用于抑制CAMK2G表达的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用

专利名称：用于抑制CAMK2G表达的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210116648.X

专利申请（专利权）人：孙良丹
权利人地址：安徽省合肥市蜀山区绩溪路218号

专利发明（设计）人：孙良丹,俞亚芬,甄琪,雍亮,李报

专利摘要：本发明属于银屑病药物技术领域，具体涉及一种用于抑制CAMK2G表达的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。根据本发明实施例可知，本发明的制剂能够有效地抑制皮肤交感神经内CAMK2G异常活化对γδT细胞IL‑17的刺激分泌，从而减轻银屑病皮肤部位IL‑17介导的免疫反应，达到治疗银屑病的效果。还可降低循环系统中性粒细胞NETs的产生，抑制病情的加重，从而起到治疗免疫缺陷性疾病的效果。

主权利要求：
1.6‑OHDA在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。 说明书 : 用于抑制CAMK2G表达的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中
的应用技术领域[0001] 本发明属于银屑病药物技术领域，具体涉及一种用于抑制CAMK2G表达的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。背景技术[0002] 银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，以免疫细胞浸润、表皮增生和角化细胞分化异常为特征。之前的研究已经发现角质形成细胞和免疫细胞相互作用产生细胞因子网络，特别是IL‑17家族及其后续信号级联，驱动银屑病的发展。银屑病的多基因遗传性揭示该病的发生发展可能与炎症、细胞增殖与凋亡、神经精神因素等多种因素有关。遗传易感性如何影响银屑病的进展，特别是哪种细胞类型牵涉到银屑病特异性基因改变仍然未知。以往的全基因组关联研究(GWAS)和meta分析发现了多种银屑病易感基因，这些针对银屑病易感基因组变异的研究也多次提示了银屑病易感基因与疾病表型、风险、机制的一些相关性。例如，基因型表型关联研究发现rs10852936与早发型银屑病(发病年龄<40岁)相关，rs72474224(GJB2)与寻常型银屑病临床特征相关，rs1020760(NFKB1)与家族史阳性的银屑病相关；基因‑基因交互作用(例如MHC‑LCE交互，MHC‑IL12B交互)可以增加银屑病风险；易感基因关联多种银屑病共病或其他免疫疾病，例如探索银屑病与SLE的共同易感位点，发现NFKBIA和IL28RA在两种疾病中达到全基因组关联显著性。一些功能性研究发现很多易感基因位于与特定性适应性和固有免疫途径有关的基因附近，这些基因包括抗原呈递(HLA‑C,ERAP1)、IL‑17/23轴活化(IL23R,IL23A,IL12B,TRAF3IP2)、先天抗病毒免疫/I型干扰素信号传导(RNF114,IFIH1)和皮肤屏障功能(LCE3B/3D)等。[0003] 银屑病作为复杂性疾病，并非单一因素所影响，寻找疾病的内在发生和调控机制，以及各种影响因素在疾病中的权重是未来高效选择疾病靶点的基础和先决条件。基因组变异作为疾病研究的上游，是研究疾病发病机制的询证源头，但目前对当前所发现的众多易感基因的下游机制研究仍然匮乏，尽管通过基因的关联分析往往能得到一些与疾病特征相关的提示性结果，但层面大都局限于对基因功能方向的初步判断，缺乏从蛋白水平、细胞动物模型水平和组织样本水平对易感基因在银屑病发病中作用机制的解析。即无法判断银屑病的发病机制，便无法对银屑病提供有效的药剂。发明内容[0004] 有鉴于此，本发明在遗传学基础上，找出与银屑病真正的显著相关的易感位点，采用多种功能学技术在蛋白、细胞动物模型和组织样本水平解析易感基因CAMK2G在银屑病发病中的作用机制。[0005] 本发明目的在于提供一种用于抑制CAMK2G表达的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。[0006] 进一步，所述CAMK2G表达包括CAMK2G转录和/或CAMK2G转录后的mRNA翻译。[0007] 具体地，在某些实施例中，银屑病患者外周血中的CAMK2G转录水平显著高于健康对照，银屑病小鼠外周中CAMK2G转录水平也高于对照组。银屑病患者外周血中的CAMK2G+细胞比例也显著高于健康对照。[0008] 本发明目的在于还提供一种用于抑制CaMK2γ蛋白活性的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。[0009] 具体地，在某些具体实施例中，银屑病小鼠皮肤中的CaMK2γ总蛋白水平和磷酸化的活性蛋白水平均高于对照组。不管是CaMK2γ总蛋白水平还是其磷酸化的活性形式，银屑病患者均显著高于健康对照组。[0010] 本发明目的在于还提供一种用于抑制中性粒细胞释放NETs的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。[0011] 具体地，在某些实施例中，银屑病患者中性粒细胞的CaMK2γ平均荧光强度(MFI)显著高于健康对照组,而在单核细胞(CD14+)和多个T细胞亚群中没有显著差异；循环系统中高表达CaMK2γ的细胞主要为中性粒细胞；银屑病患者中性粒细胞的CaMK2γ平均荧光强度(MFI)显著高于健康对照组,而在单核细胞(CD14+)和多个T细胞亚群中没有显著差异；屑病患者血液中性粒细胞中CAMK2G的转录水平显著高于健康对照组。[0012] 本发明目的在于还提供一种用于去除γδT细胞的制剂或用于抑制γδT细胞生长的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。[0013] 进一步，所述γδT细胞为真皮γδT细胞。[0014] 具体地，在某些具体实施例中，在IMQ处理的WT小鼠背部皮肤中，IL‑17A主要由真‑/‑皮γδT细胞产生，而很少在表皮γδT细胞和αβT细胞中表达。在IMQ处理的Camk2g 小鼠中，IL‑17A+真皮γδT细胞明显低于IMQ处理的WT小鼠，而IL‑17A+表皮γδT细胞和IL‑17A+αβT细胞则保持不变。[0015] 具体地，在某些具体实施例中，，向γδT细胞缺陷小鼠(Tcrd‑/‑)皮下注射SAL，发现由于缺乏γδT细胞，SAL对银屑病表型和炎症浸润的促进作用被抵消。[0016] 本发明目的在于还提供一种用于去除或抑制皮肤组织交感神经活性的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。[0017] 进一步，所述去除或抑制皮肤组织交感神经活性的制剂为6‑OHDA。[0018] 具体地，在某些实施例中，皮肤组织的CaMK2γ主要表达于交感神经纤维中，银屑病患者皮肤中CaMK2γ+交感神经多于健康皮肤；皮肤交感神经去除减少了IMQ诱导的小鼠银屑病样表型；在去除交感神经的皮肤中IL‑17A+γδT细胞减少，表明皮肤交感神经通过调节γδT细胞产生IL‑17影响银屑病样皮肤炎症。[0019] 具体地，在某些具体实施中，6‑OHDA诱导的SH‑SY5Y细胞损伤可以导致胞内TH转录水平的降低，敲除CAMK2G基因也可降低TH转录水平；6‑OHDA诱导的SH‑SY5Y细胞损伤对CAMK2G表达无显著影响[0020] 本发明目的在于提供一种用于抑制皮肤中交感神经分泌去甲肾上腺素的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。[0021] 具体地，在某些具体实施例中，皮下注射NE加重了IMQ诱导的银屑病样表型，增加了小鼠皮肤中IL‑17A+γδT细胞的比例,更重要的是，给药NE抵消了CAMK2G缺失引起的IL‑‑/‑17A+γδT细胞减少；注射NE后，IMQ诱导的WT和Camk2g 小鼠的皮肤厚度差异消失。[0022] 本发明目的在于还提供一种用于抑制皮肤中酪氨酸羟化酶生成或增长的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。[0023] 具体地，在某些具体的实施例中，TH和pTH的显著降低证实了皮肤局部交感神经的失活。[0024] 本发明目的在于还提供一种ADRB2抑制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。[0025] 进一步，所述ADRB2抑制剂为ICI118551。[0026] 具体地，在某些具体实施中，注射了ICI的小鼠银屑病表型减轻；在IMQ诱导的小鼠皮肤中，注射ICI降低皮肤γδT‑17细胞的比例。[0027] 本发明目的在于还提供一种用于抑制p38磷酸化的制剂在制备用于治疗银屑病的药剂中的应用。[0028] 具体地，在某些具体实施中，SAL处理增强了IMQ诱导的皮肤中p38的激活，而ICI‑/‑处理显示了抑制作用；Camk2g 小鼠皮肤中p38磷酸化被抑制，NE注射增加并恢复了p38磷酸化。[0029] 本发明有益效果在于[0030] 根据本发明实施例可知，本发明的制剂能够有效地抑制皮肤交感神经内CAMK2G异常活化对γδT细胞IL‑17的刺激分泌，从而减轻银屑病皮肤部位IL‑17介导的免疫反应，达到治疗银屑病的效果。还可降低循环系统中性粒细胞NETs的产生，抑制病情的加重，从而起到治疗免疫缺陷性疾病的效果。附图说明[0031] 图1为实施例设计流程图。[0032] 图2A为银屑病患者外周血中的CAMK2G转录水平。[0033] 图2B为屑病患者外周血中的CAMK2G+细胞比例。[0034] 图2C为银屑病小鼠外周中Camk2g转录水平。[0035] 图2D为银屑病小鼠皮肤中的CaMK2γ总蛋白水平和磷酸化的活性蛋白水平。[0036] 图3A为CaMK2γ在皮肤神经中表达情况。[0037] 图3B为银屑病患者皮肤中CaMK2γ+交感神经情况。[0038] 图4A为循环系统中高表达CaMK2γ的细胞情况。[0039] 图4B为银屑病患者中性粒细胞的CaMK2γ平均荧光强度(MFI)。[0040] 图4C为银屑病患者血液中性粒细胞中CAMK2G的转录水平。[0041] 图4D为银屑病患者血液中性粒细胞中CaMK2γ总蛋白水平和其磷酸化蛋白水平。[0042] 图5A为Camk2g‑/‑小鼠皮肤切片H&E染色情况。[0043] 图5B为Camk2g‑/‑小鼠PASI评分情况。[0044] 图5C为银屑病皮损典型的炎症浸润细胞流式分群方法情况。[0045] 图5D为IMQ诱导的Camk2g‑/‑小鼠背部皮肤典型的炎症浸润细胞情况。[0046] 图5E为Camk2g‑/‑小鼠皮肤中标志炎性因子基因的表达情况。[0047] 图6A为流式检测IMQ处理的WT小鼠背部皮肤中IL‑17A表达细胞情况。[0048] 图6B为流式细胞分析不同小鼠模型细胞情况。[0049] 图6C为IMQ处理的Camk2g‑/‑小鼠的IL‑17A+真皮γδT细胞情况。[0050] 图6D为IMQ处理的Camk2g‑/‑小鼠的IL‑17A+表皮γδT细胞情况。[0051] 图6E为IMQ处理的Camk2g‑/‑小鼠的IL‑17A+αβT细胞情况。[0052] 图7A为IMQ处理Camk2g‑/‑小鼠的皮肤TH磷酸化情况。[0053] 图7B为IMQ处理的Camk2g‑/‑小鼠的皮肤中去甲肾上腺素(NE)水平。[0054] 图7C为IMQ处理的Camk2g‑/‑小鼠的皮肤中多巴胺水平。[0055] 图7D为皮下注射NE与IMQ诱导小鼠银屑病样表型实验流程。[0056] 图7E为皮下注射NE后小鼠皮肤中IL‑17A+γδT细胞的比例。[0057] 图7F为皮下注射NE后小鼠与CAMK2G缺失引起的IL‑17A+γδT细胞变化情况。[0058] 图7G为皮下注射NE后IMQ诱导的WT和Camk2g‑/‑小鼠的皮肤厚度情况。[0059] 图8A为IMQ处理前对小鼠进行皮内注射6‑OHDA。[0060] 图8B为免疫荧光检测皮内注射6‑OHDA后小鼠皮肤组织交感神经分布。[0061] 图8C为westernblot检测皮内注射6‑OHDA后小鼠TH和pTH表达情况。[0062] 图8D为皮内注射6‑OHDA后小鼠皮肤表型。[0063] 图8E为皮内注射6‑OHDA后小鼠银屑病样表型。[0064] 图8F为皮内注射6‑OHDA后小鼠皮肤中IL‑17A+γδT细胞情况。[0065] 图8G为皮内注射6‑OHDA后小鼠皮肤中NE情况。[0066] 图9A为6‑OHDA诱导的SH‑SY5Y细胞损伤与胞内TH转录水平。[0067] 图9B为6‑OHDA诱导的SH‑SY5Y细胞损伤对CAMK2G表达影响。[0068] 图9C为6‑OHDA诱导的SH‑SY5Y细胞损伤对CAMK2G总蛋白和磷酸化水平影响。[0069] 图10A为IMQ诱导的银屑病小鼠皮肤组织的RNA测序情况。[0070] 图10B为银屑病患者皮损和健康对照皮肤的免疫组化分析。[0071] 图10C为表达IL‑17的细胞表达β2‑AR情况。[0072] 图10D为IMQ处理使小鼠皮肤中β2‑AR+T细胞比例情况。[0073] 图11A为向IMQ诱导的小鼠皮下注射SAL情况。[0074] 图11B为注射了SAL的IMQ诱导的小鼠的皮肤情况。[0075] 图11C为注射了SAL的IMQ诱导的小鼠的背部皮肤厚度，红斑和鳞屑的情况。[0076] 图11D为注射SAL的IMQ诱导的小鼠IL‑17A产生情况。[0077] 图12A为皮下注射ICI的IMQ诱导的小鼠试验流程。[0078] 图12B为皮下注射ICI的IMQ诱导的小鼠皮肤情况。[0079] 图12C为皮下注射ICI的IMQ诱导的小鼠背部皮肤厚度，红斑和鳞屑的情况。[0080] 图12D为皮下注射ICI的IMQ诱导的小鼠的γδT‑17细胞比例。[0081] 图13A为γδT细胞缺陷小鼠(Tcrd‑/‑)皮下注射SAL后皮肤表型。[0082] 图13B为γδT细胞缺陷小鼠(Tcrd‑/‑)皮下注射SAL后皮肤中嗜中性粒细胞比例。[0083] 图13C为γδT细胞缺陷小鼠(Tcrd‑/‑)皮下注射SAL后皮肤中单核细胞比例。[0084] 图13D为γδT细胞缺陷小鼠(Tcrd‑/‑)皮下注射SAL后αβT细胞产生IL‑17情况。[0085] 图14A为PMA和离子霉素(Ion)协同刺激下的T细胞促炎细胞因子产生情况。[0086] 图14B为ICI刺激下的T细胞促炎细胞因子产生情况。[0087] 图15A为在PMA/离子激活的JurkatT细胞中的p38、ERK和JNK的激活情况。[0088] 图15B为SAL处理后IMQ诱导的皮肤中p38磷酸化情况。[0089] 图15C为ICI处理后IMQ诱导的皮肤中p38磷酸化情况。[0090] 图15D为IMQ处理的WT小鼠中p38磷酸化情况。[0091] 图16A为在PMA激活的HL‑60细胞中的CaMKII‑IN1和KN93抑制MPO、弹性蛋白酶和PAD4表达。[0092] 图16B为抑制CaMK2γ活性与细胞内ROS的情况。[0093] 图16C为抑制CaMK2γ活性与NCF1、NCF2和NOX2的mRNA水平情况。具体实施方式[0094] 所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。[0095] 本发明实施例中，根据图1所示的设计流程图进行试验设计。[0096] 本发明实施例中，IMQ指的是咪喹莫特(imiquimod)，是Toll样受体(Toll‑like receptor，TLR)7,8的激动剂。[0097] 本发明实施例中，术语“激动剂”是指与某生物活性物质的受体结合，呈现该活性物质的作用的物质或药品。[0098] 本发明实施例中，术语“拮抗剂”是指能与受体结合，但不具备内在活性的一类物质。拮抗剂分为竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂。[0099] 本发明实施例中，“PMA”和“离子霉素(Ion)”是用来活化Jurkat细胞，只有活化的Jurkat细胞才能高表达炎症因子。[0100] 本发明实施例中，“CaMK2γ”是CAMK2G基因表达的蛋白产物之一。[0101] 本发明实施例中，“CAMK2G+细胞”指的是表达CAMK2G蛋白的细胞。[0102] 本发明实施例中，“IMQ诱导Camk2g‑/‑银屑病小鼠模型”指的是用IMQ诱导的CAMK2G基因敲除小鼠；“IMQ诱导的野生小鼠模型”指的是用IMQ诱导的野生小鼠。[0103] 实施例1易感基因CAMK2G在银屑病中的表达检测[0104] 本发明实施例中，为了检测易感基因CAMK2G与银屑病的表达相关性，分别对银屑病患者和银屑病小鼠的血液和皮肤组织中CAMK2G的表达情况进行了检测，RT‑qPCR和流式检测结果显示银屑病患者外周血中的CAMK2G转录水平显著高于健康对照(图2A)，且银屑病患者外周血中的CAMK2G+细胞比例也显著高于健康对照(图2B)；银屑病小鼠外周中CAMK2G转录水平也高于对照组(图2C)。[0105] 现有文献公开，CAMKIIγ在许多Ca2+介导的信号通路中发挥第二信使的效应，当胞2+ 2+内Ca 处于基础水平，其自身抑制维持在一个休眠状态，当胞内Ca 水平的增加，其发生自体磷酸化而解除抑制状态，Thr287位点磷酸化是CaMK2γ的活性形式。[0106] 目前市场上缺少磷酸化CaMK2γ特异性的抗体，然而，小鼠皮肤RNA‑seq结果显示CaMK2γ是皮肤组织中CAMKII家族表达水平最高的成员，因此，本发明实施例使用Phospho‑CaMKII(Thr287)抗体来检测皮肤组织活性CAMK2γ水平，Westernblot检测发现银屑病小鼠皮肤中的CaMK2γ总蛋白水平和磷酸化的活性蛋白水平均高于对照组(图2D)。[0107] 实施例2CaMK2γ在皮肤组织中的表达定位[0108] 本发明实施中，为了验证CAMK2G是否在皮肤组织中的神经细胞中高表达，对来自健康对照和银屑病患者的皮肤样本进行CaMK2γ(红色)和泛神经元标记物β3‑tubulin(绿色)的共染色，免疫荧光结果显示，CaMK2γ在皮肤神经神经中表达，但并非所有神经细胞都为CaMK2γ阳性(图3A)。即CaMKII家族成员在神经细胞中高表达，皮肤神经由交感神经和几种类型的感觉神经纤维组成。[0109] 本发明实施例中，进一步用识别交感纤维的酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)(绿色)与CaMK2γ(红色)进行免疫荧光共染色，结果显示，皮肤组织的CaMK2γ主要表达于交感神经纤维中，银屑病患者皮肤中CaMK2γ+交感神经多于健康皮肤(图3B)。[0110] 实施例3CaMK2γ在循环系统中的表达定位[0111] 本发明实施例中，使用流式细胞术比较人外周血CD16+CD66b+中性粒细胞和非中性粒细胞CD16+CD66b‑细胞、CD16‑CD66b‑细胞中CaMK2γ的平均荧光强度(MFI)，结果显示，循环系统中高表达CaMK2γ的细胞主要为中性粒细胞(图4A)。[0112] 本发明实施中，为了进一步检测CaMK2γ在银屑病患者外周血几种代表性免疫细胞中的改变，对患者和健康对照外周血不同免疫细胞亚群进行流式细胞术分析，结果显示，银屑病患者中性粒细胞的CaMK2γ平均荧光强度(MFI)显著高于健康对照组,而在单核细胞(CD14+)和多个T细胞亚群中没有显著差异(图4B)。[0113] 本发明实施例中，为了进一步检测银屑病患者循环系统中中性粒细胞内CAMK2G表达的改变，利用磁珠分选的方法分别从银屑病患者和健康对照的血液中分离出高纯度中性粒细胞，RT‑qPCR检测发现银屑病患者血液中性粒细胞中CAMK2G的转录水平显著高于健康对照组(P＝0.0079)(图4C)。Westernblot检测显示，不管是CaMK2γ总蛋白水平还是其磷酸化的活性形式，银屑病患者均显著高于健康对照组(图4D)。[0114] 实施例4IMQ诱导的Camk2g‑/‑银屑病小鼠模型建立[0115] 本发明实施例中，为了进一步研究CAMK2G在银屑病中的作用机制，建立了IMQ诱导‑/‑的Camk2g 银屑病小鼠模型。[0116] 本发明实施例中，IMQ诱导的Camk2g‑/‑银屑病小鼠模型的建立步骤包括：取7周龄‑/‑WT(n＝5)或Camk2g 小鼠(n＝5)剃除背部毛发，裸露皮肤面积为2cm×2cm。将62.5毫克的IMQ乳膏或对照剂VAS均匀涂抹在小鼠暴露的皮肤上，连续涂抹4天，每天进行PASI评分。第5天对小鼠实施安乐死，取皮肤、脾脏和血液进行检测。[0117] 本发明实施例中，皮肤组织用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切成4μm切片进行H&E染色。[0118] 本发明实施例中，H&E染色的图像是使用立式显微镜(OlympusBX53)在10倍(×100)视野中获得的。[0119] 本发明实施例中，小鼠模型炎症评分方法为：在临床PASI评分的基础上开发了客观评分系统。红斑、鳞屑和增厚的评分从0到4：0，无；1，轻度；2，中度；3，明显；4，非常显著。使用基于红斑强度的记分表对红斑程度进行评分。累积评分(红斑+鳞片+增厚)可作为衡量炎症严重程度的指标(评分0‑12)。[0120] 皮肤切片H&E染色和PASI评分结果表明，IMQ诱导的Camk2g‑/‑小鼠模型与IMQ诱导‑/‑的野生型小鼠相比，Camk2g 小鼠的银屑病样表型明显减弱，反映出背部皮肤厚度减少，红斑和鳞屑减轻(图5A，5B)。[0121] 本发明实施例中，使用特异的标记抗体对分离出的小鼠皮肤免疫细胞进行分群，其中单核细胞和中性粒细胞是银屑病皮损典型的炎症浸润细胞(图5C)。流式检测显示，‑/‑IMQ诱导的Camk2g 小鼠背部皮肤炎症浸润显著减少(图5D)。[0122] 本发明实施例中，皮肤免疫细胞分离步骤包括：充分切碎皮肤，在消化酶中37℃，225rpm消化1.5h，消化酶配方如下：将1.2gBSA(Biofoxx,4240GR100)，0.12g1型胶原酶(Sigma,C0130‑5G)，0.06g4型胶原酶(Worthington,LS004189)和0.06g透明质酸酶(Sigma,H3506‑5G)溶于30mlDMEM(HyClone，SH30022.01)，加入1mg/mlDNase(Yuanye，S10073)150μl，继续消化30分钟。消化完成后，细胞悬液通过70‑μm过滤器过滤。细胞悬液在4℃、2000rpm下离心8min，去掉上清液后收集细胞颗粒。细胞悬浮在6ml40％淋巴细胞分离液(5.4mlPercoll(GEHealthcare，17‑0891‑09)+520μlHank‘sSolution(Beyotime，C0219)+44μl2×HepesBuffer(Solarbio，H1080‑100)+8.946mlPBS)。然后，用6ml80％淋巴细胞分离液(5.4mlPercoll+520μlHank‘sSolution+44μl2×Hepes Buffer+1.491mlPBS)缓慢加入管壁，清楚地将液体分成两层。分离液在4℃、2000rpm下离心20min，离心提升力保持最小。离心后的液体可分为4层。自上而下有40％的淋巴细胞分离液、淋巴细胞、80％的淋巴细胞分离液和细胞碎片。淋巴细胞被小心地转移到新的离心管中，并用10mlPBS彻底清洗。溶液在4℃和2000rpm下离心8min，去掉上清液后收集细胞颗粒。然后，每个细胞膜表面抗体取1μl加入50μl的PBS中，与细胞混合，室温避光孵育30min。用3mlPBS洗涤细胞，在4℃和2000rpm下离心5min，去掉上清液收集细胞颗粒,检测前根据细胞体积将细胞悬浮于300‑600μlPBS中。如果需要染胞内抗体，则直接向细胞沉淀中加入1ml细胞通透剂(固定/渗透浓缩液(Invitrogen,00‑5123‑43)：eBioscienceFixation/Perm稀释剂(Invitrogen,00‑5223‑56)＝1：3)，室温避光孵育60min。在50μl的PBS中加入适量胞内抗体，与细胞混合，室温避光40min。用3mlPBS洗涤细胞，在4℃和2000rpm下离心5min。丢弃上清液，收集细胞颗粒。检测前根据细胞体积将细胞悬浮于300‑600μlPBS中。[0123] 本发明实施例中，使用的表面抗体有：CD45‑FITC(eBioscience,REF11‑0451‑82)，CD11bPE‑Cy7(BD，552850)，LY‑6G‑BV605(BD，563005)，Ly‑6CPE(BD，560592)，CD11CPE‑CF594(BD，562454)。[0124] 本发明实施例中，对一些已知与银屑病关系密切且在银屑病皮损中表达较高的促‑/‑炎基因进行了定量PCR，包括Il17a、Il17f、Il6、Il22、IL1b和Tnfa。结果显示，Camk2g 小鼠皮肤中这些标志基因的表达显著降低(图5E)。[0125] 实施例5CaMK2γ对银屑病小鼠皮肤中γδT‑17细胞的调控[0126] 中性粒细胞和单核细胞募集到银屑病病变是银屑病发病的特征。现有文献公开：中性粒细胞和单核细胞是由关键效应细胞因子IL‑17驱动的。IL‑17可由多种细胞类型释放，如Th17细胞、Tc17细胞、γδT‑17细胞、ILC3等。[0127] 本发明实施例中，在IMQ处理的WT小鼠背部皮肤进行流式检测，流式结果显示，在IMQ处理的WT小鼠背部皮肤中，IL‑17A主要由真皮γδT细胞产生，而很少在表皮γδT细胞和αβT细胞中表达(图6A)。[0128] 本发明实施例中，为了研究CaMK2γ是否影响IMQ处理的小鼠皮肤中IL‑17的产生，使用流式细胞术分析IL‑17+细胞在不同皮肤T细胞亚群中的比例，结果如图6B所示。在IMQ‑/‑处理的Camk2g 小鼠中，IL‑17A+真皮γδT细胞明显低于IMQ处理的WT小鼠(图6C)，而IL‑17A+表皮γδT细胞和IL‑17A+αβT细胞则保持不变(图6D，6E)。[0129] 实施例7皮肤CaMK2γ+交感神经对γδT‑17细胞的调控[0130] 现有文献公开：酪氨酸羟化酶(TH)是儿茶酚胺(包括多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素)生物合成中的限速酶，用于鉴别皮肤中的交感神经，CaMKII家族成员在一些神经元群体中通过刺激TH磷酸化参与调控儿茶酚胺的生物合成。[0131] 本发明实施例通过westernblot检测发现IMQ处理导致小鼠皮肤TH磷酸化显著上调，而CAMK2G缺失减弱了这种增强效应(图7A)。[0132] 本发明实施例中通过ELISA检测小鼠皮肤中儿茶酚胺神经递质的分泌，发现IMQ处‑/‑理的Camk2g 小鼠的皮肤中NE水平低于WT小鼠，然而皮肤中的多巴胺没有差异(图7B，7C)。[0133] 本发明实施例中，皮下注射NE加重了IMQ诱导的银屑病样表型，增加了小鼠皮肤中IL‑17A+γδT细胞的比例,更重要的是，给药NE抵消了CAMK2G缺失引起的IL‑17A+γδT细胞减少(图7D、7E/7F)，证明交感神经确实是皮肤中NE的主要来源。[0134] 本发明实施例中，注射NE后，IMQ诱导的WT和Camk2g‑/‑小鼠的皮肤厚度差异消失(图7G)。这些证据表明，CaMK2γ对IMQ诱导的皮肤炎症的调控可能与皮肤交感神经分泌NE有关，皮肤中CaMK2γ+交感神经通过分泌NE局部调节γδT细胞IL‑17A的产生。[0135] 实施例8去除皮肤交感神经对小鼠模型银屑病表型的影响[0136] 现有文献公开：6‑羟多巴胺(6‑OHDA)是儿茶酚胺能神经元的选择性神经毒素，用于去除交感神经。腹腔注射6‑OHDA可以减轻IMQ诱导的耳肿胀，但不影响IL‑17的产生，归因于心血管效应和/或全身性交感神经切除后引起的全身性免疫失调。[0137] 本发明实施例中，为了观察皮肤局部交感神经切除术对银屑病小鼠的影响，在IMQ处理前对小鼠进行皮内注射6‑OHDA(图8A)，免疫荧光和westernblot检测发现,TH和pTH(甲状旁腺激素)的显著降低证实了皮肤局部交感神经的失活(图8B,8C)。随后的研究证明，皮肤交感神经去除减少了IMQ诱导的小鼠银屑病样表型(图8D,8E)。此外，在去除交感神经的皮肤中IL‑17A+γδT细胞减少，表明皮肤交感神经通过调节γδT细胞产生IL‑17影响银屑病样皮肤炎症(图8F)。在交感神经去除的皮肤中NE的减少表明交感神经可能通过分泌NE调节γδT细胞IL‑17的产生(图8G)。[0138] 实施例9敲除CAMK2G基因对6‑OHDA损伤的SH‑SY5Y细胞的影响[0139] 本发明实施例为了进一步研究CaMK2γ是否直接影响交感神经内TH的表达，运用RNAi的方法，敲低人神经母细胞瘤细胞(SH‑SY5Y)内的CAMK2G，SH‑SY5Y是一种分化程度较低的肿瘤细胞，其与实时在体的多巴胺能神经元在形态、生理及生化功能方面具有较高的相似性，可组成型表达TH。qPCR检测结果表明，6‑OHDA诱导的SH‑SY5Y细胞损伤可以导致胞内TH转录水平的降低，敲除CAMK2G基因也可降低TH转录水平(图9A)。6‑OHDA诱导的SH‑SY5Y细胞损伤对CAMK2G表达无显著影响(图9B)。westernblot检测显示，敲除CAMK2G基因能显著降低CaMK2γ的总蛋白水平与pTH水平,6‑OHDA诱导的SH‑SY5Y细胞损伤也降低CaMK2γ的总蛋白水平与pTH水平，另外，6‑OHDA诱导的SH‑SY5Y细胞损伤可能导致CaMKII家族其他成员磷酸化水平升高(图9C)。[0140] 实施例10NE受体在皮肤中的表达模式[0141] 本发明实施例中，对IMQ诱导的银屑病小鼠皮肤组织进行RNA测序(RNA‑seq)，结果显示，ADRB2(β2‑AR)是皮肤中主要的NE受体表达(图10A)。[0142] 本发明实施中，对银屑病患者皮损和健康对照皮肤进行免疫组化分析，结果显示，β2‑AR在浸润于真皮部位的免疫细胞上表达(图10B)。[0143] 本发明实施例通过免疫荧光和流式细胞分析发现，大部分表达IL‑17的细胞表达β2‑AR(图10C)，IMQ处理使小鼠皮肤中β2‑AR+T细胞比例升高(图10D)。[0144] 实施例11β2‑AR激活剂对小鼠模型银屑病表型的调控[0145] 本发明实施例中，为了进一步研究NE是否通过β2‑AR直接影响γδT‑17细胞，向IMQ诱导的小鼠皮下注射Salmeterolxinafoate(SAL，一种选择性ADRB2激动剂)(图11A)。结果显示，与对照组相比，注射了SAL的小鼠银屑病表型加重，包括背部皮肤厚度增加，红斑和鳞屑加剧(图11B，11C)。在IMQ诱导的小鼠皮肤中，注射SAL促进γδT细胞产生IL‑17A(图11D)。[0146] 实施例12β2‑AR拮抗剂对小鼠模型银屑病表型的调控[0147] 本发明实施例中，向IMQ诱导的小鼠皮下注射ICI118,551(ICI，一种选择性ADRB2拮抗剂)(图12A)。结果显示，与对照组相比，注射了ICI的小鼠银屑病表型减轻(图12B，12C)。在IMQ诱导的小鼠皮肤中，注射ICI降低皮肤γδT‑17细胞的比例(图12D)。[0148] 实施例13NE‑ADRB2信号通路调控γδTcells分泌IL‑17[0149] 本发明实施例中，向γδT细胞缺陷小鼠(Tcrd‑/‑)皮下注射SAL，发现由于缺乏γδT细胞，SAL对银屑病表型和炎症浸润的促进作用被抵消(图13A、13B、13C)。而SAL对αβT细胞产生IL‑17的能力无影响(图13D)。结合之前的结果，皮肤中NE的主要来源于皮肤交感神经，通过NE‑ADRB2信号通路介导γδT细胞释放IL‑17，而不是αβT细胞。[0150] 实施例14在细胞模型中验证β2‑AR的免疫调控作用[0151] 本发明实施例中，为了研究ADRB2如何调节γδT细胞的炎症反应，分别用ADRB2激动剂Salmeterolxinafoate和拮抗剂ICI118551刺激Jurkat细胞(一种永生的人类T淋巴细胞)。发现在PMA和离子霉素(Ion)协同刺激下，高浓度的SAL增加T细胞促炎细胞因子IL‑17A、TNF‑α和IL‑22的产生(图14A)。相反，ICI降低了这些细胞因子的产生(图14B)。[0152] 实施例15NE‑ADRB2‑p38信号通路的验证[0153] 本发明实施例中，在PMA/离子霉素激活2h后的JurkatT细胞中，使用SAL刺激4h显著增加p38磷酸化，而使用ICI处理4h则抑制p38磷酸化。但它们并不影响MAPK家族的另两个成员ERK和JNK的激活(图15A)。这表明ADRB2调控T细胞的活化，依赖于p38的磷酸化，而不是ERK和JNK。这和现有文献已有报道p38磷酸化促进自身免疫性关节炎中Th17细胞的增殖一致。p38MAP激酶信号通路在外周血免疫系统中T细胞的活化和分化中发挥作用。[0154] 本发明实施例中，还检测了在PMA/离子激活的JurkatT细胞的小鼠皮肤中的p38水平，发现p38磷酸化被IMQ激活。SAL处理增强了IMQ诱导的皮肤中p38的激活，而ICI处理显示了抑制作用(图15B，15C)。[0155] 本发明实施中，在PMA/离子激活的JurkatT细胞后，与IMQ处理的WT小鼠相比，‑/‑Camk2g 小鼠皮肤中p38磷酸化被抑制。NE注射增加并恢复了p38磷酸化(图15D)。[0156] 这些结果表明，CaMK2γ通过激活NE‑ADRB2‑p38通路促进T细胞产生IL‑17。[0157] 实施例16CaMK2γ通过促进NAPDH氧化酶复合物亚基蛋白的合成，刺激中性粒细胞胞内ROS的产生，从而调控NETs的形成[0158] 现有文献公开：虽然产生IL‑17的T细胞长期以来一直是银屑病免疫学研究的主流，但中性粒细胞作为先天免疫系统中数量最多的细胞，在银屑病发生发展中的作用也备受关注。活化的中性粒细胞产生增强的呼吸爆发，并伴有活性氧(ROS)的产生，最终导致NETosis的发生。NETosis是一种不同于细胞凋亡和坏死的中性粒细胞死亡形式。NETosis伴随着NETs的形成。NETs释放髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)等蛋白酶，这些蛋白酶参与炎症介质的水解激活和银屑病自身抗原的形成NETs。HL60是一种骨髓细胞系，具有通过DMSO刺激分化为中性粒细胞的潜力。CaMK2γ是CAMK家族在HL‑60细胞中表达水平和活性最高的成员。[0159] 本发明实施例中，为了研究CaMK2γ是否参与激活中性粒细胞中NETs的形成，应用了两种CaMKII抑制剂CaMKII‑IN1和KN93。结果发现，在PMA激活的HL‑60细胞中，CaMKII‑IN1和KN93均抑制了MPO、弹性蛋白酶和PAD4的释放，表明抑制中性粒细胞中的CaMK2γ活性可以减弱NETs的形成(图16A)。[0160] 本发明实施例中，还发现，抑制CaMK2γ活性降低了细胞内ROS的生成(图16B)和NCF1、NCF2和NOX2的mRNA水平(图16C)，这些mRNA可产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAPDH)氧化酶复合物的蛋白亚基，有研究发现NAPDH氧化酶复合物是细胞内ROS的主要来源。[0161] 本发明实施例表明，活化的CaMK2γ通过促进NAPDH氧化酶复合物亚基蛋白的合成，刺激中性粒细胞胞内ROS的产生，从而调控NETs的形成。解释了循环系统中CAMK2γ参与银屑病进展的机制。[0162] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

专利地区：安徽

专利申请日期：2022-02-07

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114452392B