一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法

专利名称：一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111342591.7

专利申请（专利权）人：深圳杉海创新技术有限公司
权利人地址：广东省深圳市南山区桃源街道福光社区留仙大道3370号南山智园崇文园区2号楼2003

专利发明（设计）人：张嘉恒,廖雅,王岩,苏晶,詹憬博

专利摘要：本发明公开一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，由于人工皮肤模型具有与正常人类皮肤相似的结构和功能，不存在种属差异，基于人工皮肤模型进行甘油葡糖苷的皮肤渗透效率检测，测试结果为甘油葡糖苷实际应用提供的可参考性更强、准确度更高，以人工皮肤模型替代动物表皮，还能够避免大量实验动物的牺牲，同时降低了实验成本。并且，该方法通过荧光显微镜拍照可清晰地观测甘油葡糖苷溶液渗透行为到达的皮肤层位置，通过检测甘油葡糖苷的渗透浓度可反映出甘油葡糖苷溶液在人工皮肤模型上的透过量，渗透浓度越高，皮肤渗透效率越好。

主权利要求：
1.一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，其特征在于，包括步骤：提供一种人工皮肤模型和含有培养液的培养器皿；
将所述人工皮肤模型设置在所述培养液的上方，且所述人工皮肤模型与所述培养液不接触；
将甘油葡糖苷溶液涂抹在所述人工皮肤模型表面；
将涂抹过甘油葡糖苷溶液的人工皮肤模型和所述培养器皿置于CO2培养箱中孵育预定时间；
对孵育不同时间段的人工皮肤模型的组织样本进行冰冻切片后用荧光显微镜拍照，观测甘油葡糖苷溶液在不同时间段渗透到皮肤层的位置；
取已知浓度的甘油葡糖苷溶液进行倍比稀释，对稀释后的甘油葡糖苷溶液进行荧光强度检测，绘制得到甘油葡糖苷的标准曲线；
取所述孵育预定时间的培养液进行荧光强度检测，得到培养液的荧光强度值；
根据所述甘油葡糖苷的标准曲线和所述培养液的荧光强度值计算甘油葡糖苷的渗透浓度；
根据所述甘油葡糖苷溶液渗透到皮肤层的位置和所述甘油葡糖苷的渗透浓度评价皮肤渗透效率；
所述人工皮肤模型为3D表皮模型EpiKutis。
2.根据权利要求1所述的基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，其特征在于，所述甘油葡糖苷溶液中甘油葡糖苷的有效质量浓度为1‑40％。
3.根据权利要求1所述的基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，其特征在于，所述孵育预定时间为0.1‑10小时。
4.根据权利要求1所述的基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，其特征在于，所述CO2培养箱的温度为30‑40℃，CO2浓度为3‑10％。
5.根据权利要求1所述的基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，其特征在于，所述冰冻切片的步骤包括：向所述组织样本中加入4％多聚甲醛固定24小时，再经蔗糖脱水24小时，然后进行OCT包埋，最后用冰冻切片机进行切片。
6.根据权利要求1所述的基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，其特征在于，所述取所述孵育预定时间的培养液进行荧光强度检测的步骤包括：取所述孵育预定时间的培养液置于4℃保存24小时后，用荧光酶标仪检测培养液的荧光强度值。 说明书 : 一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法技术领域[0001] 本发明涉及化妆品技术领域，尤其涉及一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法。背景技术[0002] 甘油葡糖苷(Glucosylglycerol，GG)是由糖苷键将葡萄糖基和甘油连接而成的糖苷化合物，主要为α类和β类甘油葡糖苷，2αGG是α类甘油葡糖苷中的重要构型。德国BitopAG公司研究说明，2αGG是植物密罗木的主要活性成分，能保护植物结构，通过调节细胞内渗透压，减少水分流失到细胞外，具有保护细胞免受高渗、干旱等恶劣环境的破坏作用，因此2αGG是一种细胞激活剂。在化妆品中能够起到有效激活细胞并促进细胞再生、激活水通道蛋白AQP3和丝聚蛋白FLG，提高皮肤含水量，达到锁水保湿功能、增强角质细胞的抗氧化能力以及加快老化细胞中I型胶原蛋白前体合成的作用。[0003] 化妆品发挥实际宣称功效的关键前提在于功效原料是否能透皮吸收，化妆品的透皮吸收是指化妆品中的功能性成分有效性地作用于皮肤表面或进入表皮层或真皮层，并在该部位积聚和发挥作用的过程。因此，甘油葡糖苷在皮肤中能否发挥出实际效果取决于甘油葡糖苷渗透皮肤的效果。[0004] 而目前，检测渗透效率主要采用动物皮进行检测，方法仍存在着以下缺陷：(1)动物和人存在种属间差异；(2)对实验动物种类、品系、质量和动物试验环境要求严格，成本高、试验周期长；(3)观察指标主要为表观的定性判别，难以量化；(4)牺牲大量实验动物为代价，不符合减少(Reduction)、替代(Replacement)、优化(Refinement)原则，简称3R原则。[0005] 因此，现有技术还有待于改进和发展。发明内容[0006] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于人工皮肤模型检测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，旨在解决现有技术检测甘油葡糖苷皮肤渗透效率以动物皮检测为主，存在种属间差异大，需要以牺牲大量实验动物为代价的问题。[0007] 本发明的技术方案如下：[0008] 本发明提供一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，其特征在于，包括步骤：[0009] 提供一种人工皮肤模型和含有培养液的培养器皿；[0010] 将所述人工皮肤模型设置在所述培养液的上方，且所述人工皮肤模型与所述培养液不接触；[0011] 将甘油葡糖苷溶液涂抹在所述人工皮肤模型表面；[0012] 将涂抹过甘油葡糖苷溶液的人工皮肤模型和所述培养器皿置于CO2培养箱中孵育预定时间；[0013] 对孵育不同时间段的人工皮肤模型的组织样本进行冰冻切片后用荧光显微镜拍照，观测甘油葡糖苷溶液在不同时间段渗透到皮肤层的位置；[0014] 取已知浓度的甘油葡糖苷溶液进行倍比稀释，对稀释后的甘油葡糖苷溶液进行荧光强度检测，绘制得到甘油葡糖苷的标准曲线；[0015] 取所述孵育预定时间的培养液进行荧光强度检测，得到培养液的荧光强度值；[0016] 根据所述甘油葡糖苷的标准曲线和所述培养液的荧光强度值计算甘油葡糖苷的渗透浓度；[0017] 根据所述甘油葡糖苷溶液渗透到皮肤层的位置和所述甘油葡糖苷的渗透浓度评价皮肤渗透效率。[0018] 优选地，所述人工皮肤模型为3D表皮模型EpiKutis。[0019] 优选地，所述甘油葡糖苷溶液中甘油葡糖苷的有效质量浓度为1‑40％。[0020] 优选地，所述孵育预定时间为0.1‑10小时。[0021] 优选地，所述CO2培养箱的温度为30‑40℃，所述CO2培养箱的CO2浓度为3‑10％。[0022] 优选地，所述冰冻切片的步骤包括：向所述组织样本中加入4％多聚甲醛固定24小时，再经蔗糖脱水24小时，然后进行OCT包埋，最后用冰冻切片机进行切片。[0023] 优选地，所述取所述孵育预定时间的培养液进行荧光强度检测的步骤包括：取所述孵育预定时间的培养液置于4℃保存24小时后，用荧光酶标仪检测培养液的荧光强度值。[0024] 有益效果：现有技术通常采用活体动物表皮来对甘油葡糖苷的皮肤渗透效率进行检测，这种测试方式存在较多缺陷：首先动物和人的皮肤存在种属间差异，采用动物表皮进行测试得到的结果不精确；其次，对实验动物种类、品系、质量和动物试验环境要求严格，成本高、试验周期长；再者，观察指标主要为表观的定性判别，难以量化；最后，牺牲大量实验动物为代价，不符合减少、替代、优化原则。基于此，本发明提供了基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，由于人工皮肤模型具有与正常人类皮肤相似的结构和功能，不存在种属差异，基于人工皮肤模型进行甘油葡糖苷的皮肤渗透效率检测，测试结果为甘油葡糖苷实际应用提供的可参考性更强、准确度更高；本发明以人工皮肤模型替代动物表皮，还能够避免大量实验动物的牺牲，同时降低了实验成本；进一步地，本发明通过荧光显微镜拍照可清晰地观测甘油葡糖苷溶液渗透行为到达的皮肤层位置，同时通过检测甘油葡糖苷的渗透浓度可反映出甘油葡糖苷溶液在人工皮肤模型上的透过量，渗透浓度越高，皮肤渗透效率越好，根据甘油葡糖苷溶液渗透到皮肤层的位置和渗透浓度综合评价皮肤渗透效率，可更加全面地反映甘油葡糖苷皮肤渗透效果，提升皮肤渗透效率检测结果在实际应用中的价值。附图说明[0025] 图1为本发明实施例1中2αGG的标准曲线。[0026] 图2为本发明实施例1中人工皮肤模型涂抹2αGG后不同时间荧光拍照检测结果。[0027] 图3为本发明对比例中酪氨酸酶抑制效果比较。[0028] 图4为本发明对比例中实验组和空白组各指标增长比率。[0029] 图5为本发明对比例中受试者使用3％2αGG前后脸部红色特征对比图。[0030] 图6为本发明对比例中受试者使用3％2αGG前后脸部皱纹对比图[0031] 图7为本发明对比例中皮肤屏障组SCH值实验结果比较。[0032] 图8为本发明对比例中皮肤屏障组TEWL值实验结果比较。具体实施方式[0033] 本发明提供了一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0034] 目前，由于在化妆品检测方面的研究多集中于产品功效和安全性，关于甘油葡糖苷能否透皮吸收以及甘油葡糖苷的皮肤渗透效率的研究较少，且关于渗透效率的检测多采用动物皮进行检测。但由于动物和人存在种属间差异，因此，测试结果与甘油葡糖苷在实际应用中的效果差异较大。并且，现有技术以牺牲大量实验动物为代价，实验成本高，也不符合人道主义原则。[0035] 基于此，本发明提供了一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，包括步骤：[0036] S1、提供一种人工皮肤模型和含有培养液的培养器皿；[0037] S2、将所述人工皮肤模型设置在所述培养液的上方，且所述人工皮肤模型与所述培养液不接触；[0038] S3、将甘油葡糖苷溶液涂抹在所述人工皮肤模型表面；[0039] S4、将涂抹过甘油葡糖苷溶液的人工皮肤模型和所述培养器皿置于CO2培养箱中孵育预定时间；[0040] S5、对孵育不同时间段的人工皮肤模型的组织样本进行冰冻切片后用荧光显微镜拍照，观测甘油葡糖苷溶液在不同时间段渗透到皮肤层的位置；[0041] S6、取已知浓度的甘油葡糖苷溶液进行倍比稀释，对稀释后的甘油葡糖苷溶液进行荧光强度检测，绘制得到甘油葡糖苷的标准曲线；[0042] S7、取所述孵育预定时间的培养液进行荧光强度检测，得到培养液的荧光强度值；[0043] S8、根据所述甘油葡糖苷的标准曲线和所述培养液的荧光强度值计算甘油葡糖苷的渗透浓度；[0044] S9、根据所述甘油葡糖苷溶液渗透到皮肤层的位置和所述甘油葡糖苷的渗透浓度评价皮肤渗透效率。[0045] 本发明提供的检测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，以人工皮肤模型为基础，具有与正常人类皮肤相似的结构和功能，不存在种属差异，测试结果为化妆品原料实际应用提供的可参考性更强、准确度更高，以人工皮肤模型替代动物表皮，避免了大量实验动物的牺牲，同时降低了实验成本。该方法通过荧光显微镜拍照可清晰地观测甘油葡糖苷溶液渗透行为到达的皮肤层位置，同时通过检测甘油葡糖苷的渗透浓度反映出甘油葡糖苷溶液在人工皮肤模型上的透过量，渗透浓度越高，皮肤渗透效率越好。[0046] 在一些实施例中，步骤S1所述培养器皿可以选择为常用多孔培养板。[0047] 在一些实施例中，步骤S1所述人工皮肤模型为3D表皮模型EpiKutis。该人工皮肤模型以正常人的角质形成细胞为种子细胞，在体外发育成复层化结构的表皮模型。在组织学结构上与人皮肤结构高度相似，皮肤模型的质量较好，实验结果的准确性和可重复性较高。[0048] 在一些实施例中，步骤S2所述人工皮肤模型通过支架设置在培养液上方，所述人工模型表面通常低于所述培养器皿皿口。[0049] 在一些实施例中，步骤S3所述甘油葡糖苷溶液中甘油葡糖苷的有效质量浓度为1‑40％，进一步优选为为1‑10％，更进一步优选为3％。[0050] 在一些实施例中，步骤S4所述孵育预定时间为0.1‑10小时。[0051] 在一些实施例中，步骤S4所述CO2培养箱的温度为30‑40℃，CO2浓度为3‑10％。[0052] 在一些实施例中，所述步骤S5包括步骤：[0053] S51、向所述组织样本中加入4％多聚甲醛固定24小时，再经蔗糖脱水24小时，然后进行OCT包埋，最后用冰冻切片机进行切片。[0054] 步骤S6中，取已知浓度的甘油葡糖苷溶液进行倍比稀释，对稀释后的甘油葡糖苷溶液进行荧光强度检测，将甘油葡萄糖苷溶液的浓度与荧光强度值对应，绘制出甘油葡糖苷的标准曲线。[0055] 在一些实施例中，步骤S7所述进行荧光强度检测的步骤包括：取所述孵育预定时间的培养液置于4℃保存24小时后，用荧光酶标仪检测培养液的荧光强度值。具体地，将孵育预定时间后的培养液取出，置于EP管内，将EP管置于4℃的冰箱内保存24小时后，利用荧光酶标仪检测培养液的荧光强度值。[0056] 步骤S8中，根据所述甘油葡糖苷的标准曲线和所述培养液的荧光强度值计算甘油葡糖苷的渗透浓度。[0057] 进一步地，在一些实施例中，单独设置将PBS缓冲液涂抹在人工皮肤模型表面的对照组，计算得到对照组的渗透浓度，再将甘油葡糖苷溶液的渗透浓度减去相应对照组的渗透浓度计算得到绝对渗透浓度。绝对渗透浓度可更加准确的表现出甘油葡糖苷溶液的皮肤渗透效率。更进一步地，可以通过设置多组平行实验，通过计算渗透浓度的平均值来减少误差。[0058] 步骤S9中，根据荧光显微镜对冰冻切片拍照得到的图像，可以清晰地看到甘油葡糖苷溶液渗透行为到达的位置，以及渗透行为到达的皮层，例如基底层、棘层、颗粒层、角质层和真皮层，甘油葡糖苷溶液渗透行为到达的位置与人工皮肤模型表面的距离越大，皮肤渗透效率越高。优选地，在渗透行为穿过角质层到达真皮层上层时，皮肤渗透效果较好。甘油葡糖苷的渗透浓度可反映出甘油葡糖苷溶液在人工皮肤模型上的透过量，渗透浓度越高，皮肤渗透效率越好。根据所述甘油葡糖苷溶液渗透到皮肤层的位置和所述甘油葡糖苷的渗透浓度综合评价皮肤渗透效率，可更加全面地反映甘油葡糖苷皮肤渗透效果，提升皮肤渗透效率检测结果在实际应用中的价值。[0059] 下面通过具体的实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。[0060] 实施例1[0061] 将3D表皮模型Epikutis转移到6孔板中，在6孔板上标注测试组编号，在6孔板中每个孔内提前添加有培养液，每个3D表皮模型Epikutis通过支架设置在培养液上方。[0062] 取配置好的3％2αGG溶液25μL涂抹在每个模型表面，使2αGG溶液均匀分布于模型表面，然后将6孔板置于CO2培养箱(37℃、5％CO2)中，分别孵育1h和8h，标记为2αGG‑1h和2αGG‑8h，每组设置三次重复。同时，取PBS缓冲液涂抹在模型表面作为对照组(BC)，标记为BC‑1h和BC‑8h。[0063] 给药孵育结束后，收集培养液于EP管中，收集完后将用于渗透量检测的样品置于4℃冰箱保存，第二天用荧光酶标仪检测荧光强度。[0064] 用2αGG倍比稀释作为相应的标曲(如图1所示)，根据荧光酶标仪检测的荧光值，利用标曲计算相应的2αGG的浓度作为渗透浓度，计算三次重复的渗透浓度的平均值，并计算绝对渗透浓度平均值，渗透量检测结果如表1所示。[0065] 表1渗透浓度结果汇总表[0066][0067] 结果表明，与BC组相比，2αGG作用1h后，绝对渗透浓度为0.546μg/mL；2αGG作用8h后，绝对渗透2αGG浓度为17.757μg/mL，说明2αGG溶液在作用8h后，皮肤渗透效果较好。[0068] 收集给药孵育结束后的3D皮肤模型于EP管中，每管加入1mL4％多聚甲醛固定24h，蔗糖脱水24h；随后直接OCT包埋，冰冻切片机进行切片，冰冻切片后荧光显微镜拍照(如图2所示)。从图2中可以看出，3％2αGG作用1h后，渗透行为只能到达至角质层；样品作用8h后，渗透行为已到达至整个表皮层，可达至真皮层上层，表明2αGG溶液在作用8h后，皮肤渗透效果较好。[0069] 综上，基于3D表皮模型 的皮肤渗透检测结果显示，2αGG作用1h后，渗透行为只能到达至角质层，绝对渗透浓度为0.546μg/mL；2αGG作用8h后，渗透行为已到达至整个表皮层，绝对渗透2αGG浓度为17.75μg/mL，说明2αGG具有较强的渗透能力，且随着时间的增加绝对渗透浓度随之增加。[0070] 对比例[0071] 酪氨酸酶抑制实验：[0072] 设立样品管(T)、样品本底(T0)、酶反应管(C)和溶剂本底(C0)，以2αGG和曲酸每一样品的每个受试浓度的样品管(T)需设立3支平行管。在所有反应管中各加入100μL酪氨酸酶溶液，在样品管(T)和样品本底(T0)中各加入75μL相同浓度的样品溶液，再用PBS(pH＝6.5)补足250μL体积，混匀，置37℃水浴槽孵育10min。依次在各管中加入250μL0.2mg/mL的酪氨酸溶液，置37℃水浴槽孵育20min，即刻将各管反应溶液移入微量比色皿中，在475nm处测定吸光值。[0073] 图3为酪氨酸酶抑制效果比较，由图3可知，2αGG具有酪氨酸酶抑制作用，说明2αGG具有美白效果。[0074] 人体功效实验[0075] (1)测试方法：以含3％2αGG和不含2αGG的化妆水进行测试，设置实验组和空白组，每组15人，连续使用产品28天，采用VISIA‑CR和功效测试探头测试角质层含水量、经皮水分含量、皮下0.5mm含水量、皮肤弹性等指标，评价2αGG的功效。[0076] ①(空白组)0％2αGG：水、对羟基苯乙酮、己二醇、丙烯酸(酯)类/C10‑30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、三乙醇胺、EDTA二钠、(日用)香精。[0077] ②(实验组)3％2αGG：水、甘油葡糖苷、对羟基苯乙酮、己二醇、丙烯酸(酯)类/C10‑30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、三乙醇胺、EDTA二钠、(日用)香精。[0078] (2)皮肤屏障修复：用SDS溶液敷于手臂2h后造成皮肤损伤模型，实验组对受试区涂抹3％2αGG，对照组不涂抹作为空白区，分别于0，30min，60min，90min，120min测试受试区和空白区的皮肤角质层含水量和经皮水分流失值(TEWL)。[0079] 图4为受试者使用28天后平均值的弹性值增长率、经皮水分流失值增长率、皮下0.5mm水含量增长率、角质层水分含量增长率柱状图，可以直观的看到0％2αGG、3％2αGG两个样品的增长率对比。进一步地，对上述结果进行统计学分析，结果如表2所示。[0080] 表2统计学分析结果[0081][0082][0083] 结果表明，在使用3％2αGG21D后的皮肤弹性值和在使用3％2αGG14D后、21D后、28D后的角质层水含量、皮下0.5mm含水量和经皮水分流失量分别比对使用前均具有显著性差异，则使用3％2αGG精华14天后有提高真皮层和表皮层水分的功效，使用21天后有提高皮肤弹性值功效，降低经皮水分流失量。[0084] 从Visia‑CR拍摄图对比分析，图5为受试者使用3％2αGG前后脸部红色特征对比图，图6为受试者使用3％2αGG前后脸部皱纹对比图。结果表明，受试者使用产品后脸部红色特征下降37.8％，脸部皱纹减少31.9％，说明2αGG产品具有一定程度消炎修复，抗衰功效。[0085] 从皮肤屏障修复实验中，图7为皮肤屏障组实验SCH值结果比较，图8为皮肤屏障组实验TEWL值结果比较，由此可知涂抹3％2αGG产品后，相对空白组，皮肤含水量上升，皮肤经皮水分流失值下降，即单位面积的皮肤上，水分散失量减少，起到皮肤屏障效果。[0086] 从对比例中可知，2αGG具有较好的保湿和抗衰的作用，说明2αGG在人体皮肤上可以发挥出保湿、消炎以及抗衰的功效，进而可以说明2αGG已经有效渗透到皮肤中，渗透率较高，可渗透整个表皮层到达真皮层，人体评价效果与体外评价效果相一致。[0087] 综上所述，本发明公开的一种基于人工皮肤模型测甘油葡糖苷皮肤渗透效率的方法，以人工皮肤模型为基础，具有与正常人类皮肤相似的结构和功能，不存在种属差异，测试结果为甘油葡糖苷实际应用提供的可参考性更强、准确度更高，以人工皮肤模型替代动物表皮，避免了大量实验动物的牺牲，同时降低了实验成本。并且，该方法根据荧光显微镜对冰冻切片拍照得到的图像，可以清晰地观测到甘油葡糖苷溶液渗透行为到达的皮肤层位置，通过检测甘油葡糖苷的渗透浓度可反映出甘油葡糖苷溶液在人工皮肤模型上的透过量，渗透浓度越高，皮肤渗透效率越好，根据甘油葡糖苷溶液渗透到皮肤层的位置和甘油葡糖苷的渗透浓度综合评价皮肤渗透效率，可更加全面地反映甘油葡糖苷皮肤渗透效果，提升皮肤渗透效率检测结果在实际应用中的价值。[0088] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

专利地区：广东

专利申请日期：2021-11-12

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN114034608B