SARS-CoV-2全长cDNA克隆单拷贝质粒及其构建方法

专利名称：SARS-CoV-2全长cDNA克隆单拷贝质粒及其构建方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111217163.1

专利申请（专利权）人：武汉生物制品研究所有限责任公司
权利人地址：湖北省武汉市江夏区郑店镇黄金工业园路1号

专利发明（设计）人：申硕,钱莎莎,安欢欢,田宇璇,周金戈,于代冠

专利摘要：本发明涉及一种SARS‑CoV‑2全长cDNA克隆单拷贝质粒及其构建方法，具体的，结合In‑Fusion和Gibson Assembly无缝克隆对SARS‑CoV‑2基因组进行全长cDNA合成和克隆。构建了基于BAC载体的复制稳定且分子量更小的单拷贝质粒pBac‑mini(早期曾命名为pY1B，现统一命名为pBacm)，并将SARS‑CoV‑2全长cDNA克隆至该载体，构建重组单拷贝质粒pBacm‑SARS‑CoV‑2,利用Recombineering技术对全长cDNA进行有益的碱基改造及基因敲除等遗传工程改造。

主权利要求：
1.一种SARS‑CoV‑2疫苗株的全长cDNA克隆单拷贝质粒pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t，其核苷酸序列为SEQIDNO.1；其中，pBacm载体序列如SEQIDNO.3所示；
SARS‑CoV‑2的序列如SEQIDNO.2所示。
2.如权利要求1所述的质粒pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t的构建方法，包括以下步骤：(1)pBacm载体构建及两侧添加酶切位点的改造；
(2)构建含有正反向筛选标记的工具质粒pBacm‑SacB‑Kan和pBacm‑SacB‑Amp；
(3)构建SARS‑CoV‑2疫苗株全长cDNA单拷贝质粒；
(4)将SARS‑CoV‑2全长基因组序列与单拷贝载体pBacm连接，得到pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)质粒；
(5)修复pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)重组质粒中位点多余的GC碱基，同时将T7启动子序列和T7终止子序列克隆至此单拷贝载体中，获得目标载体pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(1)的具体步骤包含：
1)以pBacm质粒为模板，通过PCR背向扩增质粒大环，在扩增产物的5’端和3’末端分别引入NotI和AscI酶切位点；
2)以pY44质粒为模板，通过PCR扩增卡纳抗生素基因(Kan)，在扩增产物的5’端和3’末端分别引入限制性内切酶AscI和NotI酶切位点；
3)将1)和2)中的PCR产物纯化后均用AscI和NotI酶切，再用T4DNA连接酶将二者连接，由此得到pBacm‑AscI‑Kan‑NotI质粒。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)的具体步骤包含：
1)以pK18mob‑SacB质粒为模板，设计引物扩增蔗糖致死基因SacB，扩增引物5’端和3’末端分别含有AscI和NotI酶切位点；
2)将1)中的SacB基因PCR产物纯化后，用AscI和NotI酶切；
3)将构建的pBacm‑AscI‑Kan‑NotI质粒用AscI和NotI酶切；
4)将2)和3)中的酶切产物纯化后，用T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pBacm‑SacB；
5)分别以pY44和pBR322质粒为模板，设计引物扩增Kan和氨苄抗生素基因，扩增引物5’端和3’末端分别含有与pBacm‑SacB中SacB基因末端两侧同源的50bp序列；
6)将5)中的抗性基因PCR产物纯化后，将Kan或者Amp基因分别插入到pBacm‑SacB载体，得到重组质粒pBacm‑SacB‑Kan和pBacm‑SacB‑Amp。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)的具体步骤包含：
1)提取SARS‑CoV‑2灭活疫苗株RNA并反转录成cDNA；
2)以上述cDNA为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得SARS‑CoV‑2灭活疫苗株的17个基因片段，其中，每个基因片段之间含有15bp的同源序列；此外，将8791和12655位点T分别同义突变成C，引入了两个BglI内切酶序列，作为遗传标记，以与野生型病毒作为区别；
3)将2)中基因片段以每5kb长度为单位分别连接至经KpnI和HindIII酶切的pUC19载体，得到6个重组质粒；
4)以上述6个重组质粒为模板，设计引物分别进行PCR扩增；
5)将4)中6段基因组片段分3次逐步连接至线性化pBR322载体，每次连接10kb，分别得到含有SARS‑CoV‑210kb、20kb和全长30kb的重组质粒。 说明书 : SARS‑CoV‑2全长cDNA克隆单拷贝质粒及其构建方法技术领域[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种SARS‑CoV‑2全长cDNA克隆单拷贝质粒及其构建方法。背景技术[0002] 目前，新冠肺炎[1]已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并按照甲类传染病管理，其具有传染性强、潜伏期长、传播途径复杂等特点，感染患者的临床[2]病征表现为发烧、呼吸道症状、严重的呼吸系统疾病和肺炎 。[0003] SARS‑CoV‑2是单股正链RNA病毒，基因组长度约为29.8kb，拥有已知RNA病毒中最大的基因组。SARS‑CoV‑2基因组结构遵循冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)已知的特定基因特征，5’端具有帽子结构，3’端具有多聚腺苷酸尾巴。SARS‑CoV‑2基因组含有10个开放阅读[3]框(Openingreadingframe,ORF)，可能共编码至少29种蛋白质 。位于基因组5’端且超过三分之二的区域为ORF1和ORF1b，翻译生成两条大的重叠多聚蛋白pp1a和pp1ab，后者通过‑1位核糖体移码机制进行翻译，并由病毒编码的蛋白酶(Mainprotease和Papain‑likeprotease)剪切加工生成16个非结构蛋白(分别命名为NSP1～NSP16)，组装释放复制‑转录[4]复合体 。位于基因组3’端的三分之一区域编码4种病毒结构蛋白，包括刺突糖蛋白(Spikeglycoprotein,S)、包膜蛋白(Envelopeprotein,E)、膜蛋白(Membraneprotein,M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,N)。此外，SARS‑CoV‑2基因组3’端还编码每个CoV特有的至少6‑9种属特异性辅助蛋白，分别为ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF9b和ORF10，由3’端[5]一系列亚基因组mRNAs(SubgenomicmRNAs,sgmRNAs)表达 。其中一些辅助蛋白装配于病[6]毒颗粒，如3a在SARS‑CoV被发现为结构蛋白 ,3a在SARS‑CoV‑2的分子数，与分子数丰度最[7]高的结构蛋白M相当 。[0004] 由于冠状病毒基因组是RNA病毒中已知最大的基因组，且其携带的复制酶基因以cDNA克隆形式在细菌中增殖时存在不稳定性，加上体外合成大基因组全长cDNA难度大，这[8]些使得冠状病毒全长感染性cDNA的构建受到了极大的阻碍 。为了克服这些困难，目前已建立三种不同于传统途径的创新性研究方法来建立冠状病毒的反向遗传学系统，包括细菌[9]人工染色体(bacterialartificialchromosomes,BACs)的使用 、cDNA片段的体外连[10] [11]接 和以痘病毒为载体来进行冠状病毒全长cDNA的增殖 。[0005] SARS‑CoV‑2病毒出现并引起COVID‑19疫情后，在世界各国和地区传播中，持续出现各种变异株。其中一些变异株的传播性、致病力增强并发生免疫逃逸突变，被世界卫生组织定义为需密切关注的变异株(Variantsofconcern,VOC)。研究VOC病毒株的突变基因及基因产物的功能、传播性、致病性和免疫逃逸的分子机理，对抗病毒药物靶点的发现，针对免疫逃逸株的抗体药物及疫苗的设计和研发提供理论基础。反向遗传学技术平台对基础研究和应用研究发挥着不可替代的作用，也是研究新发冠状病毒烈性传染病病原体SARS‑CoV、MERS‑CoV和SARS‑CoV‑2的基础工具，且已有大量文献发表。如发现减毒基因，构建基于传播性较弱的原型株骨架且进一步减毒的病毒，对刺突蛋白S进行改造，可以为灭活疫苗生产提供安全毒株，减轻对灭活疫苗生产人员和环境的安全风险，又是针对免疫逃逸株的新一代疫苗。[0006] 为更好的研究SARS‑CoV‑2基因组的结构与功能以及更好的应对目前不断出现的多种变异株，与传统酶切连接方式不同的方法，本发明采用BAC载体和同源重组无缝克隆方[12]法(结合In‑Fusion、GibsonAssembly和Recombineering 三种技术)，快速构建了SARS‑CoV‑2的全长cDNA克隆质粒。这为后续SARS‑CoV‑2的研究及其他冠状病毒等大基因组的全长cDNA克隆的构建提供了全新的思路。[0007] 参考文献：[0008] 1.SunP,LuX,XuC,etal.UnderstandingofCOVID‑19basedoncurrentevidence[J].JMedVirol.2020；92(6):548‑551.[0009] 2.JinY,YangH,JiW,etal.Virology,epidemiology,pathogenesis,andcontrolofCOVID‑19[J].Viruses.2020；12(4):372.[0010] 3.AlmazánF,DediegoML,GalánC,etal.ConstructionofasevereacuterespiratorysyndromecoronavirusinfectiouscDNAcloneandareplicontostudycoronavirusRNAsynthesis[J].JVirol.2006；80(21):10900‑10906.[0011] 4.KhailanyRA,SafdarM,OzaslanM.GenomiccharacterizationofanovelSARS‑CoV‑2[J].GeneRep.2020；19:100682.[0012] 5.KirtipalN,BharadwajS,KangSG.FromSARStoSARS‑CoV‑2,insightsonstructure,pathogenicityandimmunityaspectsofpandemichumancoronaviruses[J].InfectGenetEvol.2020；85:104502.[0013] 6.ShenS,LinPS,ChaoYC,etal.Thesevereacuterespiratorysyndromecoronavirus3aisanovelstructuralprotein[J].BiochemBiophysResCommun.2005；330(1):286‑292.[0014] 7.Zhang XY,GuoJ,Wan X,et al.Biochemicalandantigeniccharacterizationofthestructuralproteinsandtheirpost‑translationalmodificationsinpurifiedSARS‑CoV‑2virionsofaninactivatedvaccinecandidate[J].EmergMicrobesInfect.2020；9(1):2653‑2662.[0015] 8.AlmazánF,SolaI, S,etal.Coronavirusreversegeneticsystems:infectiousclonesandreplicons[J].VirusRes.2014；189:262‑270.[0016] 9.AlmazánF,GonzálezJM,PénzesZ,etal.EngineeringthelargestRNAvirusgenomeasaninfectiousbacterialartificialchromosome[J].ProcNatlAcadSciUSA.2000；97(10):5516‑5521.[0017] 10.BaricRS,YountB.Subgenomicnegative‑strandRNAfunctionduringmousehepatitisvirusinfection[J].JVirol.2000；74(9):4039‑4046.[0018] 11.ThielV,HeroldJ,SchelleB,etal.InfectiousRNAtranscribedinvitrofromacDNAcopyofthehumancoronavirusgenomeclonedinvacciniavirus[J].JGenVirol.2001；82(6):1273‑1281.[0019] 12.YuD,EllisHM,LeeEC,etal.AnefficientrecombinationsystemforchromosomeengineeringinEscherichiacoli[J].ProcNatlAcadSciUSA.2000；97(11):5978‑5983.发明内容[0020] 本发明首先涉及一种SARS‑CoV‑2疫苗株的全长cDNA克隆单拷贝质粒pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t，其大小约36.4kb，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其中，SARS‑CoV‑2的序列如SEQIDNO.2所示，pBacm载体序列如SEQIDNO.3所示。[0021] 本发明还涉及所述的pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t质粒的构建方法，包括以下步骤：[0022] (1)pBacm载体构建及两侧添加酶切位点的改造；[0023] (2)构建含有正反向筛选标记的工具质粒pBacm‑SacB‑Kan和pBacm‑SacB‑Amp；[0024] (3)构建SARS‑CoV‑2疫苗株全长cDNA单拷贝质粒；[0025] (4)将SARS‑CoV‑2全长基因组序列与单拷贝载体pBacm连接，得到pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)质粒；[0026] (5)修复pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)重组质粒中位点多余的GC碱基，同时将T7启动子序列和T7终止子序列克隆至此单拷贝载体中，获得目标载体pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t。[0027] 所述的步骤(1)的具体步骤包含：[0028] 1)以pBacm质粒为模板，通过PCR背向扩增质粒大环，在扩增产物的5’端和3’末端分别引入NotI和AscI酶切位点；[0029] 2)以pY44质粒为模板，通过PCR扩增卡纳抗生素基因(Kan)，在扩增产物的5’端和3’末端分别引入限制性内切酶AscI和NotI酶切位点；[0030] 3)将1)和2)中的PCR产物纯化后均用AscI和NotI酶切，再用T4DNA连接酶将二者连接，由此得到pBacm‑AscI‑Kan‑NotI质粒。[0031] 所述的步骤(2)的具体步骤包含：[0032] 1)以pK18mob‑SacB质粒为模板，设计引物扩增蔗糖致死基因SacB，扩增引物5’端和3’末端分别含有AscI和NotI酶切位点；[0033] 2)将上述SacB基因PCR产物纯化后，用AscI和NotI酶切；[0034] 3)将构建的pBacm‑AscI‑Kan‑NotI质粒用AscI和NotI酶切；[0035] 4)将2)和3)中的酶切产物纯化后，用T4DNA连接酶进行连接，即可得到重组质粒pBacm‑SacB；[0036] 5)分别以pY44和pBR322质粒为模板，设计引物扩增Kan和氨苄抗生素(Amp)基因，扩增引物5’端和3’末端分别含有与pBacm‑SacB中SacB基因末端两侧同源的50bp序列；[0037] 6)将5)中的抗性基因PCR产物纯化后，将Kan或者Amp基因分别插入到pBacm‑SacB载体，得到重组质粒pBacm‑SacB‑Kan和pBacm‑SacB‑Amp。[0038] 所述的步骤(3)的具体步骤包含：[0039] 1)提取SARS‑CoV‑2灭活疫苗株RNA并反转录成cDNA；[0040] 2)以上述cDNA为模板，设计引物分别进行PCR扩增，获得SARS‑CoV‑2灭活疫苗株的17个基因片段，其中，每个基因片段之间含有15bp的同源序列；此外，将8791和12655位点T分别同义突变成C，引入了两个BglI内切酶序列，作为遗传标记；[0041] 3)将2)中基因片段以每5kb长度为单位分别连接至经KpnI和HindIII酶切的pUC19载体，得到6个重组质粒；[0042] 4)以上述6个重组质粒为模板，设计引物分别进行PCR扩增，得到每段长度约5kb的6段SARS‑CoV‑2基因组片段；[0043] 5)将4)中6段基因片段分3次逐步连接至线性化pBR322载体，每次连接10kb，分别得到含有SARS‑CoV‑210kb、20kb和全长30kb的重组质粒。[0044] 本发明的有益效果：[0045] 本发明针对SARS‑CoV‑2灭活疫苗株采用基于最小单拷贝质粒pBacm和同源重组无缝克隆(In‑Fusion、GibsonAssembly)以及Recombineering基因编辑的方法，快速、便捷获得SARS‑CoV‑2疫苗株的全长cDNA克隆质粒pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t。基于该方法构建的SARS‑CoV‑2全长cDNA克隆质粒可应用于深入研究SARS‑CoV‑2的遗传变异以及毒力基因、病毒感染与致病机制，也可为疫苗开发提供有力的技术平台。该方法同样适用于SARS‑CoV‑2复制子质粒的构建，用于抗病毒药物筛选与新型冠状病毒基因组功能研究。这也可广泛应用于其他小基因组RNA病毒如肠道病毒、麻疹病毒等病毒的cDNA构建工作。本发明具有以下优点:[0046] 首先，对pBeloBAC11质粒(～7.5kb，是目前公认的分子量最小的BAC载体)进行改造，在不影响载体功能的前提下删除了冗余序列，使其成为分子量更小的单拷贝质粒pBacm(～6.4kb)，易于进行PCR扩增等分子生物学操作。[0047] 其次，将SARS‑CoV‑2全长cDNA连接于pBacm单拷贝质粒，病毒大基因组序列可以保持稳定不易突变，而且以环状结构存在于细菌体内，转化效率高，易于分辨和分离纯化。[0048] 再次，可对pBacm质粒进一步修饰，如加入单一酶切位点(如AscI和NotI)，方便病毒全长cDNA从单拷贝质粒穿梭至低拷贝(如pBR22)或多拷贝质粒，便于后续质粒的大量生产和提取。[0049] 最后，利用Recombineering技术可以快速便捷地对pBacm单拷贝质粒上的SARS‑CoV‑2全长cDNA进行基因或碱基的编辑，如任何基因和碱基的敲除与敲入等，从而可以研究病毒的基因功能，例如含有报告基因的SARS‑CoV‑2复制子和类似病毒性载体的构建等，基于减毒株骨架的灭活疫苗株的构建以及基于病毒性载体的重组蛋白及病毒样颗粒疫苗的研究。。附图说明[0050] 图1、分子量更小的pBacm单拷贝质粒构建策略示意图。[0051] 图2、含单一酶切位点的pBacm单拷贝质粒改造策略示意图。[0052] 图3、pBacm‑SacB‑Kan/Amp单拷贝质粒构建策略示意图。[0053] 图4、SARS‑CoV‑2全长cDNA克隆构建策略示意图。[0054] 图5、InFusion(A)和GibsonAssembly(B)连接示意图(分别以第一个5kb连接和第一个10kb连接为例)。[0055] 图6、克隆于pBR322载体(A)和pBacm载体(B)的重组质粒及酶切鉴定电泳结果[0056] 图6A中：[0057] M：最左侧为DNAmarkerDL15000，最右侧为DNAmarkerDL5000。[0058] 1：pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(1‑9975)重组质粒。[0059] 2：pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(1‑9975)重组质粒经AscⅠ和NotⅠ酶切后产物。[0060] 3：pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(1‑19975&1GC)重组质粒。[0061] 4：pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(1‑19975&1GC)重组质粒经AscⅠ和NotⅠ酶切后产物。[0062] 5：pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)重组质粒。[0063] 6：pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)重组质粒经AscⅠ和NotⅠ酶切后产物。[0064] 图6B中：[0065] M:DNAmarkerDL15000。[0066] 1:pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)重组质粒。[0067] 2:pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)经AscⅠ和NotⅠ酶切后产物。[0068] 图7、SARS‑CoV‑2全长cDNA9975nt(A)和19975nt(B)修复测序结果[0069] 7A和7B图中第一行基因序列分别为以SARS‑CoV‑2疫苗株cDNA为模板扩增的SARS‑CoV‑2基因组9967‑9984nt和19965‑19982nt，第二行基因序列分别为pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)重组质粒中的SARS‑CoV‑2基因组9967‑9986nt和19965‑19984nt，第三行基因序列分别为pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t重组质粒中的SARS‑CoV‑2基因组9967‑9984nt和19965‑19982nt。[0070] 图8、pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t重组质粒中的SARS‑CoV‑2基因组8791nt和12655nt处BglI酶切位点(遗传标记)验证电泳结果，图中：[0071] M:DNAmarkerDL5000。[0072] 1：以pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t为模板扩增SARS‑CoV‑2的7945‑9655片段。[0073] 2：1的PCR片段经BglⅠ酶切后结果。[0074] 3：以pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑FL‑T7t为模板扩增SARS‑CoV‑2的11419‑13298片段。[0075] 4：2的PCR片段经BglⅠ酶切后结果。[0076] 5：以疫苗株cDNA为模板扩增的SARS‑CoV‑2的7945‑9655片段。[0077] 6：5的PCR片段经BglⅠ酶切后结果。[0078] 7：以疫苗株cDNA为模板扩增的SARS‑CoV‑2的11419‑13298片段。[0079] 8：7的PCR片段经BglⅠ酶切后结果。[0080] 图9、pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑T7t单拷贝质粒的完整结构示意图。具体实施方式[0081] 实施例1：分子量更小的单拷贝质粒pBacm的构建及含单一酶切位点的改造[0082] pBacm质粒构建策略如图1、2所示，具体步骤如下：[0083] (1)以pBeloBAC11质粒(购自BioVector质粒载体菌株细胞基因保藏中心)为模板，通过引物(SEQIDNO.4和NO.5)进行背向PCR扩增，产物序列如SEQIDNO.3所示，其5’端和3’端均含有PacI酶切位点。[0084] (2)将上述PCR产物纯化后用PacI酶切，再用T4DNA连接酶进行连接，得到pBacm质粒(～6.4kb)。[0085] (3)以pBacm质粒为模板，通过PCR引物(SEQIDNO.7和NO.8)背向扩增质粒大环，产物序列如SEQIDNO.6所示，其5’端和3’端分别含有NotI和AscI酶切位点。[0086] (4)以pY44质粒为模板，通过PCR引物(SEQIDNO.10和NO.11)扩增卡纳抗生素基因(Kan,SEQIDNO.9)，5’端和3’末端分别含有AscI和NotI酶切位点。[0087] (5)将(3)和(4)中的PCR产物纯化后同时用AscI和NotI酶切，再将二者连接，由此得到两端含有酶切位点的pBacm‑AscI‑Kan‑NotI质粒。[0088] 实施例2：筛选工具质粒pBacm‑SacB‑Kan/Amp的构建[0089] 质粒pBacm‑SacB‑Kan/Amp的构建策略如图3所示，具体步骤如下：[0090] (1)以pK18mob‑SacB质粒(购自BioVector质粒载体菌株细胞基因保藏中心)为模板，设计5’端和3’末端分别含有AscI和NotI酶切位点(SEQIDNO.13和NO.14)，扩增蔗糖致死基因SacB(SEQIDNO.12)。[0091] (2)将上述SacB基因PCR产物纯化后，用AscI和NotI酶切。[0092] (3)将构建的pBacm‑AscI‑Kan‑NotI质粒用AscI和NotI酶切。[0093] (4)将(2)和(3)中的酶切产物纯化后，用T4DNA连接酶进行连接，即可得到重组质粒pBacm‑SacB。[0094] (5)分别以pY44和pBR322质粒为模板，设计引物(Kan:SEQIDNO.16和NO.17；Amp:SEQIDNO.19和NO.20)扩增Kan(SEQIDNO.15)和氨苄抗生素(Amp,SEQIDNO.18)基因。[0095] (6)将清洁回收的Kan或者Amp抗性基因电击转化含有pBacm‑SacB质粒的DY380感[12]受态细胞。此过程需要涉及到含有重组质粒的DY380感受态细胞的制备 ，具体制备过程如下所示：[0096] (a)将构建的pBacm‑SacB质粒点击转化DY380感受态细胞，涂布于含有氯霉素(Chl)的LB固体平板，30℃倒置过夜培养。[0097] (b)挑选平板上的单个菌落置于含Chl的2mLLB液体培养基中，30℃摇床培养。[0098] (c)取200μL含有pBacm‑SacB质粒的DY380菌液转接至新鲜的11mLLB(Chl)液体培养基，30℃摇床培养。[0099] (d)待菌液OD＝0.6‑0.9时，放入旋转震荡水浴摇床中进行42℃诱导15min，然后迅速置于冰上并将冰盒放在摇床中旋转摇晃10min。[0100] (e)取出菌液，置于预冷的4℃离心机中进行离心，5500×g，8min。[0101] (f)弃去上清，将菌体沉淀用预冷的20mL无菌水涡旋洗涤，然后4℃5500×g离心8min，并重复该洗涤步骤1次。[0102] (g)用100μL无菌水重悬菌体，制备DY380电转感受态细胞。[0103] (h)将清洁回收的Kan或AmpPCR产物电击转化含有pBacm‑SacB质粒的DY380感受态细胞，涂布于含有Chl抗生素的LB固体平板，30℃倒置过夜培养。挑取阳性克隆进行菌落PCR并提取质粒，即可得到重组工具质粒pBacm‑SacB‑Kan和pBacm‑SacB‑Amp。[0104] 实施例3：SARS‑CoV‑2的cDNA的获取[0105] 以QIAampViralRNAMiniKit(购自QIAGEN公司)抽提武汉生物制品研究所研发TM的SARS‑CoV‑2灭活疫苗(可参见CN202010559132.3)原液的RNA，通过PrimeScript DoubleStrandcDNASynthesisKit(购自Takara公司)逆转录得到cDNA，以此作为后续全长PCR扩增的模板。[0106] 实施例4：SARS‑CoV‑2全长17个基因片段扩增[0107] 以实施例3中cDNA为模板，用Phusion酶(购自NEB公司)分别以引物对：[0108] A‑F：SEQIDNO.38和A‑R：SEQIDNO.39、[0109] B‑F：SEQIDNO.40和B‑R：SEQIDNO.41、[0110] C‑F：SEQIDNO.42和C‑R：SEQIDNO.43、[0111] D‑F：SEQIDNO.44和D‑R：SEQIDNO.45、[0112] E‑F：SEQIDNO.46和E‑R：SEQIDNO.47、[0113] F‑F：SEQIDNO.48和F‑R：SEQIDNO.49、[0114] G‑F：SEQIDNO.50和G‑R：SEQIDNO.51、[0115] H‑F：SEQIDNO.52和H‑R：SEQIDNO.53、[0116] I‑F：SEQIDNO.54和I‑R：SEQIDNO.55、[0117] J‑F：SEQIDNO.56和J‑R：SEQIDNO.57、[0118] K‑F：SEQIDNO.58和K‑R：SEQIDNO.59、[0119] L‑F：SEQIDNO.60和L‑R：SEQIDNO.61、[0120] M‑F：SEQIDNO.62和M‑R：SEQIDNO.63、[0121] N‑F：SEQIDNO.64和N‑R：SEQIDNO.65、[0122] O‑F：SEQIDNO.66和O‑R：SEQIDNO.67、[0123] P‑F：SEQIDNO.68和P‑R：SEQIDNO.69、[0124] Q‑F：SEQIDNO.70和Q‑R：SEQIDNO.71进行PCR扩增。[0125] 得到17个SARS‑CoV‑2基因组小片段，分别称为：[0126] 基因片段A：SEQIDNO.21、[0127] 基因片段B：SEQIDNO.22、[0128] 基因片段C：SEQIDNO.23、[0129] 基因片段D：SEQIDNO.24、[0130] 基因片段E：SEQIDNO.25、[0131] 基因片段F：SEQIDNO.26、[0132] 基因片段G：SEQIDNO.27、[0133] 基因片段H：SEQIDNO.28、[0134] 基因片段I：SEQIDNO.29、[0135] 基因片段J：SEQIDNO.30、[0136] 基因片段K：SEQIDNO.31、[0137] 基因片段L：SEQIDNO.32、[0138] 基因片段M：SEQIDNO.33、[0139] 基因片段N：SEQIDNO.34、[0140] 基因片段O：SEQIDNO.35、[0141] 基因片段P：SEQIDNO.36和基因片段Q：SEQIDNO.37。[0142] 其中基因片段A、D、H、J、M、P的5’端与经KpnⅠ和HindⅢ双酶切的pUC19载体3’端具有15bp的同源序列，基因片段C、G、I、L、O、Q的3’端与经KpnⅠ和HindⅢ双酶切的pUC19载体5’端具有15bp的同源序列。值得一提的是，为了区别于野生型SARS‑CoV‑2毒株，在全长8791和12655位点各引入了1个同义突变，分别生成了1个BglⅠ酶切位点，以此作为遗传标记，以便证实后续进行转染实验时拯救出的毒株是人工合成的，而不是野生毒株污染所致。BglⅠ酶切位点验证结果如图8所示。[0143] 实施例5：含有约5kbSARS‑CoV‑2基因片段重组质粒组的构建[0144] 用In‑FusionHDCloningkit(购自Takara公司)将实施例4中扩增得到的各段PCR产物以A+B+C、D+E+F+G、H+I、J+K+L、M+N+O和P+Q混合的方式，分别连接至经KpnⅠ和HindⅢ酶切的pUC19(～2.6kb)载体(50℃孵育15min)，如图5A所示。其中，各基因片段与载体连接时的摩尔浓度比为2：1。然后将In‑Fusion连接产物转化StellarCompetentCell(购自Takara公司)，挑取阳性克隆提取质粒，酶切验证正确的质粒送至上海生工生物有限公司测序。6个分别含有5kbSARS‑CoV‑2cDNA片段的重组质粒分别命名为pUC19‑I、pUC19‑Ⅱ、pUC19‑Ⅲ、pUC19‑Ⅳ、pUC19‑Ⅴ和pUC19‑Ⅵ。[0145] 实施例6：含有约30kb目的基因的重组质粒pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)的构建[0146] 将实施例5中的6个含有约5kbSARS‑CoV‑2cDNA片段的重组质粒作为模板，利用引物对[0147] Ⅰ‑F：SEQIDNO.78和I‑R：SEQIDNO.79、[0148] Ⅱ‑F：SEQIDNO.80和Ⅱ‑R：SEQIDNO.81、[0149] Ⅲ‑F：SEQIDNO.82和Ⅲ‑R：SEQIDNO.83、[0150] Ⅳ‑F：SEQIDNO.84和Ⅳ‑R：SEQIDNO.85、[0151] Ⅴ‑F：SEQIDNO.86和Ⅴ‑R：SEQIDNO.87、[0152] Ⅵ‑F：SEQIDNO.88和Ⅵ‑R：SEQIDNO.89分别进行PCR扩增。[0153] 得到的6个约5kbSARS‑CoV‑2PCR产物，分别称为[0154] 基因片段I：SEQIDNO.72、[0155] 基因片段Ⅱ：SEQIDNO.73、[0156] 基因片段Ⅲ：SEQIDNO.74、[0157] 基因片段Ⅳ：SEQIDNO.75、[0158] 基因片段Ⅴ：SEQIDNO.76、[0159] 基因片段Ⅵ：SEQIDNO.77。[0160] 先将基因片段I和Ⅱ组合，与经PCR引物对pBR322‑F：SEQIDNO.91和pBR322‑R：SEQIDNO.92背向扩增的pBR322线性化载体(序列如SEQIDNO.90所示)进行GibsonAssembly连接(试剂盒购自invitrogen公司)，得到长度约为13kb的重组质粒，命名为pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(1‑9975)，如图5B所示。对该质粒进行NotⅠ酶切和CIP去磷酸化处理并切胶回收纯化后，再与Ⅲ和Ⅳ混合，进行第二轮GibsonAssembly连接，得到的长度约23kb的重组质粒，命名为pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(1‑19975&1GC)。对该重组质粒进行NotⅠ酶切和CIP去磷酸化处理并切胶回收纯化后，与Ⅴ和Ⅵ组合进行第三轮GibsonAssembly连接，得到长度约33kb的重组质粒，命名为pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)。[0161] 每次GibsonAssembly反应体系中各基因片段与载体的摩尔浓度比为1：1，[0162] 反应条件为37℃5min，75℃20min，60℃30min。[0163] 每一轮GibsonAssembly连接产物用无菌水按1：5比例稀释，再通过电击转化或者化学转化导入ElectroporateElectroMAXTMDH10Bcells(购自invitrogen公司)或者OneShotTMTOP10ChemicallyCompetentE.colicells(购自invitrogen公司)。如图5B所示，在3个连接处分别设计引物对，挑取菌落PCR鉴定阳性的克隆提取重组质粒，送至生工测序。[0164] 对3个重组质粒的AscI/NotI酶切电泳结果如图6A所示。[0165] 实施例7：pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)的构建[0166] 将pBR322‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)(实施例6制备得到)质粒进行AscⅠ和NotⅠ酶切，通过酚氯仿抽提和异丙醇沉淀的方式回收酶切后的全长基因组。利用GibsonAssemblyKit将线性化SARS‑CoV‑2全长基因组与经PCR背向扩增线性化的pBacm质粒(扩增引物对SEQIDNO.94和NO.95，扩增产物序列如SEQIDNO.93所示)进行连接，得到的重组质粒命名为pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)，并通过电击转化至DY380温度敏感型感受态细胞中，挑取单个菌落，30℃过夜培养。对该重组质粒的AscI/NotI酶切电泳结果如图6B所示。[0167] 实施例8：两处GC碱基的删除[0168] 需要注意的是，利用Recombineering进行基因编辑时，首先需要将待编辑的单拷贝质粒电击转化至DY380温度敏感型感受态细胞。采用两步筛选法进行操作，即先用含有正、负筛选标记的(SacB+Kan)片段替换待编辑区域序列，然后用正确的序列替换该区域的(SacB+Kan)片段。[0169] 由于9975nt和19975nt两处均存在多余的GC碱基，需要先修复一处序列，再在此基础上，进行第二处序列的修复，故须经历4轮Recombineering过程。[0170] 以先修复9975位点多余的GC碱基，再修复19975位点的GC碱基进行详细说明：[0171] (1)以pBacm‑SacB‑Kan质粒为模板，通过带有50bp与SARS‑CoV‑2基因同源的引物对SEQIDNO:96和SEQIDNO:97进行PCR扩增(SacB+Kan)片段，并进行清洁回收。然后将(SacB+Kan)PCR产物电击转化至含有pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&2GC)质粒的DY380感受态细胞(制备过程如实施例2中所示)，涂布于含有Kan抗生素的LB固体平板，30℃倒置过夜培养。挑取阳性菌落，并提取重组质粒pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(SacB+Kan)‑9975。[0172] (2)以cDNA为模板，设计引物对SEQIDNO.99和SEQIDNO.100进行PCR扩增横跨9975位点前后约600bp的正确序列(如SEQIDNO.98所示)。该正确序列位置与上一步插入的(SacB+Kan)‑9975位置相同。将正确序列电击转化至含有pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(SacB+Kan)‑9975质粒的DY380感受态细胞，涂布于含有氯霉素(Chl)抗性及10％蔗糖的LB固体培养基，30℃倒置过夜培养。挑取阳性克隆，30℃摇床过夜培养，随后转接至500mL含有Chl的LB液体培养基中进行大量培养，提取重组质粒pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&19975GC)。[0173] (3)以pBacm‑SacB‑Kan质粒为模板，通过带有50bp与SARS‑CoV‑2基因组同源的引物对SEQIDNO:101和SEQIDNO:102进行PCR扩增(SacB+Kan)片段，并进行清洁回收。然后将(SacB+Kan)PCR产物电击转化至含有pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(FL&19975GC)质粒的DY380感受态细胞，涂布于含有Kan抗生素的LB固体平板，30℃倒置过夜培养。挑取阳性菌落，并提取重组质粒pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(SacB+Kan)‑19975。[0174] (4)以cDNA为模板，设计引物对SEQIDNO.104和SEQIDNO.105进行PCR扩增横跨19975位点前后约600bp的正确序列(SEQIDNO.103)。该正确序列位置与上一步插入的(SacB+Kan)‑19975位置相同。将正确序列电击转化至含有pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(SacB+Kan)‑19975质粒的DY380感受态细胞，涂布于含有Chl抗生素及10％蔗糖的LB固体培养基，30℃倒置过夜培养。挑取阳性克隆，30℃摇床过夜培养，随后转接至500mL含Chl的LB液体培养基中进行大量培养，提取重组质粒。由此经过4轮Recombineering过程得到的质粒命名为pBacm‑SARS‑CoV‑2‑FL。[0175] 利用Recombineering技术敲除9975nt和19975nt后的重组质粒测序结果如图7所示。[0176] 实施例9：T7启动子和T7终止子的插入[0177] 需要先插入T7启动子序列，再在此基础上，进行T7终止子序列的修复，故须经历4轮Recombineering编辑过程。整个过程与实施例7类似，不再详细说明，值得注意的点有以下几处。[0178] (1)PCR扩增(SacB+Kan)片段的引物对分别为[0179] T7p‑SacB‑F:SEQIDNO.106和T7p‑Kan‑R:SEQIDNO.107；[0180] 或者T7t‑SacB‑F:SEQIDNO.108和T7t‑Kan‑R:SEQIDNO.109。[0181] PCR扩增正确替换片段的引物对分别为[0182] T7p‑right‑F:SEQIDNO.110和T7p‑right‑R:SEQIDNO.111；[0183] 或者T7t‑SacB‑F:SEQIDNO.112和T7t‑Kan‑R:SEQIDNO.113。[0184] 合成的含有T7启动子和T7终止子的正确替换序列分别如SEQIDNO.114和SEQIDNO.115所示。[0185] (2)敲入T7启动子序列，则先将由引物对SEQIDNO.106和SEQIDNO.107扩增的(SacB+Kan)片段电击转化至含有pBacm‑SARS‑CoV‑2‑FL质粒的DY380感受态细胞，鉴定得到阳性重组质粒pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(SacB+Kan)‑T7p。再将由引物对SEQIDNO.110和SEQIDNO.111扩增的T7启动子序列电击转化至含有pBacm‑SARS‑CoV‑2‑(SacB+Kan)‑T7p的DY380感受态细胞，鉴定得到阳性重组质粒pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2。接着敲入T7终止子序列，操作步骤类似，先将由引物对SEQIDNO.108和SEQIDNO.109扩增的(SacB+Kan)片段电击转化至含有pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2质粒的DY380感受态细胞，鉴定得到阳性重组质粒pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑(SacB+Kan)‑T7t。再将由引物对SEQIDNO.112和SEQIDNO.113扩增的T7终止子序列电击转化至含有pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑(SacB+Kan)‑T7t的DY380感受态细胞，鉴定得到阳性重组质粒pBacm‑T7p‑SARS‑CoV‑2‑T7t。[0186] 最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。

专利地区：湖北

专利申请日期：2021-10-19

专利公开日期：2024-06-18

专利公告号：CN113913447B