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通过靶向DMPK基因治疗肌营养不良症的方法

更新时间:2024-07-01
通过靶向DMPK基因治疗肌营养不良症的方法 专利申请类型:发明专利;
源自:日本高价值专利检索信息库;

专利名称:通过靶向DMPK基因治疗肌营养不良症的方法

专利类型:发明专利

专利申请号:CN202080032034.2

专利申请(专利权)人:摩大力斯医疗株式会社
权利人地址:日本东京都

专利发明(设计)人:吉见英治,大江智也,山形哲也,基思·M·康诺利

专利摘要:本发明提供了包含下述碱基序列的多核苷酸:(a)编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列,和(b)编码向导RNA的碱基序列,所述向导RNA靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域,所述多核苷酸预期可用于治疗肌营养不良症。

主权利要求:
1.一种多核苷酸,其包含下述碱基序列:
(a)编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列,和(b)编码向导RNA的碱基序列,所述向导RNA靶向人类DMPK基因的表达调控区,其中所述编码向导RNA的碱基序列为如SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:
72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的碱基序列其中所述转录阻遏物是KRAB,并且
其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是源自于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的dCas9。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸,其包含编码向导RNA的至少两个碱基序列,其中所述至少两个碱基序列是不同的。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸,其还包含用于所述编码向导RNA的碱基序列的启动子序列和/或用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的启动子序列。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸,其中用于所述编码向导RNA的碱基序列的启动子序列是U6启动子、SNR6启动子、SNR52启动子、SCR1启动子、RPR1启动子、U3启动子或H1启动子。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸,其中用于所述编码向导RNA的碱基序列的启动子序列是U6启动子。
6.根据权利要求3所述的多核苷酸,其中用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的启动子序列是遍在启动子或肌肉特异性启动子。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸,其中所述遍在启动子是EFS启动子、CMV启动子或CAG启动子。
8.根据权利要求6所述的多核苷酸,其中所述肌肉特异性启动子是CK8启动子、肌球蛋白重链激酶(MHCK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、合成C5‑12(Syn)启动子或Des启动子。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸,其中所述肌肉特异性启动子是CK8启动子。
10.根据权利要求3所述的多核苷酸,
其中所述编码向导RNA的碱基序列为如SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的碱基序列,所述转录阻遏物是KRAB,
所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是源自于金黄色葡萄球菌的dCas9,用于所述编码向导RNA的碱基序列的启动子序列是U6启动子,并且
用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的启动子序列是CK8启动子。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸,
其中所述编码向导RNA的碱基序列为如SEQIDNO:83所示的碱基序列。
12.一种载体,其包含根据权利要求1至11中的任一项所述的多核苷酸。
13.根据权利要求12所述的载体,其中所述载体是质粒载体或病毒载体。
14.根据权利要求13所述的载体,其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体或慢病毒载体。
15.根据权利要求14所述的载体,其中所述AAV载体是AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、Anc80、AAV587MTP、AAV588MTP、AAV‑B1、AAVM41或AAVrh74。
16.一种药物组合物,其包含根据权利要求1至11中的任一项所述的多核苷酸或根据权利要求12至15中的任一项所述的载体。
17.根据权利要求16所述的药物组合物,其用于治疗或预防1型强直性肌营养不良症。
18.根据权利要求1至11中的任一项所述的多核苷酸或根据权利要求12至15中的任一项所述的载体在制造用于治疗或预防1型强直性肌营养不良症的药物组合物中的用途。
19.一种核糖核蛋白,其包含下述组分:
(c)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白,和
(d)向导RNA,所述向导RNA靶向人类DMPK基因的表达调控区,其中所述向导RNA的碱基序列为如SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:
161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:
172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:
183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列,其中所述转录阻遏物是KRAB,并且
其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是源自于金黄色葡萄球菌的dCas9。
20.一种用于抑制人类DMPK基因的表达的组合物或药剂盒,所述组合物或药剂盒包含下述组分:(e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和(f)向导RNA,所述向导RNA靶向人类DMPK基因的表达调控区,其中所述向导RNA的碱基序列为如SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:
161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:
172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:
183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列,其中所述转录阻遏物是KRAB,并且
其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是源自于金黄色葡萄球菌的dCas9。 说明书 : 通过靶向DMPK基因治疗肌营养不良症的方法[0001] 与相关申请的交叉引用[0002] 本申请要求2019年5月28日提交的美国临时专利申请号62/853,373和2020年5月15日提交的美国临时专利申请号63/025,417的利益,所述临时专利申请的内容整体通过参考并入本文。技术领域[0003] 本发明涉及通过靶向人类肌强直素蛋白激酶(DMPK;强直性肌营养不良症蛋白激酶)基因等来治疗肌营养不良症的方法。更具体来说。本发明涉及使用靶向人类DMPK基因的特定序列的向导RNA和转录阻遏物与CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)效应蛋白的融合蛋白,通过阻遏人类DMPK基因的表达来治疗或预防肌营养不良症的方法和药物组合物等。背景技术[0004] 肌营养不良症是与进行性肌萎缩和肌无力相关的遗传疾病的总称。即使在今天,对肌营养不良症有效的根本治疗药物仍不存在,只是进行对症治疗。在肌营养不良症中,1型强直性肌营养不良症(DM1)由DMPK基因中的突变引起。[0005] DM1是由DMPK基因的3’非翻译区(3’UTR)中CTG重复序列的延长引起的常染色体显性遗传病,并且是一种类型的三联体重复序列疾病。已报道在DM1中,含有扩展的CUG重复序列的RNA从内源RNA靶中分离出CUG重复序列结合蛋白例如MBNL(盲肌样蛋白),从而导致异常的剪接模式、RNA稳定性/定位的改变等。这些发现表明,扩展的重复序列基因座的沉默具有治疗价值,并将各种不同的方法例如反义寡核苷酸、小RNA、小分子等用于沉默毒性RNA(参见PintoB等,MolCell.2017Nov2,68(3):479‑490,其整体通过参考并入本文)。[0006] 例如,Jauvin等人用靶向DMPK基因的3’UTR的反义寡核苷酸(ASO)治疗作为DM1的小鼠模型的DMSXL小鼠,并显示DMPKmRNA水平降低,核RNA聚集体(RNA灶点)减少并且肌肉强度增加,而没有检测到明显毒性(参见JauvinD等,MolTherNucleicAcids.2017年6月16日,7:465‑474,其整体通过参考并入本文)。[0007] WO2018/002812公开了一种例如使用CRISPR/Cas9系统通过基因组编辑来编辑细胞中的DMPK基因的方法,所述方法可用于治疗DMPK相关病症或障碍例如DM1(参见WO2018/002812,其整体通过参考并入本文)。[0008] Pinto等人和Batra等人演示了将失活/无核酸酶活性的Cas9(dCas9)应用于DM1治疗的可能性。具体来说,Pinto等人将dCas9与针对CTG重复序列区的gRNA组合,并显示dCas9有效阻断扩展的微卫星重复序列的转录,由此可以在体外和体内(在作为DM1的小鼠模型的LRHSA 小鼠中)改善由重复序列扩展造成的DM1的特征性表型(参见PintoB等,MolCell.2017年11月2日,68(3):479‑490,其整体通过参考并入本文)。另一方面,Batra等人显示与RNA内切核酸酶融合的dCas9和针对DMPKmRNA的CUG重复序列区的gRNA的组合可以降低CUG重复序列扩展RNA的水平,并改善DM1患者细胞中的剪接异常(参见BatraR等,Cell.2017年8月24日,170(5):899‑912,其整体通过参考并入本文)。发明内容[0009] 因此,本发明的一个目的是为肌营养不良症(特别是DM1)提供新的治疗方法。[0010] 本发明的另一个目的是提供可用于治疗肌营养不良症的新药剂。[0011] 将在下面的详细描述中变得显而易见的这些和其他目的通过本发明的下述发现得以实现,即使用靶向人类DMPK基因(基因ID:1760)的特定序列的向导RNA和转录阻遏物与核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白的融合蛋白,可以强烈抑制人类DMPK基因的表达。本发明人在这些发现的基础上完成了本发明。[0012] 因此,本发明提供了下述项:[0013] (1)一种多核苷酸,其包含下述碱基序列:[0014] (a)编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列,和[0015] (b)编码向导RNA的碱基序列,所述向导RNA靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域。[0016] (2)上述(1)所述的多核苷酸,其包含下述碱基序列:[0017] (a)编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列,和[0018] (b)编码向导RNA的碱基序列,所述向导RNA靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:134、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域。[0019] (3)上述(1)或(2)所述的多核苷酸,其包含下述碱基序列:[0020] (a)编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列,和[0021] (b)编码向导RNA的碱基序列,所述向导RNA靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:63、SEQIDNO:136、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:135、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域。[0022] (4)上述(1)所述的多核苷酸,其中所述编码向导RNA的碱基序列包含SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的碱基序列。[0023] (5)上述(1)至(4)中的任一项所述的多核苷酸,其包含编码向导RNA的至少两个碱基序列,其中所述至少两个碱基序列是不同的。[0024] (6)上述(1)至(5)中的任一项所述的多核苷酸,其中所述转录阻遏物选自KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1和HP1A。[0025] (7)上述(6)所述的多核苷酸,其中所述转录阻遏物是KRAB。[0026] (8)上述(1)至(7)中的任一项所述的多核苷酸,其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是dCas9。[0027] (9)上述(8)所述的多核苷酸,其中所述dCas9源自于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。[0028] (10)上述(1)至(9)中的任一项所述的多核苷酸,其还包含用于所述编码向导RNA的碱基序列的启动子序列和/或用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的启动子序列。[0029] (11)上述(10)所述的多核苷酸,其中用于所述编码向导RNA的碱基序列的启动子序列选自U6启动子、SNR6启动子、SNR52启动子、SCR1启动子、RPR1启动子、U3启动子和H1启动子。[0030] (12)上述(11)所述的多核苷酸,其中用于所述编码向导RNA的碱基序列的启动子序列是U6启动子。[0031] (13)上述(10)至(12)中的任一项所述的多核苷酸,其中用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的启动子序列是遍在启动子或肌肉特异性启动子。[0032] (14)上述(13)所述的多核苷酸,其中所述遍在启动子选自EFS启动子、CMV启动子和CAG启动子。[0033] (15)上述(13)所述的多核苷酸,其中所述肌肉特异性启动子选自CK8启动子、肌球蛋白重链激酶(MHCK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、合成C5‑12(Syn)启动子和Des启动子。[0034] (16)上述(15)所述的多核苷酸,其中所述肌肉特异性启动子是CK8启动子。[0035] (17)上述(10)至(16)中的任一项所述的多核苷酸,[0036] 其中所述编码向导RNA的碱基序列包含SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的碱基序列,[0037] 所述转录阻遏物是KRAB,[0038] 所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是源自于金黄色葡萄球菌的dCas9,[0039] 用于所述编码向导RNA的碱基序列的启动子序列是U6启动子,并且[0040] 用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的启动子序列是CK8启动子。[0041] (18)上述(17)所述的多核苷酸,[0042] 其中所述编码向导RNA的碱基序列包含SEQIDNO:83所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:83所示的碱基序列。[0043] (19)一种载体,其包含上述(1)至(18)中的任一项所述的多核苷酸。[0044] (20)上述(19)所述的载体,其中所述载体是质粒载体或病毒载体。[0045] (21)上述(20)所述的载体,其中所述病毒载体选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体和慢病毒载体。[0046] (22)上述(21)所述的载体,其中所述AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、Anc80、AAV587MTP、AAV588MTP、AAV‑B1、AAVM41和AAVrh74。[0047] (23)(22)所述的载体,其中所述AAV载体是AAV9。[0048] (24)一种药物组合物,其包含上述(1)至(18)中的任一项所述的多核苷酸或上述(19)至(23)中的任一项所述的载体。[0049] (25)上述(24)所述的药物组合物,其用于治疗或预防1型强直性肌营养不良症。[0050] (26)一种治疗或预防1型强直性肌营养不良症的方法,所述方法包括向需要的对象给药上述(1)至(18)中的任一项所述的多核苷酸或上述(19)至(23)中的任一项所述的载体。[0051] (27)上述(1)至(18)中的任一项所述的多核苷酸或上述(19)至(23)中的任一项所述的载体的用途,其用于治疗或预防1型强直性肌营养不良症。[0052] (28)上述(1)至(18)中的任一项所述的多核苷酸或上述(19)至(23)中的任一项所述的载体的用途,其用于制造治疗或预防1型强直性肌营养不良症的药物组合物。[0053] (29)一种核糖核蛋白,其包含下述组分:[0054] (c)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白,和[0055] (d)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA。[0056] (30)上述(29)所述的核糖核蛋白,其包含下述组分:[0057] (c)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白,和[0058] (d)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:134、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA。[0059] (31)上述(29)或(30)所述的核糖核蛋白,其包含下述组分:[0060] (c)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白,和[0061] (d)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:63、SEQIDNO:136、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:135、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA。[0062] (32)上述(29)所述的核糖核蛋白,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列。[0063] (33)上述(29)至(32)中的任一项所述的核糖核蛋白,其中所述转录阻遏物选自KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1和HP1A。[0064] (34)上述(29)至(33)中的任一项所述的核糖核蛋白,其中所述转录阻遏物是KRAB。[0065] (35)上述(29)至(34)中的任一项所述的核糖核蛋白,其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是dCas9。[0066] (36)上述(35)所述的核糖核蛋白,其中所述dCas9源自于金黄色葡萄球菌。[0067] (37)上述(29)至(36)中的任一项所述的核糖核蛋白,[0068] 其中所述向导RNA包含SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列,[0069] 其中所述转录阻遏物是KRAB,并且[0070] 其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是源自于金黄色葡萄球菌的dCas9。[0071] (38)上述(37)所述的核糖核蛋白,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:171所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:171所示的碱基序列。[0072] (39)一种用于抑制人类DMPK基因的表达的组合物或药剂盒,所述组合物或药剂盒包含下述组分:[0073] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0074] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸。[0075] (40)上述(39)所述的组合物或药剂盒,所述组合物或药剂盒包含下述组分:[0076] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0077] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:134、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸。[0078] (41)上述(39)或(40)所述的组合物或药剂盒,所述组合物或药剂盒包含下述组分:[0079] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0080] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:63、SEQIDNO:136、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:135、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸。[0081] (42)上述(39)所述的组合物或药剂盒,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列。[0082] (43)上述(39)至(42)所述的组合物或药剂盒,所述组合物或药剂盒包含至少两个不同的向导RNA或编码至少两个不同的向导RNA的多核苷酸或至少两个编码向导RNA的多核苷酸,其中所述至少两个多核苷酸是不同的。[0083] (44)上述(39)至(43)中的任一项所述的组合物或药剂盒,其中所述转录阻遏物选自KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1和HP1A。[0084] (45)上述(44)所述的组合物或药剂盒,其中所述转录阻遏物是KRAB。[0085] (46)上述(39)至(45)中的任一项所述的组合物或药剂盒,其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是dCas9。[0086] (47)上述(46)所述的组合物或药剂盒,其中所述dCas9源自于金黄色葡萄球菌。[0087] (48)上述(39)至(47)中的任一项所述的组合物或药剂盒,[0088] 其中所述组合物或药剂盒包含编码所述融合蛋白的多核苷酸和编码所述向导RNA的多核苷酸,并且[0089] 其中所述编码所述融合蛋白的多核苷酸还包含用于所述融合蛋白的启动子序列,和/或所述编码所述向导RNA的多核苷酸还包含用于所述向导RNA的启动子序列。[0090] (49)上述(48)所述的组合物或药剂盒,其中用于所述向导RNA的启动子序列选自U6启动子、SNR6启动子、SNR52启动子、SCR1启动子、RPR1启动子、U3启动子和H1启动子。[0091] (50)上述(48)所述的组合物或药剂盒,其中用于所述融合蛋白的启动子序列是遍在启动子或肌肉特异性启动子。[0092] (51)上述(50)所述的组合物或药剂盒,其中所述遍在启动子选自EFS启动子、CMV启动子和CAG启动子。[0093] (52)上述(50)所述的组合物或药剂盒,其中所述肌肉特异性启动子选自CK8启动子、肌球蛋白重链激酶(MHCK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、合成C5‑12(Syn)启动子和Des启动子。[0094] (53)上述(48)至(52)中的任一项所述的组合物或药剂盒,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列。[0095] 其中所述转录阻遏物是KRAB,[0096] 其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是源自于金黄色葡萄球菌的dCas9,[0097] 其中用于所述向导RNA的启动子序列是U6启动子,并且[0098] 其中用于所述融合蛋白的启动子序列是CK8启动子。[0099] (54)上述(53)所述的组合物或药剂盒,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:171所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:171所示的碱基序列。[0100] (55)一种治疗或预防1型强直性肌营养不良症的方法,所述方法包括给药下述(e)和(f)的步骤:[0101] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0102] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸。[0103] (56)上述(55)所述的方法,其包括给药下述(e)和(f)的步骤:[0104] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0105] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:134、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸。[0106] (57)上述(55)或(56)所述的方法,其包括给药下述(e)和(f)的步骤:[0107] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0108] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:63、SEQIDNO:136、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:135、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸。[0109] (58)上述(55)所述的方法,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列。[0110] (59)上述(55)至(58)所述的方法,其包括给药至少两个不同的向导RNA或编码至少两个不同的向导RNA的多核苷酸或至少两个编码向导RNA的多核苷酸,其中所述至少两个多核苷酸是不同的。[0111] (60)上述(55)至(59)所述的方法,其中所述转录阻遏物选自KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1和HP1A。[0112] (61)上述(60)所述的方法,其中所述转录阻遏物是KRAB。[0113] (62)上述(55)至(61)中的任一项所述的方法,其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是dCas9。[0114] (63)上述(62)所述的方法,其中所述dCas9源自于金黄色葡萄球菌。[0115] (64)上述(55)至(63)中的任一项所述的方法,[0116] 其中所述方法包括给药编码所述融合蛋白的多核苷酸和编码所述向导RNA的多核苷酸,并且[0117] 其中所述编码所述融合蛋白的多核苷酸还包含用于所述融合蛋白的启动子序列,和/或所述编码所述向导RNA的多核苷酸还包含用于所述向导RNA的启动子序列。[0118] (65)上述(64)所述的方法,其中用于所述向导RNA的启动子序列选自U6启动子、SNR6启动子、SNR52启动子、SCR1启动子、RPR1启动子、U3启动子和H1启动子。[0119] (66)上述(64)所述的方法,其中用于所述融合蛋白的启动子序列是遍在启动子或肌肉特异性启动子。[0120] (67)上述(66)所述的方法,其中所述遍在启动子选自EFS启动子、CMV启动子和CAG启动子。[0121] (68)上述(66)所述的方法,其中所述肌肉特异性启动子选自CK8启动子、肌球蛋白重链激酶(MHCK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、合成C5‑12(Syn)启动子和Des启动子。[0122] (69)上述(64)至(68)中的任一项所述的方法,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列,[0123] 其中所述转录阻遏物是KRAB,[0124] 其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是源自于金黄色葡萄球菌的dCas9,[0125] 其中用于所述向导RNA的启动子序列是U6启动子,并且[0126] 其中用于所述融合蛋白的启动子序列是CK8启动子。[0127] (70)上述(69)所述的方法,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:171所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:171所示的碱基序列。[0128] (71)下述组分的用途:[0129] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0130] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸,[0131] 所述组分用于制造治疗或预防1型强直性肌营养不良症的药物组合物。[0132] (72)上述(71)所述的下述组分(e)和(f)的用途:[0133] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0134] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:134、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸,[0135] 所述组分用于制造治疗或预防1型强直性肌营养不良症的药物组合物。[0136] (73)上述(71)或(72)所述的下述组分(e)和(f)的用途:[0137] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0138] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:63、SEQIDNO:136、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:135、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸,[0139] 所述组分用于制造治疗或预防1型强直性肌营养不良症的药物组合物。[0140] (74)上述(71)所述的用途,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列。[0141] (75)上述(71)至(74)所述的用途,其包括使用至少两个不同的向导RNA或编码至少两个不同的向导RNA的多核苷酸或至少两个编码向导RNA的多核苷酸,其中所述至少两个多核苷酸是不同的。[0142] (76)上述(71)至(75)所述的用途,其中所述转录阻遏物选自KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1和HP1A。[0143] (77)上述(76)所述的用途,其中所述转录阻遏物是KRAB。[0144] (78)上述(71)至(77)中的任一项所述的用途,其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是dCas9。[0145] (79)上述(78)所述的用途,其中所述dCas9源自于金黄色葡萄球菌。[0146] (80)上述(71)至(79)中的任一项所述的用途,[0147] 其中所述用途包括使用编码所述融合蛋白的多核苷酸和使用编码所述向导RNA的多核苷酸,并且[0148] 其中所述编码所述融合蛋白的多核苷酸还包含用于所述融合蛋白的启动子序列,和/或所述编码所述向导RNA的多核苷酸还包含用于所述向导RNA的启动子序列。[0149] (81)上述(80)所述的用途,其中用于所述向导RNA的启动子序列选自U6启动子、SNR6启动子、SNR52启动子、SCR1启动子、RPR1启动子、U3启动子和H1启动子。[0150] (82)上述(80)所述的用途,其中用于所述融合蛋白的启动子序列是遍在启动子或肌肉特异性启动子。[0151] (83)上述(82)所述的用途,其中所述遍在启动子选自EFS启动子、CMV启动子和CAG启动子。[0152] (84)上述(82)所述的用途,其中所述肌肉特异性启动子选自CK8启动子、肌球蛋白重链激酶(MHCK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、合成C5‑12(Syn)启动子和Des启动子。[0153] (85)上述(80)至(84)所述的用途,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列,[0154] 其中所述转录阻遏物是KRAB,[0155] 其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是源自于金黄色葡萄球菌的dCas9,[0156] 其中用于所述向导RNA的启动子序列是U6启动子,并且[0157] 其中用于所述融合蛋白的启动子序列是CK8启动子。[0158] (86)上述(85)所述的用途,其中所述向导RNA包含SEQIDNO:171所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:171所示的碱基序列。[0159] 本发明的效果[0160] 根据本发明,可以抑制人类DMPK基因的表达,并且因此预计本发明能够治疗和/或预防DM1。附图说明[0161] 当结合附图考虑时,通过参考下述详细描述将会更容易地获得对本发明及其许多附带优点的更完整的认识,因为它们变得更好理解,在所述附图中:[0162] 图1示出了SEQIDNO:4至126所示的靶向序列的位置,其中黑框示出了显示出人类DMPK基因表达的不少于50%的降低的靶向序列的位置。[0163] 图2示出了使用dSaCas9‑KRAB和包含分别由SEQIDNO:4至126所示的靶向序列编码的crRNA的sgRNA评估的对人类DMPK基因的表达抑制作用的结果。水平轴示出了包含由每个靶向序列编码的crRNA的sgRNA,竖直轴示出了在使用每个sgRNA时DMPK基因的表达水平与在使用对照sgRNA时DMPK基因的表达水平(100%)的比率,并且误差条示出了标准偏差。[0164] 图3示出了当使用dSaCas9‑KRAB和分别包含由靶向序列编码的crRNA的sgRNA控制人类DMPK基因的表达时,SEQIDNO:4至126所示的靶向序列的位置与人类DMPK基因的表达水平之间的关系。[0165] 图4示出了在人类肌细胞中DMPK的下调。[0166] 图5显示了在DMSXL小鼠中AAV9‑695抑制DMPK表达(A:胫前肌;B:心脏;C:肝脏)。[0167] 图6显示了在DMSXL小鼠中AAV9‑245抑制DMPK表达(A:胫前肌;B:心脏;C:肝脏)。[0168] 图7显示了在DMSXL小鼠中AAV9‑257抑制DMPK表达(A:胫前肌;B:心脏;C:肝脏)。[0169] 图8显示了在DMSXL小鼠中AAV9‑695改善RNA灶点形成。[0170] 图9示出了在表达hDMPKsgRNA的iDM细胞中DMPK基因表达的抑制。[0171] 图10示出了在表达hDMPKsgRNA的iDM细胞中RNA灶点形成的改善(A:iDM‑695细胞和iDM‑对照细胞的典型图像;B:每个细胞中RNA灶点阳性的核的比率)。[0172] 图11示出了在表达hDMPKsgRNA的iDM细胞中剪接缺陷的改善(A:基因的凝胶图像和外显子模式;B:正常剪接产物的比率)。具体实施方式[0173] 1.多核苷酸[0174] 本发明提供了一种包含下述碱基序列的多核苷酸(在后文中有时被称为“本发明的多核苷酸”):[0175] (a)编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列,和[0176] (b)编码向导RNA的碱基序列,所述向导RNA靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域(即18至24个毗连核苷酸)。[0177] 本发明的多核苷酸被引入到所需细胞中并转录,产生核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白和靶向人类DMPK基因的表达调控区的特定区域的向导RNA。这些融合蛋白和向导RNA形成复合体(在后文中所述复合体有时被称为“核糖核蛋白;RNP”)并协同作用于上述特定区域,从而阻遏人类DMPK基因的转录。在本发明的一个实施方式中,所述人类DMPK基因的表达可以被抑制例如不少于约40%、不少于约50%、不少于约60%、不少于约70%、不少于约75%、不少于约80%、不少于约85%、不少于约90%、不少于约95%或约100%。[0178] (1)定义[0179] 在本说明书中,“人类DMPK基因的表达调控区”意味着通过RNP与该区域的结合可以阻遏人类DMPK基因的表达的任何区域。也就是说,人类DMPK基因的表达调控区可能存在于人类DMPK基因的任何区域例如启动子区、增强子区、内含子、外显子和人类DMPK基因的邻近基因(例如人类DMWD(DM1基因座,含有WD重复序列)基因)中,只要人类DMPK基因的表达被RNP的结合阻遏即可。在本说明书中,当表达调控区用特定序列示出时,所述表达调控区在概念上包括正义链序列和反义链序列两者。[0180] 在本发明中,核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白被向导RNA召集到人类DMPK基因的表达调控区的特定区域中。在本说明书中,“靶向……的向导RNA”意味着“将融合蛋白召集到……中的向导RNA”。[0181] 在本说明书中,“向导RNA(被称为“gRNA”)”是包含基因组特异性CRISPR‑RNA(被称为“crRNA”)的RNA。crRNA是与靶向序列(在晚些时候描述)的互补序列结合的RNA。当使用Cpf1作为CRISPR效应蛋白时,“向导RNA”是指包含由crRNA构成的RNA和附连到其5’‑端的特定序列的RNA(例如在FnCpf1的情况下,SEQIDNO:138所示的RNA序列)。当使用Cas9作为CRISPR效应蛋白时,“向导RNA”是指包含crRNA和附连到其3’‑端的反式作用crRNA(被称为“tracrRNA”)的嵌合RNA(被称为“单一向导RNA(sgRNA)”)(参见例如ZhangF.等,HumMolGenet.2014年9月15日;23(R1):R40‑6和ZetscheB.等,Cell.2015年10月22日;163(3):759‑71,它们整体通过参考并入本文)。[0182] 在本说明书中,与crRNA在人类DMPK基因的表达调控区中结合的序列互补的序列被称为“靶向序列”。也就是说,在本说明书中,“靶向序列”是存在于人类DMPK基因的表达调控区中并与PAM(前间区序列邻近基序)相邻的DNA序列。当使用Cpf1作为CRISPR效应蛋白时,PAM与靶向序列的5’‑侧相邻。当使用Cas9作为CRISPR效应蛋白时,PAM与靶向序列的3’‑侧相邻。所述靶向序列可以存在于人类DMPK基因的表达调控区的正义链序列侧或反义链序列侧上(参见例如上述的ZhangF.等,HumMolGenet.2014年9月15日;23(R1):R40‑6和ZetscheB.等,Cell.2015年10月22日;163(3):759‑71,它们整体通过参考并入本文)。[0183] (2)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白[0184] 在本发明中,使用核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白,与其融合的转录阻遏物被召集到人类DMPK基因的表达调控区。对本发明中使用的核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白(在后文中有时被简称为“CRISPR效应蛋白”)没有特别限制,只要它与gRNA形成复合体并被召集到人类DMPK基因的表达调控区即可。例如,可以包括核酸酶缺陷型Cas9(在后文中有时也被称为“dCas9”)或核酸酶缺陷型Cpf1(在后文中有时也被称为“dCpf1”)。[0185] 上述dCas9的实例包括但不限于源自于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9(SpCas9;PAM序列:NGG(N是A、G、T或C,下同))、源自于嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的Cas9(St1Cas9;PAM序列:NNAGAAW(W是A或T,下同),St3Cas9;PAM序列:NGGNG)、源自于脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)的Cas9(NmCas9;PAM序列:NNNNGATT)或源自于金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9;PAM序列:NNGRRT(R是A或G,下同))等的核酸酶缺陷型变体(参见例如Nishimasu等,Cell.2014年2月27日;156(5):935–49;EsveltKM等,NatMethods.2013年11月;10(11):1116‑21;ZhangY.MolCell.2015年10月15日;60(2):242‑55;和FriedlandAE等,GenomeBiol.2015年11月24日;16:257,它们整体通过参考并入本文)。例如,在SpCas9的情况下,可以使用其中第10位处的Asp残基被转变成Ala残基并且第840位处的His残基被转变成Ala残基的双重突变体(有时被称为“dSpCas9”)(参见例如上述的Nishimasu等,Cell.2014,其整体通过参考并入本文)。或者,在SaCas9的情况下,可以使用其中第10位处的Asp残基被转变成Ala残基并且第580位处的Asn残基被转变成Ala残基的双重突变体(SEQIDNO:139),或其中第10位处的Asp残基被转变成Ala残基并且第557位处的His残基被转变成Ala残基的双重突变体(SEQIDNO:140)(在后文中这些双重突变体中的任一者有时被称为“dSaCas9”)(参见例如上述的FriedlandAE等,GenomeBiol.2015,其整体通过参考并入本文)。[0186] 此外,在本发明的一个实施方式中,作为dCas9,也可以使用通过将上述dCas9的一部分氨基酸序列修饰而获得的变体,所述变体与gRNA形成复合体并被召集到人类DMPK基因的表达调控区。此类变体的实例包括具有部分缺失的氨基酸序列的截短变体。在本发明的一个实施方式中,可以使用在整体通过参考并入本文的WO2019/235627和WO2020/085441中描述的变体作为dCas9。具体来说,也可以使用通过从其中第10位处的Asp残基被转变成Ala残基并且第580位处的Asn残基被转变成Ala残基的双重突变体dSaCas9缺失第721至第745位氨基酸而获得的dSaCas9(SEQIDNO:141)或其中将所述缺失的部分用肽连接物替换的dSaCas9(例如其中将所述缺失部分用GGSGGS连接物(SEQIDNO:142)替换的dSaCas9如SEQIDNO:143所示)(在后文中这些双重突变体中的任一者有时被称为“dSaCas9[‑25]”),或通过缺失作为上述双重突变体dSaCas9的第482至第648位氨基酸而获得的dSaCas9(SEQIDNO:144)或其中将所述缺失的部分用肽连接物替换的dSaCas9(其中将所述缺失部分用GGSGGS连接物替换的dSaCas9如SEQIDNO:145所示)。[0187] 上述dCpf1的实例包括但不限于源自于新凶手弗朗西丝菌(Francisellanovicida)的Cpf1(FnCpf1;PAM序列:TTN)、源自于氨基酸球菌属菌种(Acidaminococcussp.)的Cpf1(AsCpf1;PAM序列:TTTN)或源自于毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌的Cpf1(LbCpf1;PAM序列:TTTA、TCTA、TCCA或CCCA)等的核酸酶缺陷型变体(参见例如ZetscheB.等,Cell.2015年10月22日;163(3):759‑71;YamanoT等,Cell.2016年5月5日;165(4):949‑62;和YamanoT等,MolCell.2017年8月17日;67(4):633‑45,它们整体通过参考并入本文)。例如,在FnCpf1的情况下,可以使用其中第917位处的Asp残基被转变成Ala残基并且第1006位处的Glu残基被转变成Ala残基的双重突变体(参见例如上述的ZetscheB等,Cell.2015,其整体通过参考并入本文)。在本发明的一个实施方式中,作为dCpf1,也可以使用通过将上述dCpf1的一部分氨基酸序列修饰而获得的变体,所述变体与gRNA形成复合体并被召集到人类DMPK基因的表达调控区。[0188] 在本发明的一个实施方式中,将dCas9用作所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白。在一个实施方式中,所述dCas9是dSaCas9,并且在特定实施方式中,dSaCas9是dSaCas9[‑25]。[0189] 包含编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白的碱基序列的多核苷酸可以例如通过下述方法来克隆:在cDNA序列信息的基础上合成覆盖编码所述蛋白质的所需部分的区域的oligoDNA引物,并使用从产生所述蛋白质的细胞制备的总RNA或mRNA级分作为模板,通过PCR方法扩增所述多核苷酸。此外,包含编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白的碱基序列的多核苷酸可以通过下述方法获得:使用已知的定点突变方法在编码克隆的CRISPR效应蛋白的核苷酸序列中引入突变,以将对核酸酶活性来说重要的位点处的氨基酸残基(可以包括例如在SaCas9的情况下第10位处的Asp残基、第557位处的His残基和第580位处的Asn残基,在FnCpf1的情况下第917位处的Asp残基和第1006位处的Glu残基等,但不限于此)转变成其他氨基酸。[0190] 或者,包含编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白的碱基序列的多核苷酸可以在cDNA序列信息的基础上通过化学合成或化学合成与PCR法或Gibson组装法的组合来获得,并且还可以被进一步构建成经历密码子优化以成为适合于在人类中表达的密码子的碱基序列。[0191] (3)转录阻遏物[0192] 在本发明中,通过与所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白融合的转录阻遏物的作用阻遏人类DMPK基因的表达。在本说明书中,“转录阻遏物”意味着具有阻遏人类DMPK基因的基因转录的能力的蛋白质或其保留了所述功能的肽片段。对在本发明中使用的转录阻遏物没有特别限制,只要它可以阻遏人类DMPK基因的表达即可。它包括例如Kruppel结合框(KRAB)、MBD2B、v‑ErbA、SID(包括SID的链状态(SID4X))、MBD2、MBD3、DNMT家族(例如DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb、MeCP2、ROM2、LSD1、AtHD2A、SET1、HDAC11、SETD8、EZH2、SUV39H1、PHF19、SALI、NUE、SUVR4、KYP、DIM5、HDAC8、SIRT3、SIRT6、MESOLO4、SET8、HST2、COBB、SET‑TAF1B、NCOR、SIN3A、HDT1、NIPP1、HP1A、ERF阻遏物结构域(ERD)及其具有转录阻遏能力的变体、其融合体等。在本发明的一个实施方式中,使用KRAB作为所述转录阻遏物。[0193] 包含编码转录阻遏物的碱基序列的多核苷酸可以通过化学合成或化学合成与PCR法或Gibson组装法的组合来构建。此外,包含编码转录阻遏物的碱基序列的多核苷酸还可以被构建成具有适合于在人类中表达的密码子的密码子优化的DNA序列。[0194] 包含编码转录阻遏物与核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白的融合蛋白的碱基序列的多核苷酸,可以通过将编码所述CRISPR效应蛋白的碱基序列直接地或在添加编码连接物、NLS(核定位信号)(例如SEQIDNO:189或SEQIDNO:191所示的碱基序列)、标签等的碱基序列后连接到编码所述转录阻遏物的碱基序列来获得。在本发明中,可以将所述转录阻遏物与所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白的N‑端或C‑端融合。作为连接物,可以使用氨基酸数目为约2至50的连接物,并且其具体实例包括但不限于其中甘氨酸(G)和丝氨酸(S)被交替连接的G‑S‑G‑S连接物等。在本发明的一个实施方式中,作为包含编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的多核苷酸,可以使用SEQIDNO:151所示的碱基序列,其编码作为融合蛋白的SV40NLS、dSaCas9、NLS和KRAB。[0195] (4)向导RNA[0196] 在本发明中,可以通过向导RNA将核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白召集到人类DMPK基因的表达调控区。正如在上述“(1)定义”中描述的,向导RNA包含crRNA,并且所述crRNA与靶向序列的互补序列结合。crRNA可能不与靶向序列的互补序列完全互补,只要所述向导RNA可以将所述融合蛋白召集到靶区域即可,并且可以是其中缺失、替换、插入和/或添加了至少1至3个碱基的序列。[0197] 当使用dCas9作为所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白时,可以例如使用已公布的gRNA设计网站(CRISPR设计工具、CRISPR指导等)确定所述靶向序列。具体来说,从靶基因(即人类DMPK基因)及其临近基因的序列,列出PAM(例如在SaCas9的情况下为NNGRRT)与其3’‑侧相邻的长度为约20个核苷酸的候选靶向序列,并且可以使用这些候选靶向序列中在人类基因组中具有少量脱靶位点的候选序列作为所述靶向序列。所述靶向序列的碱基长度为18至24个核苷酸长,优选为18至23个核苷酸长,更优选为18至22个核苷酸长。作为用于预测脱靶位点数目的初筛,大量生物信息学工具是已知且可公开获得的,并且可用于预测具有最低脱靶效应的靶向序列。其实例包括生物信息学工具例如Benchling(https://benchling.com)和COSMID(具有错配、插入和缺失的CRISPR脱靶位点)(可以在互联网上的https://crispr.bme.gatech.edu网站获得)。使用这些工具,可以概述与gRNA所靶向的碱基序列的相似性。当使用的gRNA设计软件不具有搜索靶基因组的脱靶位点的功能时,所述脱靶位点可以例如通过将所述靶基因组针对候选靶向序列的3’‑侧上的8至12个核苷酸(具有被靶向核苷酸序列的高区分能力的种子序列)进行Blast搜索来搜索。[0198] 在本发明的一个实施方式中,在存在于人类19号染色体(Chr19)的GRCh38.p12位置中的区域中,靠近DMPK基因的转录起始点的区域:45,777,342‑45,784,715可以是所述人类DMPK基因的表达调控区。正如在实施例中所示,本发明人发现通过靶向上述区域中的45,778,884‑45,783,985区域(图3中的2区),可以调控人类DMPK基因的表达。因此,在本发明的一个实施方式中,所述靶向序列可以是存在于人类19号染色体(Chr19)的GRCh38.p12位置中的区域中的45,778,884‑45,783,985区域中的连续的长度为18至24个核苷酸、优选地长度为18至23个核苷酸、更优选地长度为18至22个核苷酸的碱基序列。[0199] 此外,本发明人发现,存在于上述区域45,778,884‑45,783,985中的SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域,优选地作为设计所述用于阻遏DMPK基因的表达的靶向序列的区域。因此,在本发明的一个实施方式中,所述靶向序列可以是这些区域中的连续的长度为18至24个核苷酸、优选地长度为18至23个核苷酸、更优选地长度为18至22个核苷酸的碱基序列。人类DMPK基因的表达调控区中每个序列的位置描述在表1和图1中。[0200] 在本发明的一个实施方式中,所述靶向序列可以是存在于上述区域45,778,884‑45,783,985中的SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:134、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中的连续的长度为18至24个核苷酸、优选地长度为18至23个核苷酸、更优选地长度为18至22个核苷酸的碱基序列,其被认为显示出人类DMPK基因表达的不少于50%的降低。人类DMPK基因的表达调控区中每个序列的位置描述在表1和图1中。[0201] 在本发明的另一个实施方式中,所述靶向序列可以是存在于上述区域45,778,884‑45,783,985中的SEQIDNO:63、SEQIDNO:136、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:135、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的区域中的连续的长度为18至24个核苷酸、优选地长度为18至23个核苷酸、更优选地长度为18至22个核苷酸的碱基序列,其被认为显示出人类DMPK基因表达的不少于75%的降低。人类DMPK基因的表达调控区中每个序列的位置描述在表1和图1中。[0202] 在本发明的又一个实施方式中,所述靶向序列可以是SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的碱基序列。SEQIDNO:43和44所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:127所示的区域中的靶向序列。SEQIDNO:62和63所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:128所示的区域中的靶向序列。SEQIDNO:66至68所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:129所示的区域中的靶向序列。SEQIDNO:70至73所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:130所示的区域中的靶向序列。SEQIDNO:80至83所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:131所示的区域中的靶向序列。SEQIDNO:85和86所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:132所示的区域中的靶向序列。SEQIDNO:95至100所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:133所示的区域中的靶向序列。SEQIDNO:103、105和106所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:134所示的区域中的靶向序列。SEQIDNO:105和106所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:135所示的区域中的靶向序列。SEQIDNO:70和71所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:136所示的区域中的靶向序列,SEQIDNO:103至112所示的碱基序列是被包含在SEQIDNO:137所示的区域中的靶向序列。人类DMPK基因的表达调控区中每个序列的位置描述在表1和图1中。[0203] 在本发明的一个实施方式中,编码crRNA的碱基序列可以是与所述靶向序列相同的碱基序列。例如,当将SEQIDNO:5所示的靶向序列(CCCAGTCGAGGCCAAAGAAGA)引入到细胞中作为编码crRNA的碱基序列时,从所述序列转录的crRNA是CCCAGUCGAGGCCAAAGAAGA(SEQIDNO:146)并且与TCTTCTTTGGCCTCGACTGGG(SEQIDNO:147)结合,后者是与SEQIDNO:5所示的碱基序列互补的序列,并存在于人类DMPK基因的表达调控区中。在另一个实施方式中,可以使用其中缺失、替换、插入和/或添加了至少1至3个碱基的靶向序列的碱基序列作为编码crRNA的碱基序列,只要向导RNA可以将融合蛋白召集到所述靶区域即可。因此,在本发明的一个实施方式中,作为编码crRNA的碱基序列,可以使用SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的碱基序列。在本发明的另一个实施方式中,作为编码crRNA的碱基序列,可以使用SEQIDNO:63、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:63、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的碱基序列。在本发明的又一个实施方式中,作为编码crRNA的碱基序列,可以使用SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的碱基序列。在本发明的一个实施方式中,作为编码crRNA的碱基序列,可以使用SEQIDNO:83所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:83所示的碱基序列。[0204] 在本发明的一个实施方式中,可以使用SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的碱基序列作为编码crRNA的碱基序列,以分别产生包含SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的crRNA或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的crRNA的gRNA。在本发明的另一个实施方式中,所述gRNA可以包含SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列。在本发明的一个实施方式中,所述gRNA可以包含SEQIDNO:161、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:171、SEQIDNO:177、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:183或SEQIDNO:184所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:161、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:171、SEQIDNO:177、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:183或SEQIDNO:184所示的碱基序列。在本发明的另一个实施方式中,所述gRNA可以包含SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列。在本发明的又一个实施方式中,所述gRNA可以包含SEQIDNO:171所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:171所示的碱基序列。[0205] 当使用dCpf1作为所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白时,编码gRNA的碱基序列可以被设计成编码在5’‑端附连有特定RNA的crRNA的DNA序列。这种附连到crRNA的5’‑端的RNA和编码所述RNA的DNA序列可以由本领域普通技术人员根据所使用的dCpf1适合地选择。例如,当使用dFnCpf1时,可以使用其中将SEQIDNO:148AATTTCTACTGTTGTAGAT附连到靶向序列的5’‑侧的碱基序列作为编码gRNA的碱基序列(当转录成RNA时,下划线部分的序列形成碱基对,从而形成茎环结构)。所述待添加到5’‑端的序列可以是其中缺失、替换、插入和/或添加了至少1至6个碱基的通常用于各种不同Cpf1蛋白的序列,只要gRNA在转录后可以将融合蛋白召集到表达调控区即可。[0206] 当使用dCas9作为所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白时,编码gRNA的碱基序列可以被设计成其中将编码已知tracrRNA的DNA序列连接到编码crRNA的DNA序列的3’‑端的DNA序列。这种tracrRNA和编码所述tracrRNA的DNA序列可以由本领域普通技术人员根据所使用的dCas9适合地选择。例如,当使用dSaCas9时,将SEQIDNO:149所示的碱基序列用作所述编码tracrRNA的DNA序列。所述编码tracrRNA的DNA序列可以是其中缺失、替换、插入和/或添加了至少1至6个碱基的编码通常用于各种不同Cas9蛋白的tracrRNA的碱基序列,只要gRNA在转录后可以将融合蛋白召集到表达调控区即可。[0207] 包含编码以这种方式设计的gRNA的碱基序列的多核苷酸可以使用已知的DNA合成方法化学合成。[0208] 在本发明的另一个实施方式中,本发明的多核苷酸可以包含至少两个不同的碱基序列,所述碱基序列分别编码靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的gRNA。例如,所述多核苷酸可以包含至少两个不同的分别编码向导RNA的碱基序列,其中所述至少两个不同的碱基序列选自包含SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的序列的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的碱基序列。在本发明的一个实施方式中,所述多核苷酸可以包含至少两个不同的分别编码向导RNA的碱基序列,其中所述至少两个不同的碱基序列选自包含SEQIDNO:63、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的序列的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:63、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的碱基序列。在本发明的一个实施方式中,所述多核苷酸可以包含至少两个不同的分别编码向导RNA的碱基序列,其中所述至少两个不同的碱基序列选自包含SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的序列的碱基序列,或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的碱基序列。[0209] (5)启动子序列[0210] 在本发明的一个实施方式中,启动子序列可以被可操作连接到每个编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列和/或编码gRNA的碱基序列的上游。对所述可能连接的启动子没有特别限制,只要它在靶细胞中显示出启动子活性即可。可能连接到编码gRNA的碱基序列上游的启动子序列的实例包括但不限于作为polIII启动子的U6启动子、SNR6启动子、SNR52启动子、SCR1启动子、RPR1启动子、U3启动子、H1启动子和tRNA启动子等。在本发明的一个实施方式中,可以使用U6启动子作为用于所述编码向导RNA的碱基序列的启动子序列。在本发明的一个实施方式中,当多核苷酸包含分别编码向导RNA的两个或更多个碱基序列时,可以将单一启动子序列可操作连接到所述两个或更多个碱基序列的上游。在另一个实施方式中,当多核苷酸包含分别编码向导RNA的两个或更多个碱基序列时,可以将启动子序列可操作连接到所述两个或更多个碱基序列中的每一者的上游,其中所述可操作连接到每个碱基序列的启动子序列可以是相同或不同的。[0211] 作为上述可能连接到编码融合蛋白的碱基序列上游的启动子序列,可以使用遍在启动子或肌肉特异性启动子。所述遍在启动子的实例包括但不限于EF‑1α启动子、EFS启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、hTERT启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CAG启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子等。在本发明的一个实施方式中,可以使用EFS启动子、CMV启动子或CAG启动子作为所述遍在启动子。所述肌肉特异性启动子的实例包括但不限于CK8启动子、CK6启动子、CK1启动子、CK7启动子、CK9启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、α‑肌动蛋白启动子、肌球蛋白重链激酶(MHCK)启动子(例如MHCK7启动子等)、MHC启动子、肌球蛋白轻链2A启动子、肌营养不良蛋白启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、dMCK启动子、tMCK启动子、enh348MCK启动子、合成C5‑12(Syn)启动子、Myf5启动子、MLC1/3f启动子、MLC‑2启动子、MYOD启动子、Myog启动子、Pax7启动子、Des启动子、cTnC启动子等(对于肌肉特异性启动子的详情,参见US2011/0212529A1,McCarthyJJ等,SkeletalMuscle.2012年5月;2(1):8,WangB.等,GeneTher.2008年11月;15(22):1489‑99等,它们整体通过参考并入本文)。在本发明的一个实施方式中,可以使用CK8启动子、肌球蛋白重链激酶(MHCK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、合成C5‑12(Syn)启动子或Des启动子作为所述肌肉特异性启动子。在本发明的一个实施方式中,可以使用CK8启动子作为所述肌肉特异性启动子。上述启动子可以具有任何修饰和/或改变,只要它在靶细胞中具有启动子活性即可。[0212] 在本发明的一个实施方式中,使用U6作为用于编码向导RNA的碱基序列的启动子,并且可以使用CK8启动子作为用于编码所述融合蛋白的碱基序列的启动子序列。具体来说,对于U6启动子来说,可以使用下述碱基序列:(i)SEQIDNO:155所示的碱基序列,(ii)其中缺失、替换、插入和/或添加了1个或几个(例如2、3、4、5个或更多个)碱基并且在靶细胞中具有启动子活性的SEQIDNO:155所示的碱基序列,或(iii)与SEQIDNO:155所示的碱基序列具有不低于90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上)同一性并且在靶细胞中显示出启动子活性的碱基序列。对于CK8启动子来说,可以使用下述碱基序列:(i)SEQIDNO:187所示的碱基序列,(ii)其中缺失、替换、插入和/或添加了1个或几个(例如2、3、4、5个或更多个)碱基并且在靶细胞中具有启动子活性的SEQIDNO:187所示的碱基序列,或(iii)与SEQIDNO:187所示的碱基序列具有不低于90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上)同一性并且在靶细胞中显示出启动子活性的碱基序列。[0213] (6)其他碱基序列[0214] 此外,除了上述序列之外本发明的多核苷酸还可以包含已知序列例如多腺苷化(polyA)信号、Kozak共有序列等,用于提高由编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的转录产生的mRNA的翻译效率。此外,本发明的多核苷酸可以包含编码连接物序列的碱基序列、编码NLS的碱基序列和/或编码标签的碱基序列。[0215] (7)本发明的示例性实施方式[0216] 在本发明的一个实施方式中,提供了一种多核苷酸,其包含:[0217] 编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列,[0218] 用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的启动子序列,[0219] 分别编码向导RNA的一个或两个碱基序列,其中所述一个或两个碱基序列选自包含SEQIDNO:63、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的序列的碱基序列或包含其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:63、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的序列的碱基序列,和[0220] 用于所述编码gRNA的碱基序列的启动子序列,[0221] 其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是dSaCas9或dSaCas9[‑25],[0222] 其中所述转录阻遏物选自KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1和HP1A,[0223] 其中所述用于编码融合蛋白的碱基序列的启动子序列选自EFS启动子、CMV启动子、CAG启动子、CK8启动子、肌球蛋白重链激酶(MHCK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、合成C5‑12(Syn)启动子和Des启动子,并且[0224] 其中所述用于编码gRNA的碱基序列的启动子序列选自U6启动子、SNR6启动子、SNR52启动子、SCR1启动子、RPR1启动子、U3启动子和H1启动子。[0225] 在本发明的一个实施方式中,提供了一种多核苷酸,其包含:[0226] 编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列,[0227] 用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的CK8启动子,[0228] 分别编码向导RNA的一个或两个碱基序列,其中所述一个或两个碱基序列选自包含SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的序列的碱基序列或包含其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的序列的碱基序列,和[0229] 用于所述编码向导RNA的碱基序列的U6启动子,[0230] 其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是dSaCas9,并且[0231] 其中所述转录阻遏物是KRAB。[0232] 在本发明的一个实施方式中,提供了一种多核苷酸,其包含:[0233] 编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列,[0234] 用于所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列的CK8启动子,[0235] 编码向导RNA的碱基序列,所述编码向导RNA的碱基序列包含SEQIDNO:83所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:83所示的碱基序列,和[0236] 用于所述编码向导RNA的碱基序列的U6启动子,[0237] 其中所述核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白是dSaCas9,并且其中所述转录阻遏物是KRAB。[0238] 在本发明的多核苷酸的实施方式中,所述多核苷酸以从5’末端起的顺序包含(i)所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列和(ii)所述编码gRNA的碱基序列。在另一个实施方式中,所述多核苷酸以从5’末端起的顺序包含(ii)所述编码gRNA的碱基序列和(i)所述编码核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白的碱基序列。[0239] 2.载体[0240] 本发明提供了一种包含本发明的多核苷酸的载体(在后文中有时被称为“本发明的载体”)。本发明的载体可以是质粒载体或病毒载体。[0241] 当本发明的载体是质粒载体时,对所使用的质粒载体没有特别限制,并且可以是任何质粒载体例如克隆质粒载体和表达质粒载体。所述质粒载体通过使用已知方法将本发明的多核苷酸插入到质粒载体中来制备。[0242] 当本发明的载体是病毒载体时,所使用的病毒载体的实例包括但不限于腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、反转录病毒载体、仙台病毒载体等。在本说明书中,“病毒载体”还包括其衍生物。考虑到在基因疗法中的使用,优选地使用AAV载体,因为它可以长时间表达转入基因,并且它源自于非致病性病毒并具有高安全性。[0243] 包含本发明的多核苷酸的病毒载体可以通过已知方法来制备。简单来说,制备其中已插入本发明的多核苷酸的用于病毒表达的质粒载体,将所述载体转染到适合的宿主细胞中以允许包含本发明的多核苷酸的病毒载体的瞬时生产,并收集所述病毒载体。[0244] 在本发明的一个实施方式中,当使用AAV载体时,对所述AAV载体的血清型没有特别限制,只要可以在所述对象中阻遏人类DMPK基因的表达即可,并且可以使用AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10等中的任一者(对于AAV的各种不同血清型,参见例如WO2005/033321和EP2341068(A1),它们整体通过参考并入本文)。在本发明的另一个实施方式中,也可以使用从猴分离的AAV(例如AAVrh74(参见MolTher.2017年4月5日;25(4):855‑869等,其整体通过参考并入本文)、从猪分离的AAV(例如AAVpo1(例如参见GeneTher.2009年11月;16(11):1320‑8,其整体通过参考并入本文))、作为AAV1、AAV2、AAV8和AAV9的预测祖先的Anc80(参见CellRep.2015年8月11日;12(6):1056‑68,其整体通过参考并入本文)等,只要可以在所述对象中阻遏人类DMPK基因的表达即可。AAV变体的实例包括但不限于具有修饰的衣壳的新血清型(例如WO2012/057363,其整体通过参考并入本文)等。例如,在本发明的一个实施方式中,可以使用对肌肉细胞具有提高的感染力的具有修饰的衣壳的新血清型,例如AAV587MTP、AAV588MTP、AAV‑B1、AAVM41等(参见Yu等,GeneTher.2009年8月;16(8):953‑62,Choudhury等,MolTher.2016年8月;24(7):1247‑57,和Yang等,ProcNatlAcadSciUSA.2009年3月10日;106(10):3946‑51,它们整体通过参考并入本文)。[0245] 在制备AAV载体时,可以使用已知的方法例如(1)使用质粒的方法,(2)使用杆状病毒的方法,(3)使用单纯性疱疹病毒的方法,(4)使用腺病毒的方法或(5)使用酵母的方法(例如ApplMicrobiolBiotechnol.2018;102(3):1045–1054等,其整体通过参考并入本文)。例如,当通过使用质粒的方法制备AAV载体时,首先制备在野生型AAV基因组序列的两个末端处包含反向末端重复序列(ITR)并插入本发明的多核苷酸以代替编码Rep蛋白和衣壳蛋白的DNA的载体质粒。另一方面,将对于形成病毒粒子来说必需的编码Rep蛋白和衣壳蛋白的DNA插入到其他质粒中。此外,制备包含对于AAV的增殖来说必需的负责腺病毒的辅助作用的基因(E1A、E1B、E2A、VA和E4orf6)的质粒作为腺病毒辅助质粒。这三种质粒在宿主细胞中的共转染导致在所述细胞中产生重组AAV(即AAV载体)。作为宿主细胞,优选地使用能够提供负责上述辅助功能的基因的一部分基因产物(蛋白质)的细胞(例如293细胞等)。当使用此类细胞时,在上述腺病毒辅助质粒中不必携带编码可以由所述宿主细胞提供的蛋白质的基因。所述产生的AAV载体存在于培养基和/或细胞中。因此,通过在使用冻融等破坏所述宿主细胞后从培养基收集所述病毒,然后通过使用氯化铯的密度梯度超速离心方法、柱方法等对所述病毒级分进行分离和纯化,来制备所需AAV载体。[0246] AAV载体在安全性、基因转导效率等方面具有极大优势,并被用于基因疗法。然而,已知可以被包装的多核苷酸的尺寸受到限制。例如,在本发明的一个实施方式中,包括包含编码dSaCas9与KRAB的融合蛋白的碱基序列、编码靶向人类DMPK基因的表达调控区的gRNA的碱基序列和作为启动子序列的CK8启动子序列和U6启动子序列以及ITR区的多核苷酸的碱基长度在内的全长为约4.9kb,并且所述多核苷酸可以被携带在单一AAV载体中。[0247] 3.用于治疗或预防DM1的药物组合物[0248] 本发明还提供了一种包含本发明的多核苷酸或本发明的载体的药物组合物(在后文中有时被称为“本发明的药物组合物”)。本发明的药物组合物可用于治疗或预防DM1。[0249] 本发明的药物组合物包含本发明的多核苷酸或本发明的载体作为活性成分,并且可以被制备成包含此类活性成分(即本发明的多核苷酸或本发明的载体)以及通常可药用载体的制剂。[0250] 在一个实施方式中,本发明的药物组合物被肠胃外给药,并且可以局部或系统性给药。本发明的药物组合物可以通过例如但不限于静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、腹膜内给药或肌肉内给药来给药。[0251] 对给药到对象的本发明的药物组合物的剂量没有特别限制,只要它是对所述治疗和/或预防来说有效的量即可。它可以根据活性成分、剂型、对象的年龄和体重、给药日程安排、给药方法等适合地优化。[0252] 在本发明的一个实施方式中,本发明的药物组合物不仅可以给药到患有DM1的对象,而且可以预防性给药到基于遗传背景分析等可能在将来发展出DM1的对象。在本说明书中,术语“治疗”除了疾病的治愈之外还包括疾病的缓解。此外,术语“预防”除了预防疾病的发作之外还可以包括延迟疾病的发作。本发明的药物组合物也可以被称为“本发明的药剂”等。[0253] 4.治疗或预防DM1的方法[0254] 本发明还提供了一种治疗或预防DM1的方法,所述方法包括向需要的对象给药本发明的多核苷酸或本发明的载体(在后文中有时被称为“本发明的方法”)。此外,本发明包括本发明的多核苷酸或本发明的载体,其用于治疗或预防DM1。此外,本发明包括本发明的多核苷酸或本发明的载体的用途,其用于制造治疗或预防DM1的药物组合物。[0255] 本发明的方法可以通过将上述本发明的药物组合物给药到患有DM1的对象来实践,并且剂量、给药途径、对象等与上文提到的相同。[0256] 在使用本发明的方法的治疗开始之前以及治疗后的任何时间点,可以进行症状的测量以确定所述对象对所述治疗的响应。[0257] 本发明的方法可以改善DM1的任何症状例如骨骼肌和/或心肌的功能,但不限于此。对功能待改善的肌肉或组织没有特别限制,并且可以提到的是任何肌肉和组织和肌肉群。[0258] 5.核糖核蛋白[0259] 本发明提供了一种包含下述组分的核糖核蛋白(在后文中有时被称为“本发明的RNP”):[0260] (c)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白,和[0261] (d)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA。[0262] 对于包含在本发明的RNP中的核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白、转录阻遏物和向导RNA来说,可以使用在上述“1.多核苷酸”章节中详细解释的核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白、转录阻遏物和向导RNA。包含在本发明的RNP中的核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白,可以通过例如将编码所述融合蛋白的多核苷酸引入到细胞、细菌或其他生物体中以允许表达或通过使用所述多核苷酸的体外翻译系统来产生。此外,包含在本发明的RNP中的向导RNA可以通过例如化学合成或使用编码所述向导RNA的多核苷酸的体外转录系统来产生。将由此制备的融合蛋白和向导RNA混合,以制备本发明的RNP。如有必要,可以混合其他物质例如金粒子。为了将本发明的RNP直接递送到靶细胞、组织等,可以通过已知方法将所述RNP包封在脂质纳米粒子(LNP)中或装载在细胞外囊泡中。本发明的RNP可以通过已知方法引入到靶细胞、组织等中。例如,对于在LNP中的包封和引入方法而言,可以参考LeeK.等,NatBiomedEng.2017;1:889–901,WO2016/153012等,所述文献整体通过参考并入本文。[0263] 在本发明的一个实施方式中,包含在本发明的RNP中的向导RNA靶向存在于人类19号染色体(Chr19)的GRCh38.p12位置中的45,778,884‑45,783,985区域中的连续的18至24个核苷酸长度,优选为18至23个核苷酸长度,更优选为18至22个核苷酸长度。[0264] 在一个实施方式中,所述向导RNA靶向SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中连续的长度为18至24个核苷酸、优选地长度为18至23个核苷酸、更优选地长度为18至22个核苷酸的碱基序列。在另一个实施方式中,所述向导RNA靶向SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:134、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中连续的长度为18至24个核苷酸、优选地长度为18至23个核苷酸、更优选地长度为18至22个核苷酸的碱基序列。在又一个实施方式中,所述向导RNA靶向SEQIDNO:63、SEQIDNO:136、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:135、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的区域中连续的长度为18至24个核苷酸、优选地长度为18至23个核苷酸、更优选地长度为18至22个核苷酸的碱基序列。在又一个实施方式中,所述向导RNA靶向包含SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:96、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的序列的全部或一部分的区域。在本发明的另一个实施方式中,所述向导RNA靶向SEQIDNO:63、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:83、SEQIDNO:99、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:109或SEQIDNO:111所示的序列的全部或一部分的区域。在本发明的又一个实施方式中,所述向导RNA靶向包含SEQIDNO:70、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83或SEQIDNO:99所示的序列的全部或一部分的区域。在本发明的一个实施方式中,所述向导RNA靶向包含SEQIDNO:83所示的序列的全部或一部分的区域。[0265] 在本发明的一个实施方式中,可以使用包含SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185或SEQIDNO:186所示的碱基序列的向导RNA。在本发明的一个实施方式中,可以使用包含SEQIDNO:161、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:171、SEQIDNO:177、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:183或SEQIDNO:184所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:161、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:171、SEQIDNO:177、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:183或SEQIDNO:184所示的碱基序列的向导RNA。在本发明的另一个实施方式中,可以使用包含SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:164、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171或SEQIDNO:177所示的碱基序列的向导RNA。在本发明的又一个实施方式中,可以使用包含SEQIDNO:171所示的碱基序列或其中缺失、替换、插入和/或添加了1至3个碱基的SEQIDNO:171所示的碱基序列的向导RNA。[0266] 6.其他[0267] 本发明还提供了一种用于阻遏人类DMPK基因的表达的包含下述组分的组合物或药剂盒:[0268] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0269] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸。[0270] 本发明还提供了一种治疗或预防1型强直性肌营养不良症的方法,所述方法包括给药下述(e)和(f)的步骤:[0271] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0272] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸。[0273] 本发明还提供了下述(e)和(f)的用途:[0274] (e)核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白与转录阻遏物的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸,和[0275] (f)靶向人类DMPK基因的表达调控区中SEQIDNO:127、SEQIDNO:46、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:133、SEQIDNO:137、SEQIDNO:117或SEQIDNO:119所示的区域中长度为18至24个核苷酸的连续区域的向导RNA或编码所述向导RNA的多核苷酸,[0276] 其用于制造治疗或预防DM1的药物组合物。[0277] 对于本发明中的核酸酶缺陷型CRISPR效应蛋白、转录阻遏物、向导RNA以及编码它们的多核苷酸和它们被携带在其中的载体而言,可以使用在上述“1.多核苷酸”、“2.载体”和“5.核糖核蛋白”章节中详细解释的那些。上述(e)和(f)的剂量、给药途径、对象、制剂等,与在“3.用于治疗或预防DM1的药物组合物”章节中解释的那些相同。[0278] 在下面的示例性实施方式的描述过程中,本发明的其他特点将变得显而易见,提供所述示例性实施方式是为了说明本发明,并且不打算限制本发明。[0279] 实施例[0280] 实施例1.使用iCM和iDM细胞筛选用于人类DMPK基因的gRNA(1)实验方法[0281] DMPK靶向序列的选择[0282] 对人类DMPK基因的启动子区附近大约7.4kb的序列(Chr19:GRCh38.p12;45,777,342‑45,784,715)进行检索,以寻找可以被与gRNA复合的核酸酶缺陷型SaCas9(D10A和N580A突变体;dSaCas9(SEQIDNO:139))靶向的序列,其在本文中被定义为靶向序列。靶向序列最初由与具有序列NNGRRT的前间区序列邻近基序(PAM)相邻的19‑21个核苷酸的区段(5’‑19‑21nt靶向序列‑NNGRRT‑3’)指定,并进行过滤以便只包括那些与食蟹猴(Macacafascicularis)基因组的相应区域具有完美匹配(靶向序列和PAM序列)的区段(在表1中列为“TRUE”)。还选择了另外的21个核苷酸的靶向序列,它们将RNP引导到在由ENCODE项目策划的DNase‑Seq实验中表现出高的DNA酶敏感性的区域(TheENCODEProjectConsortium,Nature.2012年9月6日;489(7414):57‑74;https://www.encodeproject.org)。[0283] 慢病毒转移质粒(pED162)的构建[0284] pLentiCRISPRv2购自Genscript(https://www.genscript.com)并做出了下述修改:将SpCas9gRNA支架序列用SaCas9gRNA支架序列(SEQIDNO:150)代替;将SpCas9替换为融合到Krüppel结合框转录阻遏结构域(KRAB)的被两个NLS夹在中间的dSaCas9(SV40NLS‑dSaCas9‑NLS‑KRAB[SEQIDNO:151(DNA)和152(蛋白质)]);并将puroR表达盒用blastR表达盒[SEQIDNO:153(DNA)和SEQIDNO:154(蛋白质)]代替。dSaCas9在其N‑端(氨基酸序列由SEQIDNO:188示出,DNA序列由SEQIDNO:189示出)和C‑端(氨基酸序列由SEQIDNO:190示出,DNA序列由SEQIDNO:191示出)附连有两个核定位信号(NLS),以确保效应分子向细胞核的高效定位。当定位到启动子时,KRAB可以通过抑制转录来阻遏基因表达(GilbertLA,等,Cell,2013年7月18日;154(2):442‑51)。将KRAB连接到dSaCas9(D10A和N580A突变体)的C‑端,其在后文中被称为dSaCas9‑KRAB,并正如由靶向序列引导的靶向到人类DMPK启动子区(图1)。产生的质粒被命名为pED162。[0285] gRNA克隆[0286] 将3个非靶向性对照靶向序列(表1,SEQIDNO:1至3)和123个靶向序列(表1,SEQIDNO:4至126)克隆到pED162中。由IntegratedDNATechnologies以下述格式合成正向和反向寡核苷酸:正向:5’CACC(G)‑19‑21个碱基对的靶向序列‑3’;和反向:5’AAAC–19‑21个碱基对的反向互补靶向序列‑(C)‑3’,其中如果所述靶不始于G,则添加括号中的碱基。将寡核苷酸以100μM重悬浮在Tris‑EDTA缓冲液(pH8.0)中。将1.5μl每种互补的寡核苷酸在NE缓冲液3.1(NewEnglandBiolabs(NEB)#B7203S)中合并在50μl反应中。将所述反应在1LH2O中加热至95℃并允许其冷却至25℃,由此将具有与克隆到pED162相容的粘性末端突出端的寡核苷酸退火。将退火的寡核苷酸与已用BsmBI消化并凝胶纯化的慢病毒转移质粒pED162合并,并用T4DNA连接酶(NEB#M0202S)按照制造商的方案连接。按照制造商的方案将2μl连接反应转化到 稳定感受态细胞(NEB#C3040I)。所得到的构建物通过U6启动子(SEQIDNO:155)驱动包含由各个靶向序列编码的crRNA并在其3’末端融合有tracrRNA(GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCACGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUU)(SEQIDNO:156)的sgRNA的表达,所述tracrRNA由添加有U6聚合酶的终止信号TTTTTT的SaCas9gRNA支架序列编码。[0287] 慢病毒产生[0288] 将Lenti‑Pac293Ta细胞系(Genecopoeia#LT008)以0.8‑1.0x106个细胞/孔接种在6孔细胞培养板(VWR#10062‑892)中的2ml生长培养基(增补有10%FBS和2mM新鲜的L‑谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和MEM非必需氨基酸的DMEM培养基(ThermoFisher#11140050))中,并在37℃/5%CO2温育24小时。第二天,按照制造商的方案,使用1.5μg包装质粒混合物[1μg包装质粒(pCMVdeltaR8.2;addgene质粒号12263)和0.5μg包膜表达质粒(pCMV‑VSV‑G;addgene质粒号8454)]和1μg含有编码dSaCas9‑KRAB和所指示的sgRNA的序列的转移质粒pED162,建立TransIT‑ 转染反应(MirusBio#MIR6700)。在转染后48小时,通过将培养基上清液通过0.45μmPES滤膜(VWR#10218‑488)来收获慢病毒。[0289] iCM和iDM细胞的转导[0290] 永生化的非DM对照(对照)成肌细胞(被称为iCM)和永生化的DM1成肌细胞(被称为iDM)从InstitutdeMyologie获得,所述机构通过在整体通过参考并入本文的DisModelMech.2017年4月1日;10(4):487‑497中描述的方法建立这些细胞系。对于转导来说,将细胞6以0.05×10 个细胞/孔接种在12孔细胞培养板(VWR#10062‑894)中的1ml含有生长培养基[PromoCell骨骼肌细胞生长培养基;零件编号:C‑23160(注:培养基增补有20%FBS而不是试剂盒指导的5%,和30μg/ml庆大霉素S)]的培养基中,并在37℃/5%CO2下温育24小时。第二天,将所述培养基更换为1ml增补有10μg/ml聚凝胺(Sigma#TR‑1003‑G)的生长培养基,并向每个孔添加对应于每种sgRNA的0.3ml慢病毒上清液(参见上文),所述sgRNA包含由各个靶向序列(表1)编码并与tracrRNA融合的crRNA。将细胞与慢病毒温育48小时,然后除去病毒培养基并更换为选择培养基[增补有10μg/ml杀稻瘟菌素(ThermoFisher#A1113903)的生长培养基]。在选择培养基中温育48小时后,将三分之一的细胞(从12孔板)转移到新的孔中的生长培养基中。在允许细胞接种24小时后,将生长培养基更换为选择培养基。在选择培养基中培养48小时后,收获细胞并使用 96试剂盒(Qiagen#74182)按照制造商的指导提取RNA。[0291] 基因表达分析[0292] 对于基因表达分析来说,按照High‑CapacitycDNA反转录试剂盒(ThermoFisher#4368813)的流程在20μl体积中从0.2μg总RNA产生cDNA。将cDNA稀释10倍,并使用TMTaqman FastAdvanced主混合物(ThermoFisher#4444557)按照制造商的方案进行分析。Taqman探针(DMPK:测定IdHs01094336_m1FAM;HPRT:测定IdHs99999909_m1VIC_PL)从ThermoFisher获得。基于Taqman探针的实时PCR反应通过QuantStudio5实时PCR系统,按照TaqmanFastAdvanced主混合物方案的指导进行处理和分析。[0293] 数据分析[0294] 对于每个样品和三个对照来说,通过从来自于DMPK探针的3个技术平行样的平均Ct值中减去来自于HPRT探针的3个技术平行样的平均Ct值(平均CtDMPK‑平均CtHPRT)来‑(ΔCt)计算ΔCt值。使用公式2 为每个样品确定表达值。然后对于每个实验来说将样品表达值(表1;SEQIDNO:4‑126)归一化到3个对照表达值(表1;SEQIDNO:1至3)的平均值,来确定每个样品的相对DMPK表达。分析每个细胞系的两个生物学平行样,并计算来自于所有实验的平均值(表1)。[0295] (2)结果[0296] DMPK基因表达被RNP的阻遏[0297] 产生了将用于dSaCas9‑KRAB和针对每个靶向序列的sgRNA的表达盒递送到iCM和iDM细胞的慢病毒。对转导的细胞进行杀稻瘟菌素抗性的选择,并使用Taqman测定法对DMPK表达进行定量(表1)。将来自于每个样品的表达值归一化到用对照sgRNA(表1;SEQIDNO:1、2和3)转导的细胞中DMPK表达的平均值。计算iCM和iDM细胞系的两份平行样之间的平均表达水平(表1,所有DMPK的平均值,以及图2)。[0298] 表1用于筛选DMPK基因的表达调控区的靶向序列[0299] 表1‑1[0300][0301] 表1‑2[0302][0303] 表1‑3[0304][0305] 表1‑4[0306][0307] 表1‑5[0308][0309] 在表1中,“坐标”指示了SEQIDNO:4‑126所示的每个序列的5’末端的坐标。[0310] 30个靶向序列显示出不少于50%的DMPK表达降低(SEQIDNO:43、44、46、62、63、66、68、70、71、72、73、80、81、82、83、85、86、88、91、96、99、100、103、105、106、108、109、111、117和119),9个靶向序列显示出不少于75%的DMPK表达降低(SEQIDNO:63、70、71、83、99、105、106、109和111),并且1个靶向序列显示出不少于80%的DMPK表达降低(SEQIDNO:109)。[0311] 在上述系统抑制DMPK的表达的可能性的基础上对区域进行鉴定和表征。在1区(图3;Chr19:GRCh38.p12;45,777,342‑45,778,884)中,我们发现靶向序列在调节DMPK的表达方面无效。然而,在2区(图3;GRCh38.p12;45,778,884‑45,783,985)中,靶向dSaCas9‑KRAB能够抑制DMPK表达。正如预期,这个区域涵盖了DMPK启动子和转录起始位点,表明靶向这个区域对DMPK表达具有最大影响。最后,3区(图3;Chr19:GRCh38.p12;45,783,985‑45,784,715)对DMPK表达具有较少影响,并且更远离DMPK启动子区。[0312] 实施例2腺相关病毒(AAV)生产[0313] (1)实验方法[0314] 用于dSaCas9‑KRAB:gRNA的递送和表达以及AAV的生产的质粒的构建[0315] pAAV‑CMV购自Takara(#6230),并且EFS启动子序列(SEQIDNO:204)和带有额外的末端终止密码子的SV40NLS‑dSaCas9‑NLS‑KRAB(SEQIDNO:151)[SEQIDNO:200(DNA)和SEQIDNO:152(蛋白质)]从pED162(参见实施例1)亚克隆。b珠蛋白polyA序列(SEQIDNO:201)、U6启动子序列(SEQIDNO:202)和SaCas9gRNA支架序列(SEQIDNO:150)从pED0001(SEQIDNO:203)亚克隆,因此代替了ITR之间编码pAAV‑CMV的所有功能性组分(即CMV启动子、β‑珠蛋白内含子、MCS和hGHpolyA)的序列。最后,通过限制性克隆(XhoI和AgeI)将EFS启动子用CK8启动子(SEQIDNO:187)代替,得到质粒pED148。SEQIDNO:83、70、81或99所示的靶向序列通过将pED148用BsaI消化,由此产生与退火的合成寡核苷酸相容的突出端来克隆。合成寡核苷酸被设计成使得正向引物在5’末端具有CACC(G)序列[5’CACC‑(G)‑靶向序列–3’],并且反向引物在5’末端含有额外的AAAC序列[5’AAAC–反向互补的靶向序列–(C)‑3’]。将额外的G添加到靶向序列的起点,以增强从U6启动子的表达。产生的质粒分别被命名为pED148‑h695(包含SEQIDNO:83所示的靶向序列)、pED148‑h245(包含SEQIDNO:70所示的靶向序列)、pED148‑h257(包含SEQIDNO:81所示的靶向序列)和pED148‑h269(包含SEQIDNO:99所示的靶向序列)。[0316] 腺相关病毒(AAV)的生产[0317] 腺相关病毒血清型9(AAV9)粒子使用以每个Hyperflask(Corning#10030)0.86×710个细胞的密度接种并在增补有10%FBS的DMEM培养基(Sigma#D5796)中培养的293T细胞(ATCC#CRL‑3216)产生。在接种后4天,将培养基更换成增补有2%FBS和63mMHEPES(Gibco#15630‑080)的DMEM培养基。pRC9质粒如下所述来构建:将AAV9衣壳序列(参见JP5054975B)亚克隆到pRC2‑mi342载体(Takara#6230)中,代替AAV2衣壳序列。每个Hyperflask使用388μl 体外DNA转染试剂(Polyplus#115‑010),将细胞用135μgpRC9质粒、121μg包含在无辅助载体系统中的pHelper载体(Takara#6230)和133μgpED148‑h695之一转染。3天后,向Hyperflask添加0.2%TritonX‑100并收获细胞。[0318] 在收获后,使用筒式过滤器(GEHealthcare#KGF‑A‑0506GG、KMP‑HC9206GG)将其TM上清液和细胞裂解液澄清。在澄清后,使用750kD的Xampler 超滤筒(GEHealthcare#UFP‑750‑C‑6MA),使用中空纤维将它用切向流过滤进行超滤。在减小体积后,对样品进行亲和层TM TM析(POROS CaptureSelect AAVX亲和树脂(ThermoFisherScientific#A36739))以纯化AAV。在亲和层析步骤后,对洗脱的样品进行密度梯度离心,以将AAV与中间体AAV粒子分离开。使用磷酸盐缓冲盐水的透析,对使用CsCl密度梯度离心分离的AAV粒子进行缓冲液交换。在缓冲液交换后,使用 Ultra‑4离心过滤装置(Merck millipore#UFC801024)将AAV样品浓缩,并使用0.22μmMillex‑GV注射器过滤装置(Merckmillipore#SLGV033RS)除菌。使用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN#69506)纯化AAV基因组。纯化的AAV基因组的滴度使用 滴定试剂盒(用于实时PCR)(Takara#6233)来测量。得到的AAV被命名为AAV9‑695。[0319] 使用pED148‑h245、pED148‑h257或pED148‑h269如上所述制造AAV,并分别命名为AAV9‑245、AAV9‑257和AAV9‑269。AAV9‑695、AAV9‑245和AAV9‑257中的每一者被制造两次并用于体外和体内实验。[0320] (2)结果[0321] 所述AAV的基因组滴度示出在表2中。[0322] 表2[0323]AAV名称 浓度(vg/mL) 批次号12AAV9‑695 2.8x10 批次112AAV9‑245 3.6x10 批次112AAV9‑257 4.5x10 批次112AAV9‑269 5.5x10 批次113AAV9‑695 3.6x10 批次213AAV9‑245 3.7x10 批次213AAV9‑257 4.6x10 批次2[0324] 实施例3.带有编码dSaCas9、转录阻遏物和sgRNA的碱基序列的重组AAV9对DMPK基因阻遏的体外药理学评估[0325] (1)实验方法[0326] 细胞培养和AAV感染[0327] 将iCM细胞悬浮在骨骼肌细胞培养基(Promocell#C23060)中(注:培养基增补有20%FBS而不是由试剂盒指导的5%以及50μg/ml庆大霉素S),并以每孔900μl培养基中20,000个细胞的密度接种在I型胶原蛋白包被的24孔板(IWAKI#4820‑010)中。对于AAV感染来12说,向培养基添加含有2.8、3.6、4.5或5.5×10 vg/ml的AAV9‑695、AAV9‑245、AAV9‑257或TMAAV9‑269的100μl含有0.001%Pluronic F‑68(GEhealthcare#SH30594.01)的PBS,并在37℃/5%CO2下培养和温育2天。对于对照孔来说,向培养基添加100μl含有0.001%PluronicF‑68的PBS。所述实验进行一式三份。将培养基用更换为分化培养基(增补有10μg/ml胰岛素(Sigma#I9278)的DMEM培养基(ThermoFisher#61965‑026)),并将细胞在37℃和5%CO2下培养4天。在用500μlPBS清洗后,使用RNeasyPlus小量试剂盒(Qiagen#74134)按照制造商的说明书提取总RNA。将来自于未用AAV感染的细胞的RNA设置为对照,并在图4中显示为对照。[0328] 基因表达分析[0329] 对于TaqmanqPCR来说,使用SuperScriptTMVILOTMcDNA合成试剂盒(ThermoFisher#11754250)在20μl反应体积中将80ng总RNA转变成cDNA。将所述cDNA用水稀释160TM倍,并将2μl用于qPCR。qPCR使用QuantStudio 12KFlex实时PCR系统(ThermoFisher),在含有用于DMPK(ThermoFisher#Hs01094329_m1,FAM)或GAPDH(ThermoFisher#TMHs99999905_m1,FAM)的Taqman探针和Taqman 基因表达主混合物(ThermoFisher#4369016)的5μl终体积中运行。所述qPCR循环条件如下:50℃2分钟后95℃10分钟,然后是TM45个95℃15秒和60℃1分钟的循环。数据使用QuantStudio 12KFlex软件(ThermoFisher)进行分析。表达值使用每个基因的标准曲线来分析,并将DMPK基因的表达水平归一化到GAPDH基因的表达水平。[0330] (2)结果[0331] 通过将AAV9‑695、AAV9‑245、AAV9‑257或AAV9‑269施加到iCM细胞中,发现了DMPKmRNA的下调,这表明带有dSaCas9、KRAB和包含由SEQIDNO:83、70、81或99所示的靶向序列编码的crRNA的sgRNA的转入基因的AAV9在人类肌细胞中对DMPK下调具有药理作用(图4)。[0332] 实施例4.在DMSXL小鼠中抑制DMPK基因表达[0333] (1)实验方法[0334] 动物处理[0335] 将AAV9‑695、AAV9‑245或AAV9‑257静脉内注射到DMSXL纯合小鼠(被称为DMSXL小鼠),即带有人类DM1基因座和>1,000CTG的非常大的扩增的转基因小鼠(PLoSGenet.2012;8(11):e1003043)中(总共n=4,其中雄性n=2并且雌性n=2)。剂量如下:对于AAV9‑695、13 13 14AAV9‑245和AAV9‑257来说分别为1.5×10 vg/kg、5×10 vg/kg、1.5×10 vg/kg和5×1410 vg/kg。作为对照,注射含有0.001%PluronicF‑68(GEhealthcare#SH30594.01)的PBS。4周后将DMSXL小鼠处死并从这些小鼠收集样品(胫前肌(TA)、心脏和肝脏)。如下所述对这些样品进行基因表达分析。在进行RNA提取之前将样品储存在‑80℃冷冻室中。[0336] RNA提取和基因表达分析[0337] 使用TissueLyserII(Qiagen)将组织样品在1mlISOGEN(NIPPONGENE#319‑90211)中匀浆。在离心分离后,将700μl上清液转移到含有150μl氯仿(Wako#034‑02603)的1.5ml管中。在涡旋振荡和离心后,将187μl水层添加到150μl异丙醇(WAKO#166‑04836)中并混合。将所述RNA提取物转移到 Plus小量试剂盒(QIAGEN#74134)的RNeasy离心柱,并按照制造商的方案进一步纯化。[0338] 对于TaqmanqPCR来说,使用SuperScriptTMVILOTMcDNA合成试剂盒(ThermoFisher#11754250)在20μl反应体积中将700‑1,000ng总RNA转变成cDNA。将所述cDNA用水稀TM释20倍,并将3‑4μl用于qPCR。qPCR使用QuantStudio 12KFlex实时PCR系统(ThermoFisher),在含有用于DMPK(ThermoFisher#Hs01094329_m1,FAM)或GAPDH(ThermoFisher#TMMm99999915_g1,FAM)的Taqman探针和Taqman 基因表达主混合物(ThermoFisher#4369016)的10μl终体积中运行。所述qPCR循环条件如下:50℃2分钟后95℃10分钟,然后TM是40‑45个95℃15秒和60℃1分钟的循环。数据使用QuantStudio 12KFlex软件(ThermoFisher)进行分析。表达值使用每个基因的标准曲线来分析,并将DMPK基因的表达水平归一化到GAPDH基因的表达水平。[0339] (2)结果[0340] AAV9‑695、AAV9‑245和AAV9‑257在小鼠中表达每个转入基因。在肝脏中没有但在骨骼肌和心肌中发现DMPKmRNA下调,这表明带有dSaCas9、KRAB和包含由SEQIDNO:83、70或81所示的靶向序列编码的crRNA的sgRNA的转入基因的AAV9在DMSXL小鼠中对DMPK下调具有药理作用(图5‑7)。[0341] 实施例5.通过向DMSXL小鼠给药AAV9‑695改善RNA灶点形成(1)实验方法[0342] 荧光原位杂交:FISH[0343] AAV9‑695(5×1014vg/kg)或作为对照的介质(含有0.001%PluronicF‑68的PBS)向DMSXL小鼠的给药如实施例4中所述来进行。在给药后4周,切下并收集DMSXL小鼠的胫前肌(TA)。在立即包埋在Tissue‑ O.C.T.Compound(SakuraFinetekJapan,#4583)中之后,将组织在液氮中预冷的冷异戊烷中冷冻并储存在‑80℃。[0344] 通过低温切片机制备10μm的冷冻组织切片,并将所述薄切片置于玻璃载片上。将所述载片空气干燥,并用4%聚甲醛在室温固定15分钟,用PBS清洗两次,每次2分钟,并储存在4℃下。[0345] 在含有2%丙酮的PBS中在室温温育5分钟后,将所述载片在含有30%甲酰胺的2×盐水柠檬酸钠缓冲液(SSC)(300mMNaCl和30mM柠檬酸钠)中在室温下温育10分钟。将载片在探针溶液(0.02%牛血清白蛋白(SIGMA#A7030‑100G),0.066mg/ml酵母tRNA(ThermoFisher#15401‑011),2mM核糖核苷氧钒复合物(SIGMA#R3380‑5ML)和1ng/μlCy3‑(CAG)5‑2’‑OMe探针(y_C(M)A(M)G(M)C(M)A(M)G(M)C(M)A(M)G(M)C(M)A(M)G(M)C(M)A(M)G(M),y意味着Cy3并且N(M)意味着2’‑OMeRNA。该探针由GeneDesign,Inc.,Japan合成),在含有30%甲酰胺的2×SSC中)中在37℃温育2小时。在杂交后,除去所述探针溶液,并将载片在含有30%甲酰胺的2×SSC中在50℃温育30分钟。将载片用1×SSC清洗一次,并在1×SSC中在室TM温温育30分钟。将载片用PBS清洗三次,每次10分钟,并向载片添加含有DAPI的ProLong Diamond抗褪色封固剂(ThermoFisher#P36971)。将载片用盖片覆盖并储存在4℃。[0346] 使用激光共聚焦显微镜LSM700(ZEISS)观察RNA灶点的形成。[0347] (2)结果[0348] 用介质或AAV9‑695给药的DMSXL小鼠的TA肌肉切片的典型图像示出在图8中。箭头指示RNA灶点(RNA灶点被定义为位于染为蓝色的核中的可清楚地检测的红点)。[0349] 与介质给药的DMSXL小鼠的TA肌肉相比,在AAV9‑695给药的DMSXL小鼠的TA肌肉中观察到的RNA灶点数目较低,表明在DMSXL小鼠中AAV9‑695给药改善RNA灶点形成。[0350] 实施例6.在表达hDMPKsgRNA的iDM细胞中DMPK基因表达的抑制[0351] (1)实验方法[0352] 慢病毒产生[0353] 将Lenti‑XTM293T细胞(Takara#632180)以5×106个细胞/培养皿接种在I型胶原蛋白包被的100mm培养皿(IWAKI#4020‑010)中的10ml增补有10%FBS和MEM非必需氨基酸溶液(ThermoFisher#11140050)的DMEM(ThermoFisher#10569‑010)中,并在37℃/5%CO2下温育过夜。第二天,按照制造商的方案,使用7μg慢病毒高滴度包装混合物(Takara#6194)和5.5μg含有编码dSaCas9‑KRAB和SEQIDNO:1或83所示的指定靶向序列的序列的转移质粒TMpED162(实施例1),建立Lipofectamine 3000转染试剂(ThermoFisher#L3000008)。质粒如表3中所述命名。在转染后48小时,通过将培养基上清液通过0.45μm滤器,收获10ml含有TM慢病毒的培养基。为了浓缩病毒溶液,添加1/4体积的PEG‑it 病毒沉淀溶液(SBI#LV810A‑1),并在4℃温育过夜。将上清液以1,500×g离心30分钟。在舍弃上清液后,向管添加200μlDMEM,将病毒溶液轻柔地重悬浮,并储存在‑80℃下。[0354] 表3[0355]质粒 SEQIDNOpED162‑C1 1pED162‑695 83TM[0356] 使用 RNA病毒(MACHEREY‑NAGEL#740956.250)和Lenti‑X qRT‑10 10PCR滴定试剂盒(Clontech#631235)测量,慢病毒滴度在5×10 至7×10 个粒子/ml的范围内。[0357] iDM细胞的转导[0358] 将iDM细胞以50,000个细胞/孔接种在I型胶原蛋白包被的12孔板(IWAKI#4815‑010)中的1ml含有生长培养基[PromoCell骨骼肌细胞生长培养基;零件编号:C‑23160(注:培养基增补有20%FBS而不是试剂盒指导的5%,和50μg/ml庆大霉素S)]的培养基中,并在37℃/5%CO2下温育过夜。第二天,将所述培养基更换为1ml增补有5μg/ml聚凝胺(Sigma#TR‑1003‑G)的生长培养基,并向每个孔添加对应于每种sgRNA的0.3ml慢病毒上清液(参见上文),所述sgRNA包含由各个靶向序列(SEQIDNO:1或83)编码并与tracrRNA融合的crRNA。将细胞与慢病毒温育48小时,然后除去病毒培养基并更换为选择培养基[增补有10μg/ml杀稻瘟菌素(Nacalai#03759‑71)的生长培养基]。在选择培养基中温育24小时后,将三分之一的细胞转移到具有生长培养基的新的孔中。在允许细胞接种72小时后,将生长培养基更换为选择培养基。在选择培养基中培养48小时后,收获细胞并储用。[0359] iCM细胞的转导[0360] 将iCM细胞以50,000个细胞/孔接种在I型胶原蛋白包被的6孔板(IWAKI#4810‑010)中的2ml含有生长培养基[PromoCell骨骼肌细胞生长培养基;零件编号:C‑23160(注:培养基增补有20%FBS而不是试剂盒指导的5%,和50μg/ml庆大霉素S)]的培养基中,并在37℃/5%CO2下温育过夜。第二天,将所述培养基更换为2ml增补有5μg/ml聚凝胺(Sigma#9TR‑1003‑G)的生长培养基,并向每个孔添加对应于对照sgRNA的2×10vg慢病毒上清液(参见上文),所述对照sgRNA包含由单个靶向序列(SEQIDNO:1)编码并与tracrRNA融合的crRNA。将细胞与慢病毒温育48小时,然后除去病毒培养基并更换为选择培养基[增补有10μg/ml杀稻瘟菌素(Nacalai#03759‑71)的生长培养基]。在选择培养基中温育24小时后,将三分之二的细胞转移到具有生长培养基的I型胶原蛋白包被的100mm培养皿(iwaki#4020‑010)中。在允许细胞接种72小时后,将生长培养基更换为选择培养基。在选择培养基中培养48小时后,收获细胞并储用。[0361] 细胞培养、RNA提取和cDNA制备[0362] 将分别被称为iDM‑695细胞(iDM_695)、iDM‑对照细胞(iDM_对照)和iCM‑对照细胞(iCM_对照)的表达dSaCas9和包含由SEQIDNO:83所示的靶向序列编码的crRNA的hDMPKsgRNA的iDM细胞、表达dSaCas9和包含由SEQIDNO:1所示的靶向序列编码的crRNA的对照sgRNA的iDM细胞和表达dSaCas9和包含由SEQIDNO:1所示的靶向序列编码的crRNA的对照sgRNA的iCM细胞,以每孔500μl中25,000个细胞或1ml中50,000个细胞的密度接种在I型胶原蛋白包被的24孔板(IWAKI#4820‑010)中的增补有20%非热失活FBS的骨骼肌细胞生长培养基(Promocell#C23060)中,并在37℃/5%CO2下温育2天(以50,000个细胞/孔接种)或3天(以25,000个细胞/孔接种)。[0363] 在用200μLPBS清洗后,使用RNeasy小量试剂盒(Qiagen#74106)按照制造商的说明书提取总RNA。[0364] 按照制造商的说明书使用SuperScriptTMVILOTMcDNA合成试剂盒(ThermoFisher#11754‑250)将500ng总RNA转变成cDNA。将所述cDNA储存在‑20℃下。[0365] 基因表达分析[0366] 将cDNA用水稀释100倍,并将2μl用于qPCR。qPCR使用ViiA7实时PCR系统(ThermoFisher),在含有用于DMPK(ThermoFisher#Hs01094329_m1,FAM)或GAPDH(ThermoFisher#Hs99999905_m1,FAM)的Taqman探针和Taqman基因表达主混合物(ThermoFisher#4369016)的10μl终体积中运行。qPCR条件如下:使用50℃2分钟和95℃10分钟预热,然后是45个循环的95℃15秒和60℃1分钟。表达值使用每个基因的标准曲线来分析,并将DMPK基因的表达水平归一化到GAPDH基因的表达水平。[0367] (2)结果[0368] iDM‑695细胞和iDM‑对照细胞中DMPK基因的表达示出在图9中。[0369] 在表达hDMPKsgRNA的iDM细胞中DMPK基因表达被抑制。实施例7.在表达hDMPKsgRNA的iDM细胞中RNA灶点形成的改善(1)实验方法[0370] 荧光原位杂交:FISH[0371] 将在实施例6中构建的iDM‑695细胞、iDM‑对照细胞和iCM‑对照细胞以每孔2,500个细胞或5,000个细胞的密度一式四份接种在胶原蛋白包被的96孔板(ThermoFisherScientific#152038)中的增补有20%非热失活FBS的骨骼肌细胞生长培养基(Promocell#C23060)中,并在37℃/5%CO2下温育2天(以5,000个细胞/孔接种)或3天(以2,500个细胞/孔接种)。[0372] 将所述细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗两次,用4%聚甲醛在室温固定15分钟,用PBS清洗两次,并储存在4℃下。[0373] 在含有0.2%TritonX‑100的PBS中在室温温育10分钟后,将细胞清洗并在含有40%甲酰胺的2×SSC中在室温温育10分钟。向每个孔添加50μl探针溶液(0.02%牛血清白蛋白(SIGMA#A7030‑100G),0.066mg/ml酵母tRNA(ThermoFisherScientific#15401‑011),2mM核糖核苷氧钒复合物(SIGMA#R3380‑5ML)和0.1ng/μlCy3‑(CAG)5‑LNA探针(y_5(L)A(L)G(L)cagcagcag5(L)A(L)G(L),y意味着Cy3,5(L)意味着LNA‑mC,N(L)意味着LNA,并且小写字母意味着DNA。该探针由GeneDesign,Inc.合成),在含有40%甲酰胺的2×SSC中),并将细胞在37℃温育2小时。在杂交后,除去所述探针溶液,并将细胞在含有40%甲酰胺的2×SSC中在37℃温育30分钟。将细胞用1×SSC清洗一次,并在1×SSC中在室温温育30分钟。向每个孔添加50μl含有2μg/mlDAPI(Dojindo#340‑07971)的PBS,并将细胞在室温温育30分钟。将细胞用PBS在室温下清洗两次,每次5分钟,并储存在4℃下。[0374] 使用INCellAnalyzer6000(GEhealthcare)检测并分析RNA灶点的形成。捕获每个孔中9个点的图像,并对每个图像中RNA灶点阳性核的数目和核的总数进行计数。分析每个孔中灶点阳性核的比率并计算平均值。[0375] (2)结果[0376] iDM‑695细胞和iDM‑对照细胞的典型图像示出在图10A中。[0377] 每个孔中灶点阳性核的比率示出在图10B中。[0378] 与iDM‑对照细胞相比,iDM‑695细胞中RNA灶点阳性核的比率较低。[0379] 实施例8.在表达hDMPKsgRNA的iDM细胞中剪接缺陷的改善(1)实验方法[0380] 剪接分析[0381] 来自于iDM‑695细胞、iDM‑对照细胞和iCM‑695细胞的cDNA的制备描述在实施例6中。[0382] 使用 GXLDNA聚合酶(TaKaRa#R050A),按照制造商的说明书进行PCR。将cDNA用水稀释10倍并使用1μl。使用的PCR引物如下:[0383] 表4[0384][0385] PCR循环条件如下:35个循环的98℃10秒、60℃15秒和68℃30秒,然后72℃7分钟。[0386] 将PCR产物载样到AgilentDNA1000试剂盒(Agilent#5067‑1504)上,电泳,并使用Agilent2100BioAnalyzer系统按照制造商的说明书进行分析。[0387] 测量正常和异常剪接产物的峰的AUC,并计算每种细胞中正常剪接产物的比率。[0388] (2)结果[0389] 每个基因即DMD、MBNL1、KIF13A和TNNT2的凝胶图像和外显子模式示出在图11A中。[0390] 每种细胞中正常剪接产物的比率示出在图11B中,所述正常剪接产物在iCM细胞中更加丰富并且在iDM细胞中较少。[0391] 在iDM‑695细胞中所有测试的基因的剪接缺陷得以改善。[0392] 在本文中陈述数值限度或范围的情况下,端点被包括在内。此外,在数值限度或范围之内的所有值和子范围被具体包含在内,如同被明确写出那样。[0393] 当在本文中使用时,单数指称带有“一个或多个”的含义。[0394] 显然,根据上述教导,本发明的大量修改和变化是可能的。因此应当理解,在权利要求书的范围内,本发明可以不同于本文中具体描述的方式实施。[0395] 上文中提到的所有专利和其他参考文献整体通过参考并入本文,如同被详细阐述的那样。[0396] 工业实用性[0397] 根据本发明,可以在源自于DM1患者的细胞和DM1模型小鼠中抑制DMPK基因的表达。因此,预计本发明对DM1的治疗和/或预防极其有用。

专利地区:日本

专利申请日期:2020-05-27

专利公开日期:2024-06-18

专利公告号:CN113785066B

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