GLP1R基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

专利名称：GLP1R基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111094136.X

专利申请（专利权）人：百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司
权利人地址：北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地宝参南街12号院

专利发明（设计）人：沈月雷,姚佳维,郭雅南,白阳,尚诚彰

专利摘要：本发明提供了一种人源化GLP1R基因、靶向载体、GLP1R基因人源化的非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人GLP1R蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化GLP1R蛋白，可以作为人GLP1R信号机理研究、代谢类疾病、心血管疾病、肿瘤及免疫相关疾病的药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

主权利要求：
1.一种GLP1R基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人GLP1R蛋白，或所述非人动物基因组中包含人源化GLP1R基因；
所述的构建方法包括将人源化GLP1R基因插入至非人动物GLP1R基因座上编码信号肽的核苷酸序列之前；
所述的人源化GLP1R基因包含人GLP1R基因的部分，所述的人GLP1R基因的部分为人GLP1R基因的CDS序列；
所述的人源化GLP1R基因包含编码所述的人GLP1R蛋白的核苷酸序列；
所述的人GLP1R蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；
所述的非人动物内源GLP1R蛋白表达降低或缺失。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人GLP1R基因的部分的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化GLP1R基因还包含辅助序列，所述辅助序列连接于人GLP1R基因之后。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的辅助序列为非人动物的3’UTR和/或polyA。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化GLP1R基因还包含非人动物GLP1R基因。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化GLP1R基因转录的mRNA序列如SEQIDNO：11所示。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含人GLP1R基因的部分；所述的人GLP1R基因的部分为人GLP1R基因的CDS序列。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的人GLP1R基因的部分的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体包含SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。
10.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，所述5’臂序列如SEQIDNO：3所示，所述的3’臂序列如SEQIDNO：4所示。
11.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰。
12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述的其他基因包含PD‑1、PD‑L1、CTLA4、LAG3、IL4、IL6和CCR4中的至少一种。
13.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化GLP1R基因和/或所述其他基因对于被替换的内源基因座是纯合或者杂合。
14.根据权利要求1‑13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物为大鼠或小鼠。
15.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含人GLP1R基因的部分；
所述的人GLP1R基因的部分的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；
所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，所述5’臂序列如SEQIDNO：3所示，所述的3’臂序列如SEQIDNO：4所示。
16.根据权利要求15所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体的核苷酸序列包含SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。
17.一种细胞、细胞系、原代细胞培养物、组织、器官或其培养物，其特征在于，所述细胞、细胞系、原代细胞培养物、组织、器官或其培养物来源于权利要求1‑14任一所述的构建方法获得的非人动物，所述的细胞、细胞系、原代细胞培养物、组织、器官或其培养物不能发育为动物个体。
18.来源于权利要求1‑14任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求17所述的细胞、细胞系、原代细胞培养物、组织、器官或其培养物的应用，其特征在于，所述的应用为非疾病的诊断和治疗目的，所述应用包括：A)在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体；
B)作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；
C)在生产和利用动物实验疾病模型中的应用；
D)在筛选、验证、评价或研究GLP1R通路功能、人GLP1R通路信号机理中的应用；
E)在筛选、验证、评价或研究靶向人的药物、药效研究方面的应用。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，E)中所述的靶向人的药物包括靶向人的抗体。
20.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，E)中所述的靶向人的药物包括免疫相关疾病药物、心血管疾病药物、代谢类疾病药物。 说明书 : GLP1R基因人源化的非人动物及其构建方法和应用技术领域[0001] 本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种GLP1R基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。背景技术[0002] GLP1R(Glucagon‑likepeptide‑1receptor，胰高血糖素样肽1受体)是B型GPCR(Gprotein‑coupledreceptor，G蛋白偶联受体)家族成员之一，广泛分布于胰岛、胃、小肠、心脏、肾脏及大脑等组织，通过与GLP‑1(Glucagon‑likepeptide‑1，胰高血糖素样肽1)结合，激活PKA、PI3K、MAPK等下游信号通路，参与胰岛素的释放、β细胞增生、胰高血糖素减少、胃排空延迟、增强记忆等重要生理过程。在胰岛细胞中，GLP1R主要发挥促进胰岛素释放、增加胰岛β细胞再生、抑制β细胞凋亡、降低胰高血糖素的释放等功能；在胃肠道组织中，可抑制胃肠道的蠕动和胃液分泌，延迟胃排空，增加饱腹感；在大脑神经组织中，则可保护神经细胞，减少其凋亡，增强学习记忆能力，以及控制食物摄取减轻体重，是国际公认的II型糖尿病的治疗靶标。目前已有多个靶向该受体的多肽药物上市，例如Exenatide(商品名Byetta/Bydureon)、Liraglutide(商品名Victoza)、Lixisenatide(商品名Lyxumia)、Albiglutide(商品名Tanzeu)、Dulaglutide(商品名Trulicity)等，它们的年销售总额超过百亿美元。此外，近年来的研究发现，GLP1R在部分肿瘤细胞中异常表达，例如胰岛素瘤、甲状腺乳头状瘤；还有研究发现，GLP1R激动剂能够显著抑制体外人肝星状细胞的活化，明显改善胆总管结扎术诱导的大鼠胆汁淤积性肝纤维化程度，可用于预防或治疗非酒精性脂肪肝病、高脂血症、动脉硬化等疾病。[0003] 实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型使其接近人类的生理特征，用于新药研发仍是最大的挑战。[0004] 鉴于GLP1R在糖尿病等代谢类疾病、心血管疾病等治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败率最小化，本领域急需开发GLP1R及其信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。发明内容[0005] 本发明利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达人或人源化蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。[0006] 本发明的第一方面，提供了一种人源化GLP1R基因，所述的人源化GLP1R基因包含人GLP1R基因的部分。[0007] 优选的，所述的人源化GLP1R基因包含编码人GLP1R蛋白的核苷酸序列。[0008] 优选的，所述的人源化GLP1R基因包含编码人GLP1R蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。[0009] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因包含编码人GLP1R蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列。其中，所述的人GLP1R蛋白的胞外区可以包含一段连续的氨基酸序列或者包含几段连续的氨基酸序列的间隔排列。[0010] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因包含编码人GLP1R蛋白的单次跨膜蛋白结构，或多次跨膜蛋白结构的全部或部分核苷酸序列。所述的多次跨膜蛋白结构包含两次、三次、四次、五次、六次或七次。所述的单次跨膜结构包含一次跨膜区、一次胞质区和一次胞外区。[0011] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因包含编码上述的人源化GLP1R蛋白的核苷酸序列。[0012] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因包含编码与SEQIDNO：2具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含编码与SEQIDNO：2所示氨基酸序列一致的核苷酸序列。[0013] 优选的，所述的人源化GLP1R基因包含人GLP1R基因的部分，所述的人GLP1R基因的部分为人GLP1R基因的1号至13号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至13号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合；更进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至12号外显子的全部和13号外显子的部分，其中1号外显子的部分包含从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，13号外显子的部分包含从13号外显子的第一个核苷酸至终止密码子为止。[0014] 优选的，所述的人GLP1R基因的部分包含人GLP1R基因的cDNA序列。[0015] 优选的，所述的人GLP1R基因的部分包含人GLP1R基因的CDS序列。[0016] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人GLP1R基因的部分的核苷酸序列包含下列组中的一种：[0017] (i)包含SEQIDNO：5所示核苷酸序列的全部或部分；[0018] (ii)包含与SEQIDNO：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0019] (iii)包含与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0020] (iv)包含与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0021] 优选的，所述的人源化GLP1R基因还包含辅助序列，所述辅助序列连接于人GLP1R基因之后。进一步优选的，所述的辅助序列选自终止密码子、翻转序列或敲除序列。更进一步优选的，所述的辅助序列为非人动物的3’UTR和/或polyA。[0022] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：[0023] (i)包含SEQIDNO：6所示核苷酸序列的全部或部分；[0024] (ii)包含与SEQIDNO：6所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0025] (iii)包含与SEQIDNO：6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0026] (iv)包含与SEQIDNO：6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0027] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：[0028] (i)包含SEQIDNO：7所示核苷酸序列的全部或部分；[0029] (ii)包含与SEQIDNO：7所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0030] (iii)包含与SEQIDNO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0031] (iv)包含与SEQIDNO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0032] 优选的，所述的人源化GLP1R基因还包含非人动物GLP1R基因。[0033] 优选的，所述的人源化GLP1R基因按照5’到3’方向顺序为非人动物1号外显子的部分、人GLP1R基因的部分、辅助序列和非人动物1号外显子的部分、2号至13号外显子的全部。[0034] 优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。[0035] 优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。[0036] 优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为scid null ‑/‑ ‑/‑优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD‑Prkdc IL‑2rγ 小鼠、NOD‑Rag1 ‑IL2rg (NRG)小‑/‑ ‑/‑鼠、Rag2 ‑IL2rg (RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。[0037] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因转录的mRNA序列包含下列组中的一种：[0038] (i)包含SEQIDNO：11所示核苷酸序列的全部或部分；[0039] (ii)包含与SEQIDNO：11所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0040] (iii)包含与SEQIDNO：11所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0041] (iv)包含与SEQIDNO：11所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0042] 优选的，所述的人源化GLP1R基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规诱导或阻遏的物质。[0043] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet‑OffSystem/Tet‑OnSystem)或他莫昔芬系统(TamoxifenSystem)。[0044] 本发明的第二方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人源化GLP1R基因的部分，所述人源化GLP1R基因的部分包括人GLP1R基因的部分。[0045] 优选的，所述的靶向载体包含的人GLP1R基因的部分包含人GLP1R基因的1号至13号外显子的全部或部分核苷酸序列。优选的，包含1号至13号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合。进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至12号外显子的全部和13号外显子的部分，其中1号外显子的部分包含从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，13号外显子的部分包含从13号外显子的第一个核苷酸至终止密码子为止。[0046] 优选的，所述的人GLP1R基因的部分包含人GLP1R基因的cDNA序列。[0047] 优选的，所述的靶向载体包含的人GLP1R基因的部分包含人GLP1R基因的CDS序列。[0048] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含的人GLP1R基因的部分核苷酸序列包含下列组中的一种：[0049] (i)包含SEQIDNO：5所示核苷酸序列的全部或部分；[0050] (ii)包含与SEQIDNO：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0051] (iii)包含与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0052] (iv)包含与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0053] 优选的，所述的靶向载体包含的人源化GLP1R基因的部分为本发明的第一方面所述的人源化GLP1R基因的部分。[0054] 优选的，所述的靶向载体还包含辅助序列，所述辅助序列连接于人GLP1R基因之后。进一步优选的，所述的辅助序列选自终止密码子、翻转序列或敲除序列。更进一步优选的，所述的辅助序列为非人动物的3’UTR和/或polyA。[0055] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体的核苷酸序列包含下列组中的一种：[0056] (i)包含SEQIDNO：6所示核苷酸序列的全部或部分；[0057] (ii)包含与SEQIDNO：6所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0058] (iii)包含与SEQIDNO：6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0059] (iv)包含与SEQIDNO：6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0060] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体的核苷酸序列包含下列组中的一种：[0061] (i)包含SEQIDNO：7所示核苷酸序列的全部或部分；[0062] (ii)包含与SEQIDNO：7所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0063] (iii)包含与SEQIDNO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0064] (iv)包含与SEQIDNO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0065] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体的核苷酸序列包含与SEQIDNO：10具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。[0066] 优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物GLP1R基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000083.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQIDNO：3至少具有90％同源性，或者包含SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。和/或，所述的GLP1R基因靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物GLP1R基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000083.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQIDNO：4至少具有90％同源性，或者包含SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。[0067] 优选的，所述靶向载体的待改变的转换区位于非人动物GLP1R基因座上。进一步优选的，位于非人动物GLP1R基因的1号至13号外显子上。更进一步优选的，位于非人动物GLP1R基因的1号外显子上。[0068] 在本发明的一个具体实施方式中，位于非人动物GLP1R基因的编码信号肽的核苷酸序列之前。[0069] 优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。[0070] 优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。[0071] 优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为scid null ‑/‑ ‑/‑优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD‑Prkdc IL‑2rγ 小鼠、NOD‑Rag1 ‑IL2rg (NRG)小‑/‑ ‑/‑鼠、Rag2 ‑IL2rg (RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。[0072] 优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。[0073] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。[0074] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。[0075] 本发明的第三方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物GLP1R基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的GLP1R基因上的靶序列上。[0076] 优选的，所述sgRNA的靶位点位于GLP1R基因的1号外显子至13号外显子序列上。[0077] 优选的，所述sgRNA的靶位点位于GLP1R基因的1号外显子序列上。[0078] 本发明的第四方面，提供了一种GLP1R基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化GLP1R蛋白。[0079] 优选的，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R蛋白的全部或部分。[0080] 进一步优选的，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R基因1号至13号外显子编码的氨基酸的全部或部分。[0081] 进一步优选的，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。[0082] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R蛋白的胞外区的全部或部分。其中，所述的人GLP1R蛋白的胞外区可以包含一段连续的氨基酸序列或者包含几段连续的氨基酸序列的间隔排列。[0083] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R蛋白的单次跨膜蛋白结构，或多次跨膜蛋白结构。所述的多次跨膜蛋白结构包含两次、三次、四次、五次、六次、七次或八次。所述的单次跨膜结构包含一次跨膜区、一次胞质区和一次胞外区。[0084] 优选的，所述的非人动物的内源GLP1R蛋白表达降低或缺失。[0085] 优选的，所述的非人动物包含人源化GLP1R基因。[0086] 优选的，所述的人源化GLP1R基因包含编码人GLP1R蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列，优选地，所述的人源化GLP1R基因包含编码胞外区至少10个连续氨基酸的核苷酸序列。[0087] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因包含编码人GLP1R蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列。其中，所述的人GLP1R蛋白的胞外区可以包含一段连续的氨基酸序列或者包含几段连续的氨基酸序列的间隔排列。[0088] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因包含编码人GLP1R蛋白的单次跨膜蛋白结构，或多次跨膜蛋白结构的全部或部分核苷酸序列。所述的多次跨膜蛋白结构包含两次、三次、四次、五次、六次或七次。所述的单次跨膜结构包含一次跨膜区、一次胞质区和一次胞外区。[0089] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因包含编码与SEQIDNO：2具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含编码与SEQIDNO：2所示氨基酸序列一致的核苷酸序列。[0090] 优选的，所述的人源化GLP1R基因包含人GLP1R基因的部分。进一步优选的，所述的人源化GLP1R基因包含人GLP1R基因的1号至13号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含1号至13号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至12号外显子的全部和13号外显子的部分，其中1号外显子的部分包含从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，13号外显子的部分包含从13号外显子的第一个核苷酸至终止密码子为止。[0091] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因包含人GLP1R基因的cDNA序列。[0092] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因包含人GLP1R基因的CDS序列。[0093] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：[0094] (i)包含SEQIDNO：5所示核苷酸序列的全部或部分；[0095] (ii)包含与SEQIDNO：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0096] (iii)包含与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0097] (iv)包含与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0098] 优选的，所述的人源化GLP1R基因还包含辅助序列。其中，所述辅助序列连接于人GLP1R基因之后。[0099] 优选的，所述的辅助序列选自终止密码子、翻转序列或敲除序列。进一步优选的，所述的辅助序列为非人动物的3’UTR和/或polyA。[0100] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：[0101] (i)包含SEQIDNO：6所示核苷酸序列的全部或部分；[0102] (ii)包含与SEQIDNO：6所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0103] (iii)包含与SEQIDNO：6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0104] (iv)包含与SEQIDNO：6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0105] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：[0106] (i)包含SEQIDNO：7所示核苷酸序列的全部或部分；[0107] (ii)包含与SEQIDNO：7所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0108] (iii)包含与SEQIDNO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0109] (iv)包含与SEQIDNO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0110] 优选的，所述的人源化GLP1R基因还包含非人动物GLP1R基因。[0111] 优选的，人GLP1R基因的部分或者人源化GLP1R基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。[0112] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因按照5’到3’方向顺序为非人动物1号外显子的部分、人GLP1R基因的部分、辅助序列和非人动物1号外显子的部分、2号至13号外显子的全部。[0113] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：[0114] a)所述人源化GLP1R蛋白中来源于人GLP1R蛋白的氨基酸序列包含SEQIDNO：2所示氨基酸序列的全部或部分；[0115] b)所述人源化GLP1R蛋白中来源于人GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0116] c)所述人源化GLP1R蛋白中来源于人GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或[0117] d)所述人源化GLP1R蛋白中来源于人GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。[0118] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：[0119] a)所述人源化GLP1R蛋白中来源于非人动物GLP1R蛋白的氨基酸序列包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列的部分；[0120] b)所述人源化GLP1R蛋白中来源于非人动物GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：1所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0121] c)所述人源化GLP1R蛋白中来源于非人动物GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：1所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或[0122] d)所述人源化GLP1R蛋白中来源于非人动物GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。[0123] 优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。[0124] 优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。[0125] 优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD‑PrkdcscidIL‑2rγnul小鼠、NOD‑Rag1‑/‑‑IL2rg‑/‑(NRG)小鼠、Rag2‑/‑‑IL2rg‑/‑(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。[0126] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R基因转录的mRNA序列包含下列组中的一种：[0127] (i)包含SEQIDNO：11所示核苷酸序列的全部或部分；[0128] (ii)包含与SEQIDNO：11所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0129] (iii)包含与SEQIDNO：11所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或[0130] (iv)包含与SEQIDNO：11所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。[0131] 优选的，所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰，进一步优选的，所述的其他基因包含人PD‑1、PD‑L1、CTLA4、LAG3、IL4、IL6或CCR4基因中的一种或两种以上的组合。[0132] 本发明的第五方面，提供了一种上述的GLP1R基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化GLP1R蛋白。优选的，所述的人源化GLP1R基因的部分为本发明的第一方面所述的人源化GLP1R基因的部分。[0133] 优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。[0134] 优选的，所述的构建方法包括用包含人GLP1R基因的部分核苷酸序列导入至非人动物GLP1R基因座上。进一步优选的，用包含人GLP1R基因的1号至13号外显子的全部或部分导入至非人动物GLP1R基因座上。更进一步优选的，用包含人GLP1R基因的1号至13号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合导入至非人动物GLP1R基因座上。最为优选的，用包含人GLP1R基因的1号外显子的部分、2号至12号外显子的全部和13号外显子的部分导入至非人动物GLP1R基因座上，其中1号外显子的部分包含从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，13号外显子的部分包含从13号外显子的第一个核苷酸至终止密码子为止。[0135] 优选的，所述导入包括插入或替换。[0136] 在本发明的一个具体实施方式中，用包含与SEQIDNO：5具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQIDNO：5所示的核苷酸序列插入或替换至非人动物GLP1R基因座上。[0137] 优选的，所述的构建方法包括用包含人GLP1R基因的cDNA序列插入或替换至非人动物GLP1R基因座上。[0138] 优选的，所述的构建方法包括用包含人GLP1R基因的CDS序列插入或替换至非人动物GLP1R基因座上。[0139] 优选的，所述的构建方法包括用包含编码人或人源化GLP1R蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物GLP1R基因座上。进一步优选的，用包含编码与SEQIDNO：2具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者编码包含SEQIDNO：2所示的核苷酸序列插入或替换至非人动物GLP1R基因。[0140] 优选的，插入或替换的人GLP1R基因后还包含辅助序列，所述辅助序列连接于人GLP1R基因之后。进一步优选的，所述的辅助序列选自终止密码子、翻转序列或敲除序列。更进一步优选的，所述的辅助序列为非人动物的3’UTR和/或polyA。[0141] 优选的，所述的构建方法包括用包含人源化GLP1R基因的核苷酸序列插入或替换至非人动物GLP1R基因座上。[0142] 优选的，所述的插入或替换的位点为GLP1R基因的内源调控元件之后。进一步优选的，所述的导入的位点为1号外显子上。更进一步优选的，所述的导入的位点为编码信号肽的核苷酸序列之前。[0143] 优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。[0144] 优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化GLP1R基因。[0145] 优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化GLP1R蛋白。[0146] 优选的，所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰，进一步优选的，所述的其他基因包含PD‑1、PD‑L1、CTLA4、LAG3、IL4、IL6和CCR4中的至少一种。[0147] 优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。[0148] 在本发明的一个具体实施方式中，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含人GLP1R基因的部分。[0149] 优选的，所述的靶向载体包含的人GLP1R基因的部分包含人GLP1R基因的1号至13号外显子的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，包含人GLP1R基因的1号至13号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合。更进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至12号外显子的全部和13号外显子的部分，其中1号外显子的部分包含从起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸，13号外显子的部分包含从13号外显子的第一个核苷酸至终止密码子为止。再进一步优选的，所述的靶向载体包含的人GLP1R基因的部分包含人GLP1R基因的CDS序列。更进一步优选的，包含与SEQIDNO：5具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQIDNO：5所示的核苷酸序列。[0150] 优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物GLP1R基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000083.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQIDNO：3至少具有90％同源性，或者包含SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。和/或，所述的GLP1R基因靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物GLP1R基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000083.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQIDNO：4至少具有90％同源性，或者包含SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。[0151] 优选的，所述靶向载体的待改变的转换区位于非人动物GLP1R基因座上。进一步优选的，位于非人动物GLP1R基因的1号至13号外显子上。更进一步优选的，位于非人动物GLP1R基因的1号外显子上。[0152] 在本发明的一个具体实施方式中，位于非人动物GLP1R基因的编码信号肽的核苷酸序列之前。[0153] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得GLP1R基因人源化的非人动物。[0154] 优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向GLP1R基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物GLP1R基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的GLP1R基因上的靶序列上。[0155] 优选的，所述sgRNA的靶位点位于GLP1R基因的1号外显子至13号外显子序列上。[0156] 优选的，所述sgRNA的靶位点位于GLP1R基因的1号外显子序列上。[0157] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向GLP1R基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得GLP1R基因人源化的非人动物。[0158] 优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。[0159] 优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。[0160] 优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD‑PrkdcscidIL‑2rγnul小鼠、NOD‑Rag1‑/‑‑IL2rg‑/‑(NRG)小鼠、Rag2‑/‑‑IL2rg‑/‑(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。[0161] 本发明的第六方面，提供了一种人源化GLP1R蛋白，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R蛋白的全部或部分。[0162] 优选的，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R基因1号至13号外显子编码的氨基酸的全部或部分。[0163] 优选的，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。[0164] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R蛋白的胞外区的全部或部分。其中，所述的人GLP1R蛋白的胞外区可以包含一段连续的氨基酸序列或者包含几段连续的氨基酸序列的间隔排列。[0165] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R蛋白包含人GLP1R蛋白的单次跨膜蛋白结构，或多次跨膜蛋白结构。所述的多次跨膜蛋白结构包含两次、三次、四次、五次、六次、七次或八次。所述的单次跨膜结构包含一次跨膜区、一次胞质区和一次胞外区。[0166] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：[0167] a)所述人源化GLP1R蛋白中来源于人GLP1R蛋白的氨基酸序列包含SEQIDNO：2所示氨基酸序列的全部或部分；[0168] b)所述人源化GLP1R蛋白中来源于人GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0169] c)所述人源化GLP1R蛋白中来源于人GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或[0170] d)所述人源化GLP1R蛋白中来源于人GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。[0171] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GLP1R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：[0172] a)所述人源化GLP1R蛋白中来源于非人动物GLP1R蛋白的氨基酸序列包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列的部分；[0173] b)所述人源化GLP1R蛋白中来源于非人动物GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：1所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；[0174] c)所述人源化GLP1R蛋白中来源于非人动物GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：1所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或[0175] d)所述人源化GLP1R蛋白中来源于非人动物GLP1R蛋白的氨基酸序列包含与SEQIDNO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。[0176] 优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。[0177] 优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。[0178] 优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD‑PrkdcscidIL‑2rγnul小鼠、NOD‑Rag1‑/‑‑IL2rg‑/‑(NRG)小鼠、Rag2‑/‑‑IL2rg‑/‑(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。[0179] 本发明的第七方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。[0180] 本发明的第八方面，提供了一种包含上述sgRNA或者上述DNA分子的sgRNA载体。[0181] 本发明的第九方面，提供了一种包含上述靶向载体、sgRNA、DNA分子和/或sgRNA载体的细胞。[0182] 本发明的第十方面，提供了上述靶向载体，sgRNA，DNA分子，sgRNA载体或者上述的包含靶向载体、sgRNA、DNA分子和/或sgRNA载体的细胞在GLP1R基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。[0183] 本发明的第十一方面，提供了一种多基因修饰的非人动物，所述的非人动物为上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物，且所述的非人动物基因组中包含基因PD‑1、PD‑L1、CTLA4、LAG3、IL4、IL6或CCR4中的一种或两种以上的组合的修饰。[0184] 本发明的第十二方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：[0185] (一)提供上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物；[0186] (二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。[0187] 优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD‑1、PD‑L1、CTLA4、LAG3、IL4、IL6或CCR4中的一种或两种以上的组合人源化的非人动物。[0188] 优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。[0189] 优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。[0190] 本发明的第十三方面，提供了一种上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或其子代。[0191] 本发明的第十四方面，提供了一种GLP1R基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失GLP1R基因的全部或部分核苷酸序列。[0192] 优选的，所述的非人动物缺失GLP1R基因的1号至13号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失1号外显子的起始密码子开始至13号外显子终止密码子为止。[0193] 在本发明的一个具体实施方式中，采用上述sgRNA构建GLP1R基因缺失的非人动物。[0194] 本发明的第十五方面，提供了一种动物的荷瘤或代谢类疾病模型，所述的荷瘤或代谢类疾病模型来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物。[0195] 本发明的第十六方面，提供一种动物的荷瘤或代谢类疾病模型的构建方法，所述的构建方法包含获得上述的非人动物的步骤。[0196] 本发明的第十七方面，提供上述非人动物、上述构建方法获得的非人动物在制备动物的荷瘤或代谢类疾病模型中的应用[0197] 本发明的第十八方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或上述的荷瘤或代谢类疾病模型。[0198] 本发明的第十九方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或上述的荷瘤或代谢类疾病模型。[0199] 本发明的第二十方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或上述的荷瘤或代谢类疾病模型。[0200] 本发明的第二十一方面，提供了一种GLP1R基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化GLP1R蛋白；优选的，所述的细胞表达上述的人源化GLP1R蛋白。[0201] 优选的，所述的细胞的基因组中包含人GLP1R基因的部分。进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化GLP1R基因。[0202] 本发明的第二十二方面，提供了一种GLP1R基因缺失的细胞，所述的细胞缺失GLP1R基因的全部或部分核苷酸序列。[0203] 优选的，所述的细胞缺失GLP1R基因的1号至13号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失1号外显子的起始密码子开始至13号外显子终止密码子为止。[0204] 在本发明的一个具体实施方式中，采用上述sgRNA构建GLP1R基因缺失的细胞。[0205] 本发明的第二十三方面，提供了一种包含上述的人源化GLP1R基因的构建体。[0206] 本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。[0207] 本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述细胞的组织。[0208] 本发明的第二十六方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的人源化GLP1R蛋白、上述的人源化GLP1R基因、上述的荷瘤或代谢类疾病模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究GLP1R通路功能、人GLP1R通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物、心血管疾病药物和代谢类疾病药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。[0209] 本发明的第二十七方面，提供了一种人GLP1R特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向个体施加调节剂，检测代谢参数；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或代谢类疾病模型。[0210] 优选的，所述的调节剂选自CAR‑T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体或小分子药物。[0211] 优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。[0212] 优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。[0213] 优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。[0214] 优选的，所述人GLP1R特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。[0215] 本发明的第二十八方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体施加调节剂，检测代谢参数；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的荷瘤或代谢类疾病模型。[0216] 优选的，所述的干预方案选自CAR‑T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。[0217] 优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。[0218] 本发明的第二十九方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或代谢类疾病模型在制备人GLP1R特异性调节剂中的用途。[0219] 本发明的第三十方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或代谢类疾病模型在制备治疗心血管疾病、代谢类疾病和肿瘤药物或免疫相关疾病的药物中的用途。[0220] 本发明所述的GLP1R基因人源化的非人动物，其体内可正常表达人或人源化GLP1R蛋白，可用于针对人GLP1R通路靶位点的药物筛选、药效评估和免疫相关疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。[0221] 本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、皮炎、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。[0222] 本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳癌、子宫内膜癌、胰岛素瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺瘤、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为胰岛素瘤、甲状腺乳头状瘤。本发明所述的“心血管疾病”包括但不限于高血压、心绞痛、心肌梗死、冠心病、心力衰竭、心律失常、心内膜炎、心包炎、非酒精性脂肪肝病、高脂血症、动脉硬化等疾病。[0223] 本发明所述的“代谢类疾病”指因代谢问题引起的疾病，包括代谢障碍或代谢旺盛等原因引起的疾病，所述的代谢类疾病包括但不限于糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖高渗综合征、低血糖症、痛风、蛋白质‑能量营养不良症、维生素A缺乏病、坏血病或维生素D缺乏病。也可以为代谢性脑病或者先天性代谢障碍等等。[0224] 本发明所述的“小分子药物”可以为小分子靶向药物，通常分子量小于1000，一般为化学合成药物。[0225] 本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。[0226] 本发明所述的“人源化GLP1R蛋白”，包含来源于人GLP1R蛋白的部分和非人GLP1R蛋白的部分。其中，所述的“人源化GLP1R蛋白”包含连续或间隔的5‑463个氨基酸序列与人GLP1R蛋白的氨基酸序列一致。[0227] 本发明所述的“人源化GLP1R基因”，包含来源于人GLP1R基因的部分，优选还包含辅助序列，更优选还包含非人GLP1R基因的部分。其中，所述的“人源化GLP1R基因”包含连续或间隔的20‑40000bp个核苷酸序列与人GLP1R基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20‑1392bp个，更优选为20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1392、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、5000、10000、20000、30000或40000bp个核苷酸序列与人GLP1R基因的核苷酸序列一致。[0228] 本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如“1号至13号外显子”或“1号至13号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，即1号外显子、1‑2号内含子、2号外显子、2‑3号内含子、3号外显子、3‑4号内含子、4号外显子、4‑5号内含子、5号外显子、5‑6号内含子、6号外显子、6‑7号内含子、7号外显子、7‑8号内含子、8号外显子、8‑9号内含子、9号外显子、9‑10号内含子、10号外显子、10‑11号内含子、11号外显子、11‑12号内含子、12号外显子、12‑13号内含子和13号外显子的全部核苷酸序列。[0229] 本发明所述的“x‑xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1‑2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。[0230] 本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“GLP1R基因座”表示GLP1R基因1号至13号外显子上的任选一段的DNA片段或任选两个核苷酸之间。在本发明的一个具体实施方式中，被插入或替换的GLP1R基因座可以是GLP1R基因1号至13号外显子上的任选一段的DNA片段；优选插入1号外显子上的任意两个核苷酸之间。[0231] 本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre‑mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。[0232] 本发明所述的“三个以上”包括但不限于三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个等。[0233] 本发明所述的“连续三个以上”包括但不限于连续三个、连续四个、连续五个、连续六个、连续七个、连续八个、连续九个、连续十个、连续十一个、连续十二个、连续十三个或连续十四个等。其中“1号至13号外显子的连续三个以上”包括连续三个、连续四个、连续五个、连续六个、连续七个、连续八个、连续九个、连续十个、连续十一个、连续十二个、连续十三个或连续十四个等等外显子，还包括期间的内含子核苷酸序列。[0234] 本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。[0235] 本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。[0236] 本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。[0237] 在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。[0238] 在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。[0239] 除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEd.，ed.BySambrook，FritschandManiatis(ColdSpringHarborLaboratoryPress：1989)；DNACloning，VolumesIandII(D.N.Glovered.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAnd Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；theseries，MethodsInENZYMOLOGY(J.AbelsonandM.Simon，eds.inchief，AcademicPress，Inc.，NewYork)，specifically，Vols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.185，″GeneExpressionTechnology″(D.Goeddel，ed.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker，eds.，AcademicPress，London，1987)；HandbookOfExperimentalImmunology，VolumesV(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.，1986)；andManipulatingtheMouseEmbryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。[0240] 以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。[0241] 本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。[0242] 下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。附图说明[0243] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：[0244] 图1：小鼠GLP1R基因和人GLP1R基因座对比示意图(非按比例)，其中mExon4‑5为mExon4和mExon5，mExon8‑11为mExon8、mExon9、mExon10和mExon11，hExon2‑3为hExon2和hExon3，hExon4‑5为hExon4和hExon5，hExon8‑11为hExon8、hExon9、hExon10、hExon11；[0245] 图2：小鼠GLP1R基因人源化改造示意图(非按比例)，其中，chiExon4‑5为chiExon4和chiExon5，chiExon8‑11为chiExon8、chiExon9、chiExon10，chiExon11；[0246] 图3：GLP1R基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；[0247] 图4：GLP1R重组后细胞SouthernBlot结果，其中WT为野生型对照，1‑B02、1‑B11、1‑F08、1‑G11、1‑G12、1‑H05、2‑B01、2‑C01、2‑H01为克隆编号；[0248] 图5：GLP1R人源化小鼠F1代鼠尾基因型鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水对照，PC为阳性对照，F1‑01、F1‑02为小鼠编号；[0249] 图6：C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化杂合子小鼠体内GLP1RRT‑PCR检测结果，其中+/+为C57BL/6野生型小鼠，H/+为GLP1R基因人源化杂合子小鼠，H2O为水对照，GAPDH为甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶内参；[0250] 图7：C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠体内GLP1RRT‑PCR检测结果，其中+/+为C57BL/6野生型小鼠，H/H为GLP1R基因人源化纯合子小鼠，H2O为水对照，GAPDH为甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶内参；[0251] 图8：C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠体内GLP1R蛋白检测结果，其中+/+为C57BL/6野生型小鼠，H/H为GLP1R基因人源化纯合子小鼠，β‑actin为β‑肌动蛋白内参；[0252] 图9：C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠胰腺组织IHC染色结果，其中+/+为C57BL/6小鼠，H/H为GLP1R基因人源化纯合子小鼠，ISO为同型对照；[0253] 图10：药效实验方案和分组及给药情况；[0254] 图11：实验过程中各组小鼠体重变化情况；[0255] 图12：实验过程中各组小鼠非空腹血糖变化情况；[0256] 图13：实验过程中各组小鼠空腹血糖变化情况；[0257] 图14：IPGTT血糖浓度变化情况；[0258] 图15：IPGTT的曲线下面积AUC；[0259] 图16：野生型C57BL/6小鼠(C57BL/6)和GLP1R基因人源化纯合子小鼠(GLP1R)脾脏中白细胞亚型百分比；[0260] 图17：野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠脾脏中T细胞亚型百分比；[0261] 图18：野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠淋巴结中白细胞亚型百分比；[0262] 图19：野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠淋巴结中T细胞亚型百分比；[0263] 图20：野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠外周血中白细胞亚型百分比；[0264] 图21：野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠脾脏外周血中T细胞亚型百分比；[0265] 图22：药效实验方案和检测情况；[0266] 图23：实验过程中各组小鼠体重变化情况；[0267] 图24：实验过程中各组小鼠摄食量；[0268] 图25：实验过程中各组小鼠随机血糖变化情况；[0269] 图26：实验过程中各组小鼠IPGTT血糖变化情况；[0270] 图27：实验过程中各组小鼠血清中胰岛素含量；[0271] 图28：实验过程中各组小鼠血清中胰高血糖素含量；[0272] 图29：实验过程中各组小鼠血清中GLP‑1含量。具体实施方式[0273] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0274] 在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：[0275] SspI、BamHI、EcoRI酶购自NEB，货号分别为R0132M、R0136M、R0101M；[0276] C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；[0277] BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自碧云天，货号P0010S；[0278] SDS‑PAGE凝胶配制试剂盒购自碧云天，货号P0012A；[0279] PVDF膜(进口分装,6.6×8.5cm,0.2μm)购自碧云天，货号FFP24；[0280] GLP1RPolyclonalAntibody购自Abclonal，货号A13990；[0281] β‑ActinMouseMonoclonalAntibody购自碧云天，货号AF0003；[0282] 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自碧云天，货号A0208；[0283] BeyoECLStar(特超敏ECL化学发光试剂盒)购自碧云天，货号P0018AS；[0284] 重组Anti‑GLP‑1R抗体[EPR23507‑57]购自abcam，货号ab254352；[0285] GoatAnti‑RabbitIgG(H+L)Biotinglated购自Vectorlab，货号BA‑1000；[0286] ZombieNIRTMFixableViabilityKit购自Biolegend，货号423106；[0287] BrilliantViolet510TManti‑mouseCD45Antibody购自Biolegend，货号103138；[0288] PerCPanti‑mouseLy‑6G/Ly‑6C(Gr‑1)Antibody购自Biolegend，货号108426；[0289] BrilliantViolet421TManti‑mouseCD4Antibody购自Biolegend，货号100438；[0290] FITCanti‑mouseF4/80Antibody购自Biolegend，货号123108；[0291] PEanti‑mouseCD8aAntibody购自Biolegend，货号100708；[0292] PE/CyTM7Mouseanti‑mouseNK1.1Antibody购自BDPharmingen，货号552878；[0293] APCanti‑mouse/ratFoxp3Antibody购自eBioscience，货号17‑5773‑82；[0294] FITCanti‑MouseCD19Antibody购自Biolegend，货号115506；[0295] PerCP/Cy5.5anti‑mouseTCRβchainAntibody购自Biolegend，货号109228；[0296] APCHamsterAnti‑MouseTCRβChainAntibody购自BDPharmingen，货号553174；[0297] BrilliantViolet605TManti‑mouseCD11cAntibody购自Biolegend，货号117334；[0298] PEanti‑mouse/humanCD11bAntibody购自Biolegend，货号101208。[0299] 实施例1GLP1R基因人源化小鼠[0300] 小鼠GLP1R基因(NCBIGeneID：14652，Primarysource：MGI：99571，UniProt：O35659，位于17号染色体NC_000083.6的第30901867至30936510位，基于转录本NM_021332.2及其编码蛋白NP_067307.2(SEQIDNO：1))和人GLP1R基因(NCBIGeneID：2740，Primarysource：HGNC:4324，UniProtID：P43220，位于6号染色体NC_000006.12的第39048781至39091303位，基于转录本NM_002062.5及其编码蛋白NP_002053.3(SEQIDNO：2))对比示意图如图1所示。[0301] 为了达到本发明的目的，可在小鼠内源GLP1R基因座引入编码人GLP1R蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化GLP1R蛋白。例如，可以使用基因编辑技术，在小鼠1号外显子插入编码人GLP1R蛋白的核苷酸序列。为了使人GLP1R蛋白在小鼠体内更稳定的表达，在人GLP1R核苷酸序列后插入小鼠3’UTR序列和polyA(多聚腺苷酸)。最终得到的改造后的人源化小鼠GLP1R基因座示意图如图2所示。[0302] 进一步设计了如图3所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠GLP1R基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人GLP1R序列、小鼠3’UTR序列、polyA和Neo盒的A片段。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQIDNO：3)与NCBI登录号为NC_000083.6的第30897870至30901876位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQIDNO：4)与NCBI登录号为NC_000083.6的第30901880至30906647位核苷酸序列相同；人GLP1R序列(SEQIDNO：5)与NCBI登录号为NM_002062.5的第61至1452位核苷酸序列相同；小鼠3’UTR如SEQIDNO：6所示，polyA序列如SEQIDNO：7所示。A片段上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neocassette)。其中，人GLP1R序列、小鼠3’UTR序列、polyA和Neo盒按5’到3’方向顺序排列，人GLP1R序列上游和小鼠5’同源臂序列直接相连；Neo盒上游与polyA序列的连接设计为[0303] 5’‑GACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTT‑3’(SEQIDNO：8)，其中序列“TATGG”中最后一个“G”是polyA序列的最后一个核苷酸，序列“GAATT”中的“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒下游与小鼠3’同源臂的连接设计为：[0304] 5’‑ATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATTAGGTGGATCCgccagcaccccaagcctcctgcgcctggcgctcctgctgc‑3’(SEQIDNO：9)，其中序列“GATCC”中最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“gccag”中第一个“g”是小鼠的第一个核苷酸。A片段的序列如SEQIDNO：10所示。[0305] 此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠GLP1R的mRNA序列如SEQIDNO：11所示。[0306] 靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。小鼠基因序列来自细菌人工染色体(BAC)克隆RP23‑26M14，人GLP1R序列为直接合成。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和SouthernBlot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行SouthernBlot(分别用SspI或BamHI或EcoRI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，结果如图4所示，检测结果表明9个经PCR验证为阳性的克隆均无随机插入，经测序进一步验证这9个克隆均为阳性克隆且无随机插入，具体编号为1‑B02、1‑B11、1‑F08、1‑G11、1‑G12、1‑H05、2‑B01、2‑C01、2‑H01。[0307] 表1：具体探针及目的片段长度[0308]限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小SspI 5’Probe 19.4kb 9.8kbBamHI 3’Probe 9.5kb 6.1kbEcoRI NeoProbe — 10.9kb[0309] 其中，PCR测定包括下述引物：[0310] F1：5’‑CACATTCAGAGTGAGTCTTGTCATC‑3’(SEQIDNO：12)，[0311] R1：5’‑CATTTCTGCACCGTCTCCCAGAGG‑3’(SEQIDNO：13)；[0312] F2：5’‑CAGGACATAGCGTTGGCTAC‑3’(SEQIDNO：14)，[0313] R2：5’‑CCAGAGCCCCGGAGTCTTA‑3’(SEQIDNO：15)；[0314] SouthernBlot检测包括如下探针引物：[0315] 5’探针(5’Probe)：[0316] 5’Probe‑F：5’‑TCTCTCTCCTTAGGGAGTCATCCTT‑3’(SEQIDNO：16)，[0317] 5’Probe‑R：5’‑ATGGTCTATGCTCACAGATCCAATC‑3’(SEQIDNO：17)；[0318] 3’探针(3’Probe)：[0319] 3’Probe‑F：5’‑AGGCTAGCTAAAGGGAGCACTCAGA‑3’(SEQIDNO：18)，[0320] 3’Probe‑R：5’‑GTTGCAGGATGTGGTCTCACAGAGG‑3’(SEQIDNO：19)；[0321] Neo探针(NeoProbe)：[0322] NeoProbe‑F：5’‑GGATCGGCCATTGAACAAGA‑3’(SEQIDNO：20)，[0323] NeoProbe‑R：5’‑CAGAAGAACTCGTCAAGAAG‑3’(SEQIDNO：21)。[0324] 将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到人源化GLP1R基因纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图5，其中，编号为F1‑01、F1‑02的2只小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的人源化GLP1R基因工程小鼠。[0325] 表2：引物名称及具体序列[0326][0327] 可通过RT‑PCR方法检测GLP1R基因人源化小鼠体内人GLP1RmRNA的表达情况。具体来说，分别选取8周龄野生型C57BL/6小鼠和本方法制备的GLP1R基因人源化杂合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取肺部组织，设计如表3所示引物序列对C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化杂合子小鼠肺部细胞的mRNA表达情况进行检测。结果显示，在C57BL/6小鼠肺部细胞中仅检测到鼠GLP1RmRNA的表达(图6A)；在GLP1R基因人源化杂合子小鼠肺部细胞中既检测到人GLP1RmRNA的表达(图6A)，也检测到鼠GLP1RmRNA的表达(图6B)。[0328] 表3RT‑PCR检测引物序列及目的片段长度[0329][0330] 同样采用RT‑PCR方法检测GLP1R基因人源化纯合子小鼠肺部GLP1RmRNA的表达情况，所用引物序列如表4所示，检测结果(如图7所示)显示，在C57BL/6野生型小鼠肺部细胞中仅检测到鼠GLP1RmRNA的表达(图7A)；在GLP1R基因人源化纯合子小鼠肺部细胞中仅检测到人GLP1RmRNA的表达(图7B)。[0331] 表4GLP1R基因人源化纯合子小鼠RT‑PCR检测引物序列及目的片段长度[0332][0333] 进一步通过WesternBlot方法检测野生型C57BL/6小鼠和本方法制备的GLP1R基因人源化纯合子小鼠肺部组织中人GLP1R蛋白的表达。具体来说，分别选取8周龄野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取肺部组织进行SDS‑PAGE电泳并转移至PVDF膜，与一抗人鼠GLP1R交叉识别抗体GLP1RPolyclonalAntibody(Abclonal)和二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天)孵育后，经BeyoECLStar试剂盒显色检测GLP1R蛋白，结果如图8所示。从图中可以看出，在野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠肺部组织中均检测到GLP1R蛋白的表达。结合图7的RT‑PCR检测结果可知，GLP1R基因人源化纯合子小鼠肺部组织中检测到的蛋白为人GLP1R蛋白。证明本方法制备的GLP1R基因人源化小鼠体内可成功表达人GLP1R蛋白。[0334] 此外，通过免疫组化染色IHC检测GLP1R基因人源化纯合子小鼠胰腺组织中人GLP1R蛋白的表达情况。选取8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠，安乐死后取胰腺组织，福尔马林固定、石蜡包埋切片后分别使用特异性抗人GLP1R抗体(重组Anti‑GLP‑1R抗体，ab254352)或ISO对照抗体IgG进行IHC染色检测，观察组织病理学变化，结果如图9所示。从图中可以看出，在GLP1R基因人源化纯合子小鼠胰腺组织中观察到典型的细胞膜、胞质黄褐色着色(图9G、图9H、图9I)，在ISO对照组(图9A、图9B、图9C)和野生型C57BL/6小鼠(图9D、图9E、图9F)胰腺组织中并未检测到该特征。表明GLP1R基因人源化纯合子小鼠体内可成功表达人GLP1R蛋白。[0335] 进一步采用流式细胞术对野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠体内免疫细胞亚型进行分析。选取9周龄野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠TM各3只，取脾脏细胞、淋巴结和外周血，用抗鼠CD45抗体BrilliantViolet510 anti‑mouseCD45(CD45)、抗鼠Gr‑1抗体PerCPanti‑mouseLy‑6G/Ly‑6C(Gr‑1)Antibody(Gr‑1)、抗鼠TMCD4抗体BrilliantViolet421 anti‑mouseCD4Antibody(CD4)、抗鼠F4/80抗体FITCanti‑mouseF4/80Antibody、抗鼠CD8a抗体PEanti‑mouseCD8aAntibody、抗鼠NK1.1抗TM体PE/Cy 7Mouseanti‑mouseNK1.1Antibody(NK1.1)、抗鼠Foxp3抗体APCanti‑mouse/ratFoxp3Antibody(Foxp3)、抗鼠CD19抗体FITCanti‑MouseCD19Antibody(CD19)、抗鼠TCRβ抗体PerCP/Cy5.5anti‑mouseTCRβchainAntibody(TCRβ)、抗鼠CD11c抗体TMBrilliantViolet605 anti‑mouseCD11cAntibody(CD11c)和抗鼠CD11b抗体PEanti‑mouse/humanCD11bAntibody(CD11b)进行染色，将染色后的细胞进行流式检测。[0336] 脾细胞中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图16和图17所示，淋巴结中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图18和图19所示，外周血中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图20和图21所示，从图中可以看出，GLP1R基因人源化纯合子小鼠脾脏和外周血中B细胞(BCells，特征为CD45+CD19+)、T细胞(Tcells，特征为CD45+TCRβ+)、NK细胞+ +(NKcell，特征为CD45+TCRβ‑NK1.1+)、CD4T细胞(CD4Tcells，特征为CD45+CD4+)、CD8+T细+胞(CD8 Tcells，特征为CD45+CD8+)、粒细胞(Granulocyte，特征为CD45+Gr‑1+)、DC细胞(Dendriticcells，特征为CD45+TCRβ‑CD11c+)、巨噬细胞(Macrophages，特征为CD45+Gr‑1‑CD11b+F4/8+)和单核细胞(Monocytes，特征为CD45+Gr‑1‑CD11b+F4/8‑)等白细胞亚型与+ +C57BL/6野生型小鼠基本一致(图16和图20)，CD4T细胞、CD8T细胞和Treg细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图17和图21)；淋巴结中B细胞(Bcells)、T细胞(T+ + + +cells)、NK细胞(NKcell)、CD4T细胞(CD4Tcells)和CD8T细胞(CD8Tcells)等白细胞+ + + +亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图18)，CD4T细胞(CD4 Tcells)、CD8T细胞(CD8 Tcells)和Treg细胞(Tregs)T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图19)，表明GLP1R基因的人源化改造没有影响小鼠脾细胞、淋巴结和外周血中白细胞的分化、发育和分布。[0337] 实施例2GLP1R基因人源化小鼠体内药效实验[0338] 分别选取7周龄雄性野生型C57BL/6小鼠(WT)和GLP1R基因人源化纯合子小鼠(H/H)各10只，按照体重随机分为对照组(G1、G3)和给药组(G2、G4)，对照组皮下注射(s.c.)磷酸盐缓冲液PBS，给药组皮下注射10mg/kgGLP1R激动剂Dulaglutide，每两天给药一次，共给药5次，每次给药前测定小鼠体重和非空腹血糖浓度。第二次给药和第四次给药后，小鼠禁食过夜，通过腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)评估小鼠对葡萄糖的耐受力，具体为：腹腔注射2g/kg葡萄糖D‑Glucose，注射后15min、30min、60min、120min时间点分别采血测定血糖值，并计算曲线下面积(AUC)。具体药效实验方案和分组及给药情况分别如图10和表5所示。[0339] 表5药效实验分组及给药情况[0340][0341] 实验过程中各组小鼠体重(如图11所示)保持平稳状态，未发生显著变化；与PBS对照组(G1、G3)相比，Dulaglutide给药均降低了野生型C57BL/6小鼠和GLP1R基因人源化纯合子小鼠的非空腹血糖(图12)和空腹血糖(图13)；图14为IPGTT血糖浓度变化情况，从中可以看出，在给与葡萄糖负荷后，各组小鼠的血糖在15min内达到高峰，随后开始下降，GLP1R基因人源化纯合子小鼠体内的葡萄糖代谢表现出与野生型C57BL/6小鼠相似的葡萄糖耐受力；Dulaglutide给药组小鼠的AUC相较于PBS对照组均呈现出显著下降趋势(P≤0.05)(图15)。实验数据显示，GLP1R基因人源化纯合子小鼠具有与野生型C57BL/6小鼠相似的血糖调节能力，以保持体内血糖稳态。[0342] 实施例3体内药效验证[0343] 利用本方法制得的GLP1R人源化小鼠可以用于评估靶向人GLP1R的调节剂的药效，本实施例中采用杜拉鲁肽(Dulaglutide)为阳性药，该药(序列参考专利WO2009009562A2)是礼来公司研发的一款胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)受体激动剂，对人GLP1R和鼠GLP1R均具有亲和性。[0344] 分别选取7周龄雄性野生型C57BL/6小鼠(WT)和GLP1R基因人源化纯合子小鼠(H/H)各20只，对所有小鼠进行高脂饮食12周，诱导肥胖和高血糖模型。[0345] 1、实验方法[0346] 于第13周，按表5进行随机分组给药，分组当天记为D0，第二天记为D1，以此类推，进行计算。实验方案如图22所示，单只小鼠体重下降超过20％时执行安乐死结束实验。具体的给药、剂量、给药方式和频率如表5所示，实验组皮下注射(sc)给予1mg/kgDulaglutide，对照组给相同剂量同型对照PBS，每两天给药1次，连续给药10天，共给药5次。检测方案如下：每次给药前测定随机血糖(RBG)浓度和体重；第二次给药后，禁食处理，第二天进行糖耐受实验(OGTT)(方案：小鼠测完禁食血糖后，腹腔注射2g/kgD‑葡萄糖，在注射后15min、30min、60min和120min时间点测定血糖值，葡萄糖溶液配置方法为20％质量分数，给药剂量10ul/g体重，溶剂为生理盐水)；第四次给药后，小鼠进行禁食处理，第二天测禁食血糖；最后一次给药后48小时内眦采血，离心获得上清后，ELISA测定血清中胰高血糖素和胰岛素含量。[0347] 表6给药、剂量、给药方式和频率[0348] 组别 动物信息 受试品 动物数量 剂量(mg/kg) 给药方式 给药频率及次数G1 C57BL/6 PBS 10 NA s.c. Q2d*5G2 C57BL/6 Dulaglutide 10 1 s.c. Q2d*5G3 GLP1R PBS 10 NA s.c. Q2d*5G4 GLP1R Dulaglutide 10 1 s.c. Q2d*5[0349] 2、实验结果[0350] 对GLP1R人源化小鼠进行高脂饮食诱导肥胖模型，在实验过程中，小鼠体重普遍出现下降，在实验后期有小幅波动，其中给药组小鼠体重下降更明显(图23)，对其第一次给药前24小时(图24A)和第一次给药后24小时(图24B)摄食量进行分析，发现第一次给药前24小时给药组小鼠24小时摄食量与对照组无显著差异，而第一次给药后24小时给药组小鼠摄食量显著低于对照组，推测给予Dulaglutide为造成小鼠摄食量降低，小鼠体重的降低。同时对血糖进行检测，发现Dulaglutide处理以后小鼠血糖明显降低(图25)。在糖耐受检测中，Dulaglutide能够显著改善肥胖模型小鼠的糖耐受能力(图26)。在第一次给药后第十天(Day10)对其胰岛素、胰高血糖素和胰高血糖素样肽‑1水平进行分析，发现在15min时间点，给药组胰岛素水平与对照组相比有升高趋势(图27)，在给药后24小时时间点，对小鼠血浆中胰高血糖素和胰高血糖素样肽‑1的含量进行测定，发现Dulaglutide处理以后，小鼠血浆中胰高血糖素含量下降，并且G4组下降更明显(图28)，而胰高血糖素样肽‑1的含量明显升高(图29)。[0351] 以上结果说明，本发明实施例的GLP1R人源化小鼠用高脂饮食诱导肥胖模型，对GLP‑1受体激动剂Dulaglutide表现出良好的药效响应，包括：例如体重下降，摄食量的减少；在血糖控制方面，能够降低血糖，改善糖耐受能力，同时刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素分泌。说明GLP‑1受体激动剂Dulaglutide能与小鼠体内的人GLP1R蛋白结合，并激活GLP1R所在信号通路。实验结果表明，本发明实施例对小鼠GLP1R基因的人源化改造不影响GLP1R基因所在信号通路，该小鼠能够用于GLP‑1类似物药物的药效评价。[0352] 实施例4：双重人源化或多重双人源化小鼠的制备[0353] 利用本方法或制得的GLP1R小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD‑1、PD‑L1、CTLA4、LAG3、IL4、IL6或CCR4等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化GLP1R小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得GLP1R与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的GLP1R小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化GLP1R与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人GLP1R和其它基因调节剂的体内药效验证等。[0354] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。[0355] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。[0356] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

专利地区：北京

专利申请日期：2021-09-17

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114134152B