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简便RNA建库方法发明专利

更新时间:2024-07-01
简便RNA建库方法发明专利 专利申请类型:发明专利;
源自:上海高价值专利检索信息库;

专利名称:简便RNA建库方法

专利类型:发明专利

专利申请号:CN202111682559.3

专利申请(专利权)人:翌圣生物科技(上海)股份有限公司
权利人地址:上海市浦东新区天雄路166弄1号楼402室

专利发明(设计)人:宋东亮,王嫚,侯策,刘倩,孙睿,江翱,陈晶晶,曹振

专利摘要:本发明提供一种简便RNA建库方法,其特征在于:其步骤包括:(1)提取样本中RNA,加入逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针并片段化;(2)RNA逆转录,获得DNA/RNA杂交双链;(3)接头连接:使用T4 DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA 3’端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头;(4)文库扩增及回收。本发明的简便RNA建库方法,利用DNA连接酶突变体K159L可以高效连接DNA/RNA杂交链的原理,只需要RNA片段化、逆转录、接头连接、文库扩增和磁珠回收5步,极大地简化了RNA建库的流程和耗时。结合使用rRNA逆转录阻碍探针快速去除rRNA的技术,可以在一管内完成rRNA去除和RNA建库。整个过程仅需2h,操作简单、RNA损失小、成本低,非常适用于RNA自动化建库和低丰度RNA建库。

主权利要求:
1.一种简便RNA建库方法,其特征在于:其步骤包括:(1)提取样本中RNA,加入逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针并片段化;
(2)RNA逆转录,获得DNA/RNA杂交双链;
(3)接头连接:使用T4DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA3’端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头;
(4)文库扩增及回收;
步骤(1)中逆转录引物序列为GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCN6‑20,其中N6‑20为6‑
20个碱基的随机引物;
步骤(3)中平末端双链DNA接头是由AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT和CTCTTCCGATCT两条序列退火形成的双链DNA接头。
2.根据权利要求1所述的简便RNA建库方法,其特征在于:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT长链的5’端预腺苷化,3’端进行NH2C6修饰或者ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭;CTCTTCCGATCT短链的3’进行ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭。
3.根据权利要求2所述的简便RNA建库方法,其特征在于:双链DNA接头中长链与短链按照1:2‑1:100的摩尔浓度比例混合后进行退火。
4.根据权利要求2所述的简便RNA建库方法,其特征在于:双链DNA接头使用浓度为
0.01‑1uM。
5.根据权利要求2所述的简便RNA建库方法,其特征在于:步骤(3)的连接反应使用的反应缓冲液中包含10‑200mM三羟甲基氨基甲烷、3‑30mM氯化镁、3‑30mM二硫苏糖醇和
3‑30%聚乙二醇8000。
6.根据权利要求1所述的简便RNA建库方法,其特征在于:逆转录引物的使用浓度为10‑
500uM。
7.根据权利要求6所述的简便RNA建库方法,其特征在于:步骤(1)中片段化的程序为95℃7min,75℃1min,55℃1min,保存于25℃。
8.根据权利要求1所述的简便RNA建库方法,其特征在于:步骤(2)中逆转录体系包括逆转录酶,所述逆转录酶为AMV、M‑MLV、TGIRT和RTX逆转录酶的一种或多种,所述逆转录酶的使用浓度为5‑1000uM。
9.根据权利要求8所述的简便RNA建库方法,其特征在于:逆转录反应体系还包含10‑
100mM三羟甲基氨基甲烷、50‑150mM氯化钾、1‑5mM氯化镁、2‑10mM二硫苏糖醇和0.2‑
5U的RNA酶抑制剂;逆转录反应的程序为25℃10min,42℃15min,70℃5min。 说明书 : 简便RNA建库方法技术领域[0001] 本发明专利涉及一种简便RNA建库方法,属于生物技术领域。背景技术[0002] RNA二代测序技术(RNANext‑generationsequencing,RNA‑seq)是一种高通量大规模的RNA并行测序技术,可以同时对几十万乃至几百万个RNA分子进行序列测定,用于未知病原的鉴定、生物遗传进化分析、基因表达差异分析和RNA合成及加工分析等。因此,RNA‑seq广泛用于科学研究和疾病诊断等领域,并取得了许多突破性的结果。[0003] RNANGS文库构建是指通过逆转录和接头连接等过程将RNA转化为二代测序仪可识别的双链DNA的过程,是RNA‑seq的关键步骤。传统的RNA建库方法操作繁琐,需要通过RNA片段化、逆转录、二链合成、磁珠回收、末端修复、接头连接、磁珠回收、文库扩增和磁珠回收等9个步骤才能完成RNA文库的构建,整个流程操作繁琐,RNA损失严重、耗时长(需要5个小时),非常不适合自动化建库和低丰度RNA建库。此外,由于RNA中包含90%左右的核糖体RNA(rRNA),因此在RNA建库前需要进行rRNA的去除。常规的RNaseH切割法和杂交捕获法去除rRNA需要近2个小时,大大地增加了RNA建库的难度和耗时。发明内容[0004] 本发明的目的是提供一种简便RNA建库方法,极大地简化了RNA建库过程中rRNA去除的流程。[0005] 一种简便RNA建库方法,其特征在于:其步骤包括:[0006] (1)提取样本中RNA,加入逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针并片段化,其中的rRNA逆转录阻碍探针可以参考202110257924.X记载的内容,在该步骤中,片段化的过程与逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针退火的过程是同步进行的,更节约程序;[0007] (2)RNA逆转录,获得DNA/RNA杂交双链;[0008] (3)接头连接:使用T4DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA3’端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头;[0009] (4)文库扩增及回收。[0010] 优选的,步骤(3)中平末端双链DNA接头是由AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT和CTCTTCCGATCT两条序列退火形成的双链DNA接头,GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT长链的5’端预腺苷化,3’端进行NH2C6修饰或者ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭;CTCTTCCGATCT短链的3’进行ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭。[0011] 优选的,双链DNA接头中长链与短链按照1:2‑1:100的摩尔浓度比例混合后进行退火。[0012] 优选的,双链DNA接头使用浓度为0.01‑1uM。[0013] 优选的,步骤(3)的连接反应使用的反应缓冲液中包含10‑200mM三羟甲基氨基甲烷、3‑30mM氯化镁、3‑30mM二硫苏糖醇和3‑30%聚乙二醇8000。[0014] 优选的,步骤(1)中逆转录引物序列为GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCN6‑20,其中N6‑20为6‑20个碱基的随机引物。[0015] 优选的,逆转录引物的使用浓度为10‑500uM。[0016] 优选的,步骤(1)中片段化的程序为95℃7min,75℃1min,55℃1min,保存于25℃。[0017] 优选的,步骤(2)中逆转录体系包括逆转录酶,所述逆转录酶为AMV、M‑MLV、TGIRT和RTX逆转录酶的一种或多种。[0018] 优选的,所述逆转录酶的使用浓度为5‑1000uM。[0019] 优选的,逆转录反应体系还包含10‑100mM三羟甲基氨基甲烷、50‑150mM氯化钾、1‑5mM氯化镁、2‑10mM二硫苏糖醇和0.2‑5U的RNA酶抑制剂;逆转录反应的程序为25℃10min,42℃15min,70℃5min。[0020] 本发明的简便RNA建库方法,利用DNA连接酶突变体K159L可以高效连接DNA/RNA杂交链的原理,只需要RNA片段化、逆转录、接头连接、文库扩增和磁珠回收5步,极大地简化了RNA建库的流程和耗时。结合使用rRNA逆转录阻碍探针快速去除rRNA的技术,可以在一管内完成rRNA去除和RNA建库。整个建库过程仅需2h,操作简单、RNA损失小、成本低,非常适用于RNA自动化建库和低丰度RNA建库。附图说明[0021] 图1随机引物长度对逆转录效率的影响。[0022] 图2简便RNA建库原理和流程示意图。[0023] 图3简便RNA建库文库电泳结果。[0024] 图4用于简便RNA建库的逆转录酶筛选。[0025] 图5用于简便RNA建库的DNA聚合酶筛选。[0026] 图6简便RNA建库和传统RNA建库流程对比。[0027] 图7简便RNA建库和传统RNA建库文库产量对比。具体实施方式[0028] 下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。[0029] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本实施例所使用的探针和引物序列及修饰如表1所示,N为随机碱基,即A、T、C、G中任意一种碱基。[0030] 表1探针及引物序列[0031][0032] 实施例1:随机引物长度对逆转录效率的影响[0033] 在本实施例中,我们验证了6‑20nt随机引物长度(表1序号1‑8)对逆转录效率的影响。具体实施方式如下:[0034] 表2[0035][0036] 94℃2min,94℃‑25℃0.1℃/s,4℃保存。[0037] 表3[0038]组分 用量上述反应体系 16μL0.1MDTT 2μLTMSuperScript IIIRT(200U/μL,ThermoFisher) 1μLTMSUPERase·In RNase抑制剂(20U/μL) 1μLTotal 20μL[0039] 25℃10min,42℃15min,85℃5min,4℃保存。对Actin和28SRNA进行qPCR定量分析,定量引物见表1。[0040] 结果如图1所示,8‑14个碱基的随机引物具有更好的逆转录效率。[0041] 实施例2:简便RNA建库流程的建立。[0042] 在本实施例中,我们建立了简便RNA建库的流程。具体实施方式如下:[0043] P5接头退火:将100μMP5‑1与100μMP5‑2溶解于1×Annealingbuffer(10mMTris‑HCl,50mMNaCl,1mMEDTA,pH7.9)中,吸取等体积混匀,94℃5min,94‑15℃0.1℃/min,15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。[0044] 1)RNA片段化和核糖体RNA去除:[0045] 表4:[0046] 组分 用量RNA 10pg‑1μg0.3mMP7‑N10 1μLrRNA逆转录阻碍探针(202110257924.X) 1μL5×First‑StrandBuffer 2μL10mMdNTPs 1μL补DEPC水至 7μL[0047] 5×First‑StrandBuffer:250mMTris,375mMKCl,15mMMgCl2,pH8.3。[0048] 94℃10min,75℃1min,55℃1min,4℃保存。[0049] 2)RNA逆转录[0050] 表5[0051][0052][0053] 25℃10min,42℃15min,70℃5min,4℃保存。[0054] 3)预腺苷化平末端双链DNA接头连接[0055] 表6[0056] 组分 用量上述反应体系 10μL5×LigationBuffer 3μLT4DNAligaseK159L(1000U/μL) 1μL10μMP5接头(表1序号9‑10) 1μLTotal 15μL[0057] 5×LigationBuffer:80mMTris,24mMMgCl2。[0058] 15‑40℃15min,4℃保存。[0059] 4)文库扩增及回收[0060] 表7[0061][0062] 5×HiFiBuffer:25mMTris,100mM(NH4)2SO4,700mMKCl,0.05%TritonX‑100,1.5mMdNTPs,4M海藻糖,25%DMSO,pH7.5。[0063] 98℃3min,7‑22cycles(98℃10s,60℃30s,72℃30s),72℃3min,保存于4℃。[0064] 反应结束后,加入45μLAgencourtAMPureXPbeads(Beckman,A63881)混匀后,室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上,待溶液澄清后,吸去上清;加入200μL新鲜配制的80%乙醇静置30s,吸去上清;加入200μL新鲜配制的80%乙醇静置30s,吸干净乙醇。室温静置3min,晾干乙醇,加入20μL无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5min,将PCR管置于磁力架上,待溶液澄清后,吸出上清。[0065] 简便RNA建库原理如图2所示,RNA经逆转录后转化成DNA/RNA杂交双链,使用T4DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA3’端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头。由于T4DNA连接酶突变体K159L只能催化带有腺苷酰化修饰接头的连接,所以这种连接方式基本不存在接头和底物自连。文库大小分布如图3,简便RNA建库具有良好的建库产出和文库大小分布。[0066] 实施例3:逆转录酶的筛选。[0067] 在本实施例中,我们筛选了适用于简便RNA建库的逆转录酶,具体实施方式与实施例2相同。结果如图4所示,各种逆转录酶均具有很好的文库产出,其中HifairIII逆转录酶建库效果最好。[0068] 实施例4:DNA聚合酶的筛选。[0069] 在本实施例中,我们筛选了适用于简便RNA建库的DNA聚合酶,具体实施方式与实施例2相同。结果如图5所示,各种DNA聚合酶均具有很好的文库产出。[0070] 实施例5:不同RNA投入量建库。[0071] 在本实施例中,我们利用搭建好的简便RNA建库体系,验证10pg‑1ugRNA的建库效果,具体实施方式与实施例2相同。结果如表8所示,简便RNA建库技术对10pg‑1ug的RNA投入量以及单细胞都具有很好的建库产量和rRNA去除效果。这说明简便RNA建库技术能够适用于复杂投入量范围的RNA建库,尤其是低投入量(甚至是单细胞)的RNA建库。[0072] 表8[0073]RNA投入量 循环数 文库产出/ng rRNA占比 比对率1000ng 10 541 0.8% 99.8%100ng 12 313 0.9% 99.7%10ng 15 309 1.7% 99.2%1ng 18 248 3.1% 98.6%100pg 22 257 4.9% 96.1%10pg 25 201 5.3% 93.3%单细胞 26 229 7.2% 92.5%[0074] 实施例6:简便RNA建库与常规RNA建库的比较。[0075] 在本实施例中,我们比较了常规RNA建库与简便RNA建库的性能,常规rRNA法建库TM使用NewEnglandBiolabs的 rRNADepletionKit和Ultra IIDirectionalRNALibraryPrepKitforIllumina按照其说明书进行文库构建。[0076] 两种建库流程见图6,简便RNA建库可以极大简化RNA建库的流程,在2个小时即可完成RNA文库的构建。建库结果如图7,在文库产量上,简便RNA建库产量更高,这说明简便RNA建库对RNA模板的利用率更高,损失更小。[0077] 综上,本发明的简便RNA建库方法利用DNA连接酶突变体K159L可以高效连接DNA/RNA杂交链的原理,只需要RNA片段化、逆转录、接头连接、文库扩增和磁珠回收5步,极大地简化了RNA建库的流程和耗时。结合我们公布的快速rRNA去除技术(202110257924.X),可以在一管内完成rRNA去除和RNA建库。整个过程建库过程仅需2h,操作简单、RNA损失小、成本低,非常适用于RNA自动化建库和低丰度RNA建库。

专利地区:上海

专利申请日期:2021-12-31

专利公开日期:2024-06-18

专利公告号:CN114410741B

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