一类高选择性检测亚铁离子的荧光探针及其制备和应用

专利名称：一类高选择性检测亚铁离子的荧光探针及其制备和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111403399.4

专利申请（专利权）人：华东理工大学
权利人地址：上海市徐汇区梅陇路130号

专利发明（设计）人：楼开炎,王卫,徐缓,徐航,邢皖晋,王珊珊,张星辰

专利摘要：本发明提供了一类高选择性检测亚铁离子荧光探针，所述探针可以利用流式细胞仪监测不同极化状态的巨噬细胞中亚铁离子浓度变化，以及对铁死亡状态下细胞内的亚铁离子浓度变化进行共聚焦成像。所述探针通过香豆素的3位羧酸衍生物A和羟胺衍生物B在二氯甲烷中合成。本发明所述的荧光探针选择性高，灵敏度高；抗干扰能力强；可在生理水平条件下应用；可用于监测不稳定铁池(LIP)中亚铁离子浓度的变化。

主权利要求：
1.一类高选择性检测亚铁离子荧光探针，其特征在于，所述亚铁离子荧光探针具有式Ⅰ‑1所示的结构：
2.一种制备权利要求1中式I‑1所示的亚铁离子荧光探针的方法，其特征在于，通过以下制备路线实现：化合物A1为香豆素343；化合物B1为间硝基苯羟胺。
3.根据权利要求2所述的制备亚铁离子荧光探针的方法，其特征在于：室温搅拌50min，得到探针化合物Ⅰ‑1。
4.根据权利要求2所述的制备亚铁离子荧光探针的方法，其特征在于：所述化合物A1与所述化合物B1的摩尔比为1:1；
所述化合物A1与所述1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1.1；
所述化合物A1与所述4‑二甲氨基吡啶的摩尔比为2.5:1。
5.根据权利要求1所述的荧光探针用于在非疾病的诊断和治疗为目的的检测亚铁离子浓度变化的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述荧光探针用于活细胞。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述活细胞为小鼠巨噬细胞。
8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述荧光探针用于铁死亡状态下的细胞。
9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述荧光探针用于监测细胞不稳定铁池中亚铁离子浓度的变化。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光探针。 说明书 : 一类高选择性检测亚铁离子的荧光探针及其制备和应用技术领域[0001] 本发明涉及一类高选择性检测亚铁离子的荧光探针及其制备和应用，本发明属于荧光探针技术领域。背景技术[0002] 铁是人体内含量最丰富的过渡金属物种，在氧转运，电子转移，基因调控以及巨噬2+细胞极化等方面发挥着重要的生物学功能。而铁平衡失调可导致各种疾病，比如Fe 水平升高与多种疾病密切相关，其中包括阿尔茨海默病、帕金森病、心血管病、肝病、糖尿病、衰老和癌症。缺铁则会大大降低血液中的血红蛋白水平，从而导致缺铁性贫血。事实上，铁在生命系统中主要以蛋白质结合的形式存在，如血红蛋白、肌红蛋白、转铁蛋白和铁蛋白。少量2+游离铁位于不稳定铁池(LIP)中，而LIP是铁稳态和调控网络的中心。LIP中过量的Fe 通过Fenton反应导致氧化应激损伤细胞的过程，这是驱动铁死亡发生的关键步骤，也是当下研究的热点。因此，铁稳态是如何被动态控制的，以及LIP水平异常变化是如何导致病理状态的，目前尚不清楚，这为开发生物系统中跟踪LIP水平的特异性检测方法提供了动力。[0003] 目前检测铁离子的方法主要有：分光光度比色法、高效液相色谱法、化学发光分析法、光化学传感等，但这些方法复杂，不能检测活体内的亚铁离子。而荧光检测法因具有灵2+敏度高，特异性强、对生物样品损伤小、可用于实时监测等优点，成为Fe 定量检测的研究热点。目前已报道的荧光探针分析方法仍存在一定的缺陷，例如灵敏度低、选择性差、合成复杂、响应时间长等，无法较好的应用于LIP的研究中去。因此，这为开发监测LIP中亚铁离子浓度动态变化的探针开发带来新的契机。发明内容[0004] 为克服现有技术中的缺陷，本发明提供如下技术方案。[0005] 一方面，本发明提供一类高选择性检测亚铁离子的荧光探针，其特征在于，所述探针可以利用流式细胞仪监测不同极化状态的巨噬细胞中亚铁离子浓度变化，以及对铁死亡状态下细胞内的亚铁离子浓度变化进行共聚焦成像，具有式Ⅰ所示的结构：[0006][0007] 在式Ⅰ中，R1和R2为独立地选自氢原子、直链或支链烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、11 1 2 3 4 5 6 7R 为独立地选自氢原子、硝基、直链或支链烷基组成的组；且其中的R 、R、R 、R、R 、R、R 、8 9 10 11R、R、R 、R 可以相同或不同；[0008] 所述的R1和R5成环或不成环，R2和R3成环或不成环。[0009] 在本发明的一些具体实施方案中，R1和R2为支链或直链烷基，R3、R4、R5、R6、R7、R9、11 8 10R 为氢，R或R 为硝基。[0010] 进一步优选地，所述式I为下列式I‑1[0011][0012] 另一方面，本发明提供一种式Ⅰ所示的化合物的制备方法，其特征在于，通过以下制备路线实现：[0013][0014] 在一个实施方式中：[0015] 香豆素的3位羧酸衍生物A和羟胺衍生物B溶于二氯甲烷中，随后加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和4‑二甲氨基吡啶，室温搅拌50min，得到探针化合物Ⅰ。[0016] 在一个实施方式中：[0017] 所述香豆素的3位羧酸衍生物A与所述羟胺衍生物B的摩尔比为1:1；[0018] 所述香豆素的3位羧酸衍生物A与所述1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1.1；[0019] 所述香豆素的3位羧酸衍生物A与所述4‑二甲氨基吡啶的摩尔比为2.5:1。[0020] 一方面，本发明提供了所述的亚铁离子荧光探针的应用，其特征在于，利用流式细胞仪监测脂多糖(LPS)对于巨噬细胞在不同孵育时间下的细胞内亚铁离子浓度的变化。[0021] 又一方面地，本发明提供了所述的亚铁离子荧光探针的应用，其特征在于，针对脂多糖(LPS)对于巨噬细胞在不同孵育时间下的细胞内亚铁离子浓度的变化进行共聚焦荧光成像。[0022] 再一方面，本发明提供了所述的亚铁离子荧光探针的应用，其特征在于，针对不同铁死亡状态下细胞内的亚铁离子浓度变化进行共聚焦荧光成像。[0023] 上述检测亚铁离子的荧光探针制备方法的详细描述如下，包括步骤：[0024] 以式Ⅰ所示化合物为例，香豆素的3位羧酸衍生物A和羟胺衍生物溶B于二氯甲烷中，随后加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和4‑二甲氨基吡啶，室温搅拌50min。反应完毕，减压蒸除溶剂，经柱层析纯化得式Ⅰ所示化合物。[0025] 上述制备方法中，香豆素的3位羧酸衍生物A与羟胺衍生物B的摩尔比为1:1；[0026] 上述制备方法中，香豆素的3位羧酸衍生物A与1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1.1；[0027] 上述制备方法中，香豆素的3位羧酸衍生物A与4‑二甲氨基吡啶的摩尔比为2.5:1；[0028] 上述制备方法中，香豆素的3位羧酸衍生物A与羟胺衍生物B完全溶解后，再缓慢加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和1‑3与4‑二甲氨基吡啶。[0029] 上述制备方法中，采用旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应中的有机相。[0030] 上述制备方法中，所得化合物Ⅰ用硅胶柱层析进行纯化。[0031] 本发明公开了所述的荧光探针用于检测亚铁离子浓度变化的用途。[0032] 进一步地，所述荧光探针用于活细胞；更进一步地，所述活细胞为小鼠巨噬细胞。[0033] 进一步地，所述荧光探针用于铁死亡状态下的细胞。[0034] 进一步地，所述荧光探针用于监测不稳定铁池(LIP)中亚铁离子浓度的变化。[0035] 本发明公开了一种试剂盒，其特征在于，包括上述的荧光探针。[0036] 本发明具有如下有益技术效果：[0037] (1)选择性高，灵敏度高[0038] 本发明的荧光探针可以选择性与亚铁离子快速发生特异性反应，生成具有强荧光的产物。相较于常见的其他金属离子类、还原性物质，本发明的亚铁离子荧光探针对于亚铁离子表现出了较高的选择性和灵敏性。[0039] (2)抗干扰能力强[0040] 本发明的亚铁离子荧光探针，能抗钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、镉离子、钴离子、镍离子、锰离子、锌离子、三价铁离子、一价铜离子、二价铜离子的干扰。[0041] (3)可在生理水平条件下应用[0042] 本发明的亚铁离子荧光探针可在生理水平条件下应用，并且，生物体内常见的金属离子和其他物质对其干扰较小，可以应用于活细胞荧光成像，具有潜在的实际应用价值。[0043] (4)可用于监测不稳定铁池(LIP)中亚铁离子浓度的变化。[0044] 本发明的亚铁离子荧光探针相较于前期报道中监测LIP中铁离子浓度的calcein‑AM探针，可以选择性检测亚铁离子，检验手段更便捷，易于合成，有利于商业化的推广应用。附图说明[0045] 通过附图，本领域技术人员将会更加明了本发明的优点和特征。[0046] 图1是实施例亚铁离子荧光探针Ⅰ‑1的1HNMR图谱。[0047] 图2是实施例亚铁离子荧光探针Ⅰ‑1的13CNMR图谱。[0048] 图3是在Tris‑HCl(10mM,pH＝7.4)中浓度为1μmol/L的实施例荧光探针Ⅰ‑1随不同浓度的亚铁离子的加入荧光谱图的变化情况；图中，从下至上，亚铁离子浓度依次为0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、20、30、40、50、60μmol/L的荧光光谱图。反应时间为30分钟。[0049] 图4是在Tris‑HCl(10mM,pH＝7.4)中浓度为1μmol/L的实施例荧光探针Ⅰ‑1与30μmol/L亚铁离子在30分钟内488nm处荧光强度随时间变化图。[0050] 图5是在Tris‑HCl(10mM,pH＝7.4)中浓度为1μmol/mL的实施例荧光探针Ⅰ‑1与30μmol/mL不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图，图中：1、空白；2、二价铁离子；3、钙离子；4、镁离子；5、镉离子；6、锰离子；7、镍离子；8、锌离子；9、三价铁离子；10、二价铜离子；11、钴离子；12、一价铜离子。反应时间为30分钟。[0051] 图6是实施例荧光探针Ⅰ‑1在小鼠巨噬细胞中利用流式细胞仪监测脂多糖(LPS)对于巨噬细胞在不同孵育时间下的细胞内亚铁离子浓度的变化图。[0052] 图7是实施例荧光探针Ⅰ‑1在小鼠巨噬细胞中，脂多糖(LPS)对于巨噬细胞在不同孵育时间下的细胞内亚铁离子浓度的变化进行共聚焦荧光成像。[0053] 图8是实施例荧光探针Ⅰ‑1针对不同铁死亡状态下细胞内的亚铁离子浓度变化进行共聚焦荧光成像。具体实施方式[0054] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。[0055] 实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。[0056] 实施例1亚铁离子荧光探针Ⅰ‑1的合成：[0057][0058] 将256mg原料香豆素的3位羧酸衍生物A1(0.90mmol)和140mg原料羟胺衍生物B1(0.91mmol)溶于10mL二氯甲烷中，随后加入184.6mg1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(0.963mmol)和45mg4‑二甲氨基吡啶(0.369mmol)，室温搅拌50min，反应完毕。用旋转蒸发仪减压蒸馏将反应液中的二氯甲烷除去得到粗产品。用体积比为50：1的二氯甲烷1与甲醇作为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化，得到45mg化合物Ⅰ‑1(产率为12％)。HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.22(s,1H),8.41(s,1H),7.99(t,J＝2.2Hz,1H),7.88(d,J＝7.8Hz,1H),7.54‑7.43(m,2H),7.00(s,1H),3.42‑3.34(m,4H),2.89(t,J＝6.4Hz,2H),2.78(t,J＝136.3Hz,2H),1,99(p,J＝6.1Hz,4H)；CNMR(100MHz,DMSO‑d6)δ163.7,157.2,153.2,149.9,149.2,149.1,148.4,130.4,127.7,120.1,119.4,116.0,107.9,107.1,104.6,102.8,49.7,49.2,26.8,20.5,19.5,19.5。[0059] 实施例2荧光探针Ⅰ‑1与不同浓度亚铁离子反应的荧光光谱变化[0060] 取实施例1中制备的荧光探针Ⅰ‑1溶于DMSO中，制成浓度为1mmol/L的荧光探针母2+液；称取27.2mg的高氯酸亚铁加入到10mL蒸馏水中，制成浓度为10mmol/L的Fe 母液。根据2+荧光探针和Fe 的浓度计算好所需的Tris‑Hcl缓冲溶液(10mM,pH＝7.4)加入到1cm×1cm石2+英比色皿中(体积3.5mL)，取3μL荧光探针母液加入到PBS水溶液中，再加入不同浓度的Fe母液(0–60μmol/L)，配置成探针浓度为1μmol/L的测试溶液共3mL。反应30分钟后，用荧光光2+谱仪测试荧光探针Ⅰ‑1与不同浓度Fe 反应的荧光光谱变化(激发波长为432nm)。荧光光谱2+变化如图3所示。可见随着Fe 浓度的逐渐增加，探针溶液在488nm处的荧光峰值逐渐增强。[0061] 实施例3荧光探针Ⅰ‑1与Fe2+反应随时间变化的荧光谱图变化[0062] 根据荧光探针和Fe2+的浓度计算好所需的Tris‑Hcl缓冲液(10mM,pH＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5mL)，取3μL实施例2中的荧光探针母液加入到Tris‑Hcl缓2+ 2+冲液中，再取9μL实施例2中的Fe 母液加入其中，配制成探针浓度为1μmol/L，Fe 浓度为30μmol/L的测试溶液共3mL。用432nm作激发波长，测试其随时间变化的荧光谱图变化。如图4所示，随着时间增加，488nm处荧光峰值逐渐增强，在接近20分钟左右达到最大值。[0063] 实施例4荧光探针Ⅰ‑1对不同干扰分析物的选择性研究[0064] 根据荧光探针和不同干扰分析物的浓度计算好所需的Tris‑Hcl缓冲液(10mM,pH＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5mL)，取3μL实施例2中的荧光探针母液加入到Tris‑Hcl缓冲液中，再加入30μmol/L的不同分析物：二价铁离子、钙离子、镁离子、镉离子、锰离子、镍离子、锌离子、三价铁离子、二价铜离子、钴离子、一价铜离子。配制成探针浓度为1μmol/L，不同干扰分析物浓度为30μmol/L的测试溶液共3mL，同时留一个只加探针的空白测试样品。反应30分钟后，用荧光光谱仪测试不同样品的488nm处荧光发射强度(激发2+波长为432nm)。如图5所示，相对于空白测试溶液，Fe 的测试溶液的荧光发生了明显上升，2+而其他分析物的荧光增强不多。实验结果说明荧光探针Ⅰ‑1对于Fe 具有良好的选择性。[0065] 实施例5荧光探针Ⅰ‑1在小鼠巨噬细胞中利用流式细胞仪监测脂多糖(LPS)对于巨噬细胞在不同孵育时间下的细胞内亚铁离子浓度的变化[0066] 取实施例1中制备的荧光探针Ⅰ‑1溶于DMSO中，制成浓度为10mmol/L的荧光探针母液。称取1mg的LPS加入到10mLPBS中，制成浓度为100μg/mL的LPS母液。第一组细胞(含2mLPBS缓冲液)取2μL荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第二组细胞先取2μLLPS母液加入其中，LPS浓度为100ng/mL，孵育4小时后，用HBSS清洗，再取2μL荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第三组细胞先取2μLLPS母液加入其中，LPS浓度为100ng/mL，孵育8小时后，用HBSS清洗，再取2.μL荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第四组细胞先取2μLLPS母液加入其中，LPS浓度为100ng/mL，孵育16小时后，用HBSS清洗，再取2μL荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。细胞孵育完成后，进行制样，随后分别用流式细胞仪对四组细胞进行荧光强度分析。使用的激发波长为405nm，发射波长为525nm。如图6所示，随着LPS孵育时间的增长，荧光强度逐渐上升。实验结果说明荧光探针Ⅰ‑1可以监测小鼠巨噬细胞中，脂多糖(LPS)在不同孵育时间时，细胞内亚铁离子浓度的变化。[0067] 实施例6荧光探针Ⅰ‑1在小鼠巨噬细胞中，脂多糖(LPS)对于巨噬细胞在不同孵育时间下的细胞内亚铁离子浓度的变化进行共聚焦荧光成像[0068] 第一组细胞(含2mLPBS缓冲液)中加入2μL实施例5中配制的荧光探针母液，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第二组细胞先取2μL实施例5中配制的LPS母液加入其中，LPS浓度为100ng/mL，孵育4小时后，用HBSS清洗，再取2μL实施例5中配制的荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第三组细胞先取2μL实施例5中配制的LPS母液加入其中，LPS浓度为100ng/mL，孵育8小时后，用HBSS清洗，再取2μL实施例5中配制的荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第四组细胞先取2μL实施例5中配制的LPS母液加入其中，LPS浓度为100ng/mL，孵育16小时后，用HBSS清洗，再取2μL实施例5中配制的荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。随后用荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像。如图7所示，(a,b,c,d,)为荧光成像；(e,f,g,h)为明场成像；激发波长为458nm，发射波长为488±20nm，标尺为50微米。随着LPS孵育时间的增长，图片中荧光强度逐渐增强。实验结果说明，荧光探针Ⅰ‑1可以很好地对脂多糖(LPS)在不同孵育时间时，对细胞内亚铁离子浓度的变化进行荧光成像。[0069] 实施例7荧光探针Ⅰ‑1针对不同铁死亡状态下细胞内的亚铁离子浓度变化进行共聚焦荧光成像[0070] 称取5.47mg的铁死亡诱导剂erastin加入到1mLDMSO中，制成浓度为10mmol/L的erastin母液,称取2.62mg的铁死亡抑制剂Fer‑1加入到1mLDMSO中，制成浓度为10mmol/L的Fer‑1母液。第一组细胞(含2mLPBS缓冲液)中加入2μL实施例5中配制的荧光探针母液，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第二组细胞取2μLerastin母液加入其中，erastin浓度10μmol/L，孵育4小时后，用HBSS清洗，再取2μL实施例5中配制的荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第三组细胞取2μLerastin母液和2μLFer‑1母液加入其中，erastin浓度10μmol/L，Fer‑1浓度10μmol/L，共孵育4小时后，用HBSS清洗，再取2μL实施例5中配制的荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第四组细胞取2μLerastin母液加入其中，erastin浓度10μmol/L，孵育8小时后，用HBSS清洗，再取2μL实施例5中配制的荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。第五组细胞取2μLerastin母液和2μLFer‑1母液加入其中，erastin浓度10μmol/L，Fer‑1浓度10μmol/L，共孵育8小时后，用HBSS清洗，再取2μL实施例5中配制的荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟。随后用荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像。如图8所示，(a,b,c,d,e)为荧光成像；(f,g,h,I,j)为明场成像；激发波长为458nm，发射波长为488±20nm，标尺为50微米。随着erastin孵育时间的增加，荧光强度逐渐增强；而加入Fer‑1后，荧光强度有所下降。实验结果说明，荧光探针Ⅰ‑1可以很好地对不同状态针对不同铁死亡状态下细胞内的亚铁离子浓度变化进行共聚焦荧光成像。[0071] 至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

专利地区：上海

专利申请日期：2021-11-24

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114163432B