用于生产MONACOLIN K和/或绿原酸的方法以及由该方法所获得的培养产物

专利名称：用于生产MONACOLIN K和/或绿原酸的方法以及由该方法所获得的培养产物

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202011293948.2

专利申请（专利权）人：财团法人食品工业发展研究所
权利人地址：中国台湾新竹市食品路331号

专利发明（设计）人：黄乔盈,王乃诒,赖进此

专利摘要：本发明涉及用于生产MONACOLIN K和/或绿原酸的方法以及由该方法所获得的培养产物。本发明揭示一种用于生产Monacolin K和/或绿原酸的方法，其包括：将红色红曲菌菌株培养于含有咖啡果实材料的培养基中，其中该咖啡果实材料不包含咖啡豆。

主权利要求：
1.一种用于生产MonacolinK和绿原酸的方法，其特征在于，该方法包括：将红色红曲菌(Monascusruber)菌株培养于含有咖啡果实材料的培养基中，其中该咖啡果实材料不包含咖啡豆，该红色红曲菌菌株是保藏编号为BCRC31535或者ATCC18199的红色红曲菌菌株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该咖啡果实材料包含咖啡果肉。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该培养基进一步含有选自于由下列所构成的群组中的淀粉类基质：米、芋头、地瓜、荞麦、南瓜、马铃薯，以及它们的组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该培养基进一步含有选自于由下列所构成的群组中的糖类：果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖，以及它们的组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该培养基进一步含有选自于由下列所构成的群组中的盐类：海盐、食盐、玫瑰盐，以及它们的组合。
6.一种培养产物，其特征在于，该培养产物通过如权利要求1至5中任一项的方法而被制得，该培养产物包含有绿原酸。
7.如权利要求6所述的培养产物，其特征在于，该培养产物进一步包含有MonacolinK。
8.一种食品产品，其特征在于，该食品产品包含有如权利要求6或7的培养产物。 说明书 : 用于生产MONACOLINK和/或绿原酸的方法以及由该方法所获
得的培养产物技术领域[0001] 本发明有关一种用于生产MonacolinK和/或绿原酸的方法以及由该方法所获得的培养产物。背景技术[0002] 红曲菌是一群属于红曲菌属(Monascus)的红色霉菌，包括紫红曲菌(Monascuspurpureus)、丝毛红曲菌(Monascuspilosus)以及红色红曲菌(Monascusruber)等，它们已被广泛地用于对食物材料(诸如米、肉类)进行发酵来制成各种不同的发酵食品(诸如红曲米、红糟肉、红糟酒等)。近年来，这些发酵食品被发现具有多种生理活性，并且被分离鉴定出多种活性成分，包括，例如，Monacolin K、Monascidin A、红曲菌紫色素(monascorubramine)、红曲菌红色素(monascorubin)、红曲菌黄色素(monascin)等。其中又以降胆固醇活性特别受到瞩目，而对应的活性成分为MonacolinK。[0003] 因此，如何提高MonacolinK的产量已成为本领域的相关研究人员所致力的目标。例如，CN102911977A揭示一种以固态基质为载体红曲菌发酵生产MonacolinK的方法，其主要包括将经预处理过的固态基质载体与营养液混合并以红曲菌来进行发酵。在此件中国专利申请的不同实例中，分别使用甘蔗渣、玉米芯与甘蔗渣的混合物、茶梗、膨化大麦、蒸煮小米以及生咖啡豆来作为固态基质载体，而所使用的营养液皆为葡萄糖、大豆水解液、甘油、盐类以及玉米浆的组合，红曲菌菌株则为赤红曲菌(Monascusanka)CGMCC0517。所得到的结果被整理于下面的表1中。[0004] 表1.CN102911977A的实例所得到的MonacolinK产量[0005]实例 固态基质载体 MonacolinK(mg/g)1 甘蔗渣 11.312 玉米芯与甘蔗渣 10.423 茶梗 7.764 膨化大麦 9.325 蒸煮小米 13.216 生咖啡豆 4.54[0006] 由此可见，使用生咖啡豆所得到的MonacolinK产量明显低于其他固态基质载体所具者，甚至只有蒸煮小米所具者的1/3左右。况且，咖啡豆已成为最具经济价值的作物，是全球交易量仅次于石油的第二大贸易商品，将其用于生产低产量的MonacolinK不具经济效益。发明内容[0007] 在本发明中，申请人意外地发现，咖啡豆生产过程的副产物‑‑咖啡果肉‑‑可被用来生产MonacolinK，并且相较于各种不同的红曲菌[包括丝毛红曲菌(Monascuspilosus)与紫红曲菌(Monascuspurpureus)]，使用红色红曲菌(Monascusruber)来对其进行发酵培养才能生产大量的MonacolinK。此外，同时发现在咖啡果实中的一种活性成分‑‑绿原酸(chlorogenicacid)‑‑的含量亦会在培养的过程中被大量地提升。[0008] 于是，在第一个方面，本发明提供一种用于生产MonacolinK和/或绿原酸的方法，其包括：将红色红曲菌菌株培养于含有咖啡果实材料的培养基中，其中该咖啡果实材料不包含咖啡豆。[0009] 较佳地，该咖啡果实材料包含咖啡果肉。[0010] 较佳地，该红色红曲菌菌株是保藏编号为BCRC31535或者ATCC18199的红色红曲菌菌株。[0011] 较佳地，该培养基进一步含有选自于由下列所构成的群组中的淀粉类基质：米、芋头、地瓜、荞麦、南瓜、马铃薯，以及它们的组合。[0012] 较佳地，该培养基进一步含有选自于由下列所构成的群组中的糖类：果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖，以及它们的组合。[0013] 较佳地，该培养基进一步含有选自于由下列所构成的群组中的盐类：海盐、食盐、玫瑰盐，以及它们的组合。[0014] 在第二个方面，本发明提供一种培养产物，它通过如上所述的方法而被制得。[0015] 较佳地，该培养产物包含有MonacolinK和/或绿原酸。[0016] 在第三个方面，本发明提供一种食品产品，其包含有如上所述的培养产物。[0017] 本发明的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例后，将变得明显。具体实施方式[0018] 除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。[0019] 本发明提供一种用于生产MonacolinK和/或绿原酸的方法，其包括：将红色红曲菌菌株培养于含有咖啡果实材料的培养基中，其中该咖啡果实材料不包含咖啡豆。[0020] 如本文中所用的，术语“培养(culturing)”、“培育(cultivation)”以及“发酵(fermentation)”可被交换地使用。较佳地，该红色红曲菌菌株的培养是固态培养。有关该红色红曲菌的培养的操作程序与参数条件等落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，ChenF.andHuX.(2005),Int.J.FoodMicrobiol.,103:331‑337；JirasatidS.etal.(2013),J.Microbiol.Biotechnol.,23:364‑374；以及KanpiengjaiA.etal.(2018),BioTechnologia,99:109‑118。[0021] 可了解到的是，有关培养的操作条件会进一步随着所使用的红色红曲菌菌株及其与该培养基的用量比例等因素而被变动，以便达致最佳的生产效果。而这些操作条件的选择是本领域技术人员能例行性地自行决定的。[0022] 如本文中所使用的，术语“红色红曲菌(Monascusruber)菌株”意欲涵盖那些为本领域技术人员可易于获得的菌株(例如，可购自于国内或国外保藏机构者)，或者利用本领域中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中所分离纯化出的菌株。[0023] 较佳地，该红色红曲菌菌株选自于公众可获得的具有下列保藏编号的菌株中的至少一者：BCRC31523(对应于ATCC16378)、BCRC31529(对应于ATCC16385)、BCRC31532(对应于ATCC15670)、BCRC31533(对应于ATCC16246)、BCRC31534(对应于ATCC16366)、BCRC31535(对应于ATCC18199)、BCRC31538(对应于IFO4532)、BCRC33303(对应于IFO9203)、BCRC33314(对应于ATCC16371)、BCRC33323(对应于ATCC18199)、BCRC33324(对应于IFO32318)、BCRC33326(对应于IFO31842)、BCRC33329(对应于IFO32317)，以及BCRC33448(对应于IMI288415)。在本发明的一个较佳具体例中，该红色红曲菌菌株是保藏编号为BCRC31535或者ATCC18199的红色红曲菌菌株。[0024] 依据本发明，以该培养基的总重量为计算基础，该红色红曲菌菌株可使用大约1至50wt％的接种量来进行培养。在本发明的一个较佳具体例中，该红色红曲菌菌株使用5wt％的接种量来进行培养。[0025] 如本文中用的，术语“咖啡果实(coffeefruit)”、“咖啡果(coffeeberry)”以及“咖啡樱桃(coffeecherry)”可被交换地使用。[0026] 依据本发明，该咖啡果实材料包含咖啡果肉(pulp)[又被称为中果皮(mesocarp)]。较佳地，该咖啡果实材料进一步包含咖啡外皮(outerskin)[又被称为外果皮(exocarp)]。另择地，该咖啡果实材料亦可进一步包含咖啡豆膜(parchment)[又被称为内果皮(endocarp)]。[0027] 依据本发明，该咖啡果实材料可来自于不同的咖啡物种。较佳地，该咖啡物种可选自于由下列所构成的群组：大果咖啡(Coffealiberica)(又被称为赖比瑞亚咖啡)、中果咖啡(Coffeacanephora)(又被称为卡尼弗拉咖啡)、小果咖啡(Coffeaarabica)(又被称为阿拉比卡咖啡)，以及高产咖啡(Coffeadewevrei)。在本发明的一个较佳具体例中，该咖啡物种是小果咖啡。[0028] 依据本发明，该咖啡果实材料在添加至培养基前可选择性地被进行均质处理以制成均质物。[0029] 依据本发明，以该培养基的总重量为计算基础，该咖啡果实材料可具有大约0.1至99wt％的含量。较佳地，该咖啡果实材料具有大约50至67wt％的含量。[0030] 依据本发明，该培养基可进一步含有选自于由下列所构成的群组中的淀粉类基质：米、芋头、地瓜、荞麦、南瓜、马铃薯，以及它们的组合。较佳地，该培养基进一步含有选自于由下列所构成的群组中的米：白米(whiterice)、糙米(brownrice)、紫米(purplerice)、黑米(blackrice)、糯米(waxyrice)、五谷米(mixedgrainrice)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该培养基进一步含有白米。[0031] 依据本发明，该咖啡果实材料与该淀粉类基质的重量比可介于1：0至1：4之间。在本发明的一个较佳具体例中，该咖啡果实材料与该淀粉类基质的重量比是1：2。[0032] 依据本发明，以该培养基的总重量为计算基础，该培养基可含有大约0至10wt％的糖类。较佳地，该糖类选自于由下列所构成的群组：果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该糖类是果糖。[0033] 依据本发明，以该培养基的总重量为计算基础，该培养基可含有大约0至10wt％的盐类。较佳地，该盐类选自于由下列所构成的群组：海盐、食盐、玫瑰盐，以及它们的组合。[0034] 依据本发明，该红色红曲菌菌株的培养可在大约20℃至40℃内的温度下被进行历时大约7至20天。较佳地，可在开始培养后的第1至6天中的一天或多天，对该培养基补充10至15wt％的水(以该培养基的总重量为计算基础)。[0035] 本发明亦提供一种培养产物，它通过如上所述的方法而被制得。[0036] 依据本发明，该培养产物可包含有MonacolinK和/或绿原酸。较佳地，该培养产物同时包含有MonacolinK以及绿原酸。[0037] 本发明亦提供一种食品产品(foodproduct)，其包含有如上所述的培养产物。该培养产物可被当成食品添加物(foodadditive)，通过已知方法于原料制备时被添加，或于食品的制作过程中被添加，而与任一种可食性材料被配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。[0038] 依据本发明，该食品产品的种类包括，但不限于：奶粉(milk powder)、饮料(beverages)、甜点(confectionery)、糖果(candies)、发酵食品(fermentedfood)、动物饲料(animalfeeds)、健康食品(healthfoods)以及膳食补充品(dietarysupplements)。[0039] 本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。[0040] <实施例>[0041] 实施例1.使用含有咖啡果肉(coffeepulp)的培养基来培养红曲菌[0042] 实验材料：[0043] 1.红曲菌菌株：[0044] 在本实施例中所使用的红曲菌菌株皆得自于中国台湾的食品工业发展研究所(FoodIndustryResearchandDevelopmentInstitute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BioresourceCollectionandResearchCenter,BCRC)(300新竹市食品路331号，中国台湾)，并且已分别被整合于下面的表2中。[0045] 表2.所使用的红曲菌菌株[0046][0047] 2.培养基的材料：[0048] 在本实施例中所使用的培养基的各个材料的来源分别被整合于下面的表3中。[0049] 表3.培养基的材料来源[0050] 材料 来源咖啡果肉(含外果皮) 古坑咖啡庄园白米(whiterice) 三好米果糖(fructose) Sigma‑Aldrich大豆油(soybeanoil) 台糖海盐(seasalt) 佳欣海水素[0051] 在进行实验前，以果汁机(厂牌为Blendtec，型号为ES3EZBLENDER)对咖啡果肉进行均质处理来制备咖啡果肉均质物。[0052] 实验方法与结果：[0053] A、制备红曲菌的接种源(inoculum)：[0054] 将红曲菌菌株接种至马铃薯右旋糖琼脂(PDA)培养板[potatodextroseagar(PDA)plate](购自于BD)上，并于恒温培养箱(30℃)中进行培养历时7天。接着，将在该PDA3培养板上所形成的红曲菌菌丝体切块，而使得它具有1cm 的体积，然后将其加入至含有20g/L经研磨成粉状的白米、40g/L葡萄糖、10g/L谷氨酸钠(monosodiumglutamate)以及蛋白胨(peptone)的30mL培养基中，并于恒温振荡培养箱(30℃、120rpm)内进行培养历时3天。然后，将所得到的液态培养物以手持式均质机(厂牌为QIAGEN，型号为TissueRuptor)来进行均质处理，而所形成的均质培养物被拿来作为红曲菌的接种源。[0055] B、红曲菌的培养：[0056] 将在上面第A项当中所得到的3种红曲菌的接种源各自分为10组，并且分别以2.5g(固态基质的5wt％)的接种量接种至各个具有下面表4所示的配方的培养基中，继而于恒温培养箱(30℃)中进行培养。在培养期间每天翻动一次培养基，并且在第4、5以及6天分别补充5g的水，最后于第15天收取所得到的培养产物。[0057] 表4.培养基的配方[0058][0059] 注：白米预先被浸泡于反渗透水中过夜并予以沥干[0060] C、待测样品的制备：[0061] 将在上面第B项中所得到的各个培养产物于45℃下进行热风干燥历时3天，继而以4两螺牙高速粉碎机(厂牌为荣聪精密科技有限公司，型号为RT‑N04)予以研磨。对所得到的粉末称取0.2g并加入25mL甲醇，接着于25℃下进行超声波震荡处理历时30分钟。然后，于3,000rpm下进行离心历时10分钟并收取上清液，借此而得到待测样品以供用于下面的成分分析。[0062] D、MonacolinK的含量分析：[0063] 首先，为了初步分析各个培养产物中是否含有MonacolinK，参考SunJ.L.etal.(2011),Biol.Res.,44:377‑382当中所述的方法，将各个待测样品于238nm的波长下以分光光度计(spectrophotometer)(厂牌为MERCK，型号为SpectroquantPharo300)来读取吸光值(OD238)。由此所测得的OD238数值接而根据预先以具有不同已知浓度(0至20ppm)的MonacolinK(购自于Sigma‑Aldrich)的甲醇溶液相对于它们自身的OD238数值所作出的相关曲线(correlationcurve)而被换算成MonacolinK浓度。而结果发现，3种红曲菌菌株的各组培养产物皆含有MonacolinK，其中又以紫红曲菌所得到者最高(数据未显示)。[0064] 为了更精准地分析各个培养产物中的MonacolinK含量，将各个待测样品以0.22μm的滤膜(购自于MERCK)予以过滤，继而参照中国台湾某机构所公告的“食品中MonacolinK之检验方法”来进行高效能液相层析分析(highperformanceliquidchromatography,HPLC)。[0065] 所使用的HPLC分析仪器如下：HITACHI液相层析系统(厂牌为HITACHI，型号为L‑2000)以及UV检测器(厂牌为HITACHI，型号为L‑2455)，而有关HPLC的各项操作参数与条件被显示于下面的表5中。[0066] 表5.HPLC的操作参数与条件[0067][0068] 此外，为供比对，将20mgMonacolinK溶于10mL乙腈中，继而以甲醇予以稀释成具有不同浓度(0至200ppm)的MonacolinK的甲醇溶液来作为内酯型MonacolinK的校正标准品(controlstandard)；以及将1mLMonacolinK与1mL0.1NNaOH进行混合并于50℃下进行超声波震荡处理历时1小时，继而以甲醇予以稀释成具有不同浓度(0至200ppm)的MonacolinK的甲醇溶液来作为酸型MonacolinK的校正标准品。[0069] 所得到的结果被显示于下面的表6中。[0070] 表6.3种红曲菌的各组培养产物的MonacolinK含量(ppm)[0071]组别 红色红曲菌 丝毛红曲菌 紫红曲菌C0 15 0 0C1/2 429 0 0F0 13 0 0F1/2 489 0 0F2/3 881 0 0SB0 41 0 0SB1/2 42 0 0SB2/3 104 0 0SS0 11 0 0SS1/2 397 0 0[0072] 注：内酯型与酸型的MonacolinK含量加总计算。[0073] 由表6可见，在未使用咖啡果肉的情况下，3种红曲菌的培养产物只存在微量的或低于检测极限的MonacolinK。而在使用咖啡果肉的情况下，丝毛红曲菌与紫红曲菌的各组培养产物皆意外地检测不到MonacolinK的存在，只有红色红曲菌的各组培养产物被检测出MonacolinK。特别地，上面参照SunJ.L.etal.(2011)(同上述)使用分光光度计来分析所得到的结果却初步显示紫红曲菌在生产MonacolinK上具有较佳的效用。申请人据此而认为：本实施例所得到的培养产物中可能存在有会干扰分光光度计的物质，而不适用于SunJ.L.etal.(2011)(同上述)所揭示的分析方法。[0074] HPLC的分析结果则清楚显示，无论有无额外添加糖类、油脂或盐类，使用咖啡果肉皆能明显提升红色红曲菌的MonacolinK产量。特别地，在额外添加糖类的情况下，MonacolinK的产量提升情形又更为显著。[0075] 为了进一步了解是否还有其他活性成分的含量亦会被提升，红色红曲菌的组别F1/2与F2/3的待测样品被拿来进行下面的分析。[0076] E、绿原酸(chlorogenicacid)的含量分析：[0077] 将组别F1/2与F2/3的待测样品以0.22μm的滤膜予以过滤，继而参照中国台湾某机构所公告的“胶囊与锭状食品中绿原酸类之检验方法”来进行HPLC分析。[0078] 所使用的HPLC分析仪器如上所述，而有关HPLC的各项操作参数与条件被显示于下面的表7中。[0079] 表7.HPLC的操作参数与条件[0080][0081] 为供比对，依据上面第C项当中所述的方法将组别F1/2与F2/3在培养前的培养基制成待测样品并拿来进行相同的HPLC分析。此外，将10mg绿原酸(购自于Sigma‑Aldrich)溶于10mL甲醇中，继而以70％甲醇予以稀释成具有不同浓度(0至500ppm)的绿原酸的甲醇溶液来作为校正标准品。[0082] 所得到的结果被显示于下面的表8中。[0083] 表8.红色红曲菌组别F1/2与F2/3在培养前后的绿原酸含量(ppm)[0084] 组别 未经培养的培养基 培养产物F1/2 56.9 144.7F2/3 48.9 207.3[0085] 由表8可见，红色红曲菌能够显著提升咖啡果肉所含有的绿原酸含量(分别提升了250％与423％)，并且此提升情形还会随着咖啡果肉的用量增加而大幅增加。[0086] 综合以上的实验结果可见，红色红曲菌意外地适合培养于含有咖啡果肉的培养基来大量生产MonacolinK以及绿原酸。[0087] 于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考资料。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。[0088] 虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的权利要求书所示者的限制。

专利地区：中国

专利申请日期：2020-11-18

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114369632B