑胶质瘤微环境，真正实现药物跨血脑屏障转运及治疗脑胶质瘤的药效评价。[0034] 2、利用本方法提供的技术方案，成功整合了结构功能完整的血脑屏障与脑胶质瘤三维培养微环境，实现体外脑胶质瘤生长微环境重构，与其他肿瘤模型相比，该模型将血脑屏障引入脑肿瘤微环境，更适用于抗脑肿瘤药物筛选以及肿瘤行为研究等。[0035] 3、本发明应用微流控芯片为平台，首次在脑胶质瘤模型的基础上构建与人脑高度相似的动态血脑屏障，并应用于潜在的抗脑胶质瘤中药活性成分的转运研究，及跨血脑屏障抗脑胶质瘤药效评价，为脑胶质瘤的新药研发与筛选提供了一个高保真平台。附图说明[0036] 图1本发明微流控芯片整体结构示意图；[0037] 图2本发明微流控芯片细胞生长结构模拟图；[0038] 图3本发明微流控芯片中细胞生长情况图；A为芯片内血管通道和脑实质通道细胞培养明场图，B为芯片内脑胶质瘤细胞三维培养明场图，C为血脑屏障免疫荧光染色图，ZO‑1(红)、F‑actin(绿)、Dapi(蓝)分别用来识别脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和细胞核；[0039] 图4荧光素渗透性结果；[0040] 图5药物渗透性结果；A为三种模型药物(咖啡因、西咪替丁和多柔比星)的表观渗透系数数据统计图，B为槲皮素和汉黄芩素的表观渗透系数数据统计图；[0041] 图6细胞活/死染色结果；A为两种阳性药物(多西他赛和多柔比星)和两个中药活性单体成分(槲皮素和汉黄芩素)对芯片上无血脑屏障和有血脑屏障的U251细胞活/死染色结果图(绿色：活细胞；红色：死细胞)，B为上述细胞活/死情况统计图。[0042] 附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示：[0043] 1‑第一细胞培养室2‑第二细胞培养室[0044] 3‑第三细胞培养室4‑培养基通道[0045] 5‑第一细胞培养室液体注入口6‑第二细胞培养室液体注入口[0046] 7‑第三细胞培养室液体注入口8‑培养基通道液体注入口[0047] 9‑第一细胞培养室液体出口10‑培养基通道液体出口具体实施方式[0048] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。[0049] 实施例1：[0050] 一种微流控芯片，其结构参阅图1所示，所述微流控芯片包括第一细胞培养室1、第二细胞培养室2、第三细胞培养室3和培养基通道4，第一细胞培养室液体注入口5用于注入人周细胞和脑微血管内皮细胞，第二细胞培养室液体注入口6用于注入星形胶质细胞的纤维蛋白原和凝血酶混合液，第三细胞培养室液体注入口7用于注入脑胶质瘤细胞的基质胶混合液，培养基通道液体注入口8用于注入细胞培养基，所述第一细胞培养室1和培养基通道4中培养基每天定时更换。为了便于换液及收集渗透液体，在第一细胞培养室1和培养基通道4的另一侧对应设置第一细胞培养室液体出口9和培养基通道液体出口10，更换培养基时，缓慢谨慎向第一细胞培养室液体注入口5和第二细胞培养室液体注入口6注入培养基，从第一细胞培养室液体出口9和培养基通道液体出口10吸取培养基。[0051] 其中，第一细胞培养室1、第二细胞培养室2、第三细胞培养室3和培养基通道4的相邻通道间由多个微形柱分隔，微形柱间距离为150μm，通道高度为200～250μm，微形柱提供细胞三维培养支架和细胞间相互作用的桥梁。第一细胞培养室1、第二细胞培养室2和培养基通道4的通道宽度为2mm，第三细胞培养室3的通道宽度为1mm。[0052] 本发明提供的微流控芯片，该微流控芯片由上下两层不可逆键合形成，两层均为聚二甲基硅氧烷聚合物，上层含有通道，下层是空白层。所述微流控芯片的上下两层分别进行等离子体处理120s后进行键合，键合后的芯片进行高温高压灭菌处理。[0053] 实施例2：[0054] 一种基于微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法，按照以下步骤进行：[0055] 配置人脑微血管内皮细胞悬液、人星型胶质细胞悬液和人周细胞悬液，配置纤维蛋白原和凝血酶母液；将人星型胶质细胞混悬于与纤维蛋白原与凝血酶的混合溶液中，注入芯片中的脑实质通道，恒温凝胶化，在血管通道依次加入人周细胞和人脑微血管内皮细胞，形成血脑屏障微结构。隔天配置脑胶质瘤细胞悬液，与基质胶混合加入三维肿瘤通道(图2)。采用荧光显微镜对所述的血脑屏障芯片进行细胞形态鉴定，芯片细胞生长状况见图3。人脑微血管内皮细胞均匀分布在血管通道与脑实质通道的交界处，同时星形胶质细胞分布在脑实质通道中与脑微血管内皮细胞相互接触，成功形成了血脑屏障结构。[0056] 实施例3：应用血脑屏障‑脑胶质瘤芯片研究荧光素渗透性[0057] 利用实验室自行设计制作的微流控芯片，如图1所示。芯片处理后，采用上述细胞接种和培养方式建立血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型。7天连续动态培养，血管通道内加入FITC‑dextran标记物，分别加入20μL的4kDa或40kDa、70kDa的FITC‑dextran溶剂，观察荧光示踪剂的渗透行为，荧光显微镜记录通道内FITC‑dextran的荧光强度。图片采用ImageJ软件测定荧光强度，并计算荧光示踪剂表观渗透系数，其表观渗透系数计算公式是Papp＝C(t)V/C0A△T，1/PBBB＝1/Papp‑1/P0，其中Papp是表观渗透系数，C(t)是介质通道中分析物的浓度，V是样品体积，C0是在血管通道中分析物的浓度，A是血管通道和脑实质通道的接触面积，△T是分析时间，P0是在无细胞空白组的渗透系数，PBBB是分析物在BBB中的渗透系数。结果如图4所示。[0058] 结果显示，荧光示踪剂在芯片上的表观渗透系数在10‑6～10‑7cm/s之间，4kDa、‑40kDa、70kDa的FITC‑dextran在此共培养芯片模型中平均表观渗透系数分别为1.08×106 ‑7 ‑7cm/s、2.39×10 cm/s、2.98×10 cm/s，其表观渗透系数值随亲水性非离子荧光示踪剂的斯托克斯半径和分子量的增加而降低，且与体内数据相关，说明已成功构建了一个功能完整，选择渗透性的血脑屏障模型，并可以用于后续药物跨血脑屏障后药效研究。[0059] 实施例4：中药活性成分跨血脑屏障渗透性研究[0060] 利用实验室自行设计制作的微流控芯片，如图1所示。芯片处理后，采用上述细胞接种和培养方式建立血脑屏障模型。7天连续动态培养，血管通道内各自加入20μL的模型药物10μM的咖啡因、1μg/mL的西咪替丁和10μM的多柔比星，以及20μL的中药活性成分50μM的汉黄芩素和150μM的槲皮素。给药24h后采集渗透样品经液相色谱法分析，计算药物渗透系数，结果如图5所示。[0061] 几种药物在血脑屏障芯片中的表观渗透系数分别为：咖啡因3.69×10‑6cm/s，西咪‑6 ‑6 ‑8 ‑替丁3.2×10 cm/s，多柔比星2.63×10 cm/s，汉黄芩素5.70×10 cm/s，槲皮素4.84×108cm/s，药物的渗透趋势与荧光示踪剂的低渗透性一致，表明此微流控芯片模型具有比较完整的血脑屏障结构和功能。[0062] 实施例5：中药活性成分抗脑胶质瘤药效评价[0063] 利用实验室自行设计制作的微流控芯片，如图1所示。芯片处理后，采用上述细胞接种和培养方式建立血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型。7天连续动态培养，血管通道内各自加入20μL的阳性药物400μM的替莫唑胺和2.5μM的多西他赛，以及20μL的中药活性成分50μM的汉黄芩素和150μM的槲皮素。给药24h后，观察细胞在芯片内的生长和增殖的情况，结果如图6所示。[0064] 结果显示，与无血脑屏障组相比，血脑屏障与脑胶质瘤共培养组的肿瘤细胞存活率提高约15％‑30％。说明在血脑屏障与脑胶质瘤共培养组中，药物达到杀伤肿瘤细胞的药效需要更高的药物浓度，主要原因是通过血脑屏障的药物较少且扩散到肿瘤中的药物尚未达到有效浓度。本实施例的结果进一步凸显脑肿瘤模型中结合血脑屏障的重要意义，以及本发明的应用价值。[0065] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

专利地区：上海

专利申请日期：2022-01-24

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114480122B