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一种与肝癌相关的血清tsRNA标志物、探针及其应用

更新时间:2024-07-01
一种与肝癌相关的血清tsRNA标志物、探针及其应用 专利申请类型:发明专利;
地区:江苏-南京;
源自:南京高价值专利检索信息库;

专利名称:一种与肝癌相关的血清tsRNA标志物、探针及其应用

专利类型:发明专利

专利申请号:CN202110859706.3

专利申请(专利权)人:南京大学
权利人地址:江苏省南京市栖霞区仙林大道163号

专利发明(设计)人:王延博,詹守斌,王清颜

专利摘要:本发明公开了一种与肝癌相关的血清tsRNA标志物及其应用,属于分子生物学领域。该标志物为血清中的tRF‑Gln‑TTG‑006。本发明筛选出的tsRNA对肝癌病人检测的特异性和灵敏度较高,可以大大提高肝癌诊断的准确性。该标志物可用于制备诊断试剂盒,用于肝癌的辅助早期诊断。

主权利要求:
1.血清tsRNA作为诊断标志物在肝癌诊断试剂盒制备中的应用,所述的血清tsRNA标志物为以下序列:tRF‑Gln‑TTG‑006:SEQIDNo.1。
2.能特异性捕获血清tsRNA标志物的探针在肝癌诊断试剂盒制备中的应用,所述的血清tsRNA标志物为以下序列:tRF‑Gln‑TTG‑006:SEQIDNo.1。 说明书 : 一种与肝癌相关的血清tsRNA标志物、探针及其应用
发明领域[0001] 本发明属于分子生物学领域,涉及一种与肝癌相关的血清tsRNA标志物、探针及其应用。背景技术[0002] 肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)占原发性肝癌的比例最高,到2020年,HCC在全球肿瘤相关死亡病例中占第三位,发病率居全球第六位。HCC仍然是包括中国在内的东亚地区的常见癌症之一,其发病率、患病率和活动性均显著高于其他地区。被诊断为早期的肝癌可以通过切除或者肝移植的方式治疗,相较于晚期肝癌5年生存率更高。目前CT、超声、MRI等影像学技术已被应用于HCC的早期诊断,但这些技术很难发现直径≤1cm的病灶,不足以在早期阶段检测HCC。临床仍然缺乏敏感的诊断方法或生物标志物,。[0003] 非编码小RNA是近年来肿瘤分子生物学研究领域的热点,RNA高通量测序技术的发展帮助人们发现和鉴定了多种新型非编码小RNA,其中一类被命名为tRNA来源的小RNA(tRNA‑derivedsmallRNAs,tsRNAs)。tsRNA长约18‑40nt,来源于tRNA成熟体或前体。近期研究发现tsRNA参与调节多种生理、病理功能,包括应激、翻译调控、神经系统疾病、病毒感染、表观遗传等等。研究发现,tsRNA与肿瘤发生发展密切相关,已经有报道发现tsRNA在肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌和急性髓细胞白血病中异常表达,与肿瘤的发生发展密切相关。[0004] RNA‑derivedsmallRNAs(tsRNAs)是一类新发现的长度约为14~40个核苷酸的非编码RNA,来源于tRNA前体和成熟tRNA。最近的研究表明,tsRNAs在乳腺癌、肺癌、B细胞淋巴瘤等多种癌症中异常表达,提示tsRNAs可能参与了这些疾病的发生和发展。tsRNA同样可以稳定的存在与血清中,血清中的循环tsRNA可以作为早期乳腺癌和头颈部鳞状细胞癌等癌症的非侵入性生物标志物。然而,血清tsRNA在肝癌无创诊断中的应用前景仍有待发掘,如果能筛选到肝癌中异常表达的血清tsRNAs作为生物标志物,并研发相应的诊断试剂盒,对肝癌的诊断现状将会有大大的推动。发明内容[0005] 本发明的主要目的是针对肝癌临床无创诊断中的问题,提出一类与肝癌相关的血清tsRNA标志物、以及该类血清tsRNA标志物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。[0006] 为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:[0007] 一种与肝癌相关的血清tsRNA标志物,所述的血清tsRNA标志物为以下序列中的中的任意一种或包含该序列的组合:[0008] tRF‑Gln‑TTG‑006:SEQIDNo.1;[0009] 本发明提供了一种探针,所述探针能特异性捕获包括上述的与肝癌相关的血清tsRNA标志物。该探针是由AppliedBiosystems公司定制合成的TaqMantsRNA探针。[0010] 本发明提供了上述的血清tsRNA标志物、探针在肝癌诊断试剂盒制备中的应用。[0011] 本发明提供了一种肝癌诊断试剂盒,所述试剂盒用于检测血清中的上述的tsRNA标志物的一种或多种的表达量。[0012] 进一步的技术方案,所述的试剂盒中包括上述的探针。[0013] 进一步的技术方案,所述的试剂盒还包括PCR反应常用的试剂和酶。[0014] 进一步的技术方案,所述的试剂盒包括dNTP/AMV逆转录酶及缓冲液、MgCl2、DEPC水和Taq酶等。[0015] 本发明的有益效果:[0016] 本发明提供的血清tsRNAs标志物作为肝癌诊断的标志物的优势在于:[0017] (1)传统肝癌的血清标注物主要是以甲胎蛋白AFP为代表的蛋白类生物标志物,检测方法主要为ELISA,相对不稳定,而血清tsRNAs是一种新型生物标志物,在肝癌病人血清中表达稳定,易于检测、定量。利用本发明提供的tsRNA进行肝癌血清无创诊断有利于对目前肝癌进行辅助诊断,将大大提高肝癌无创诊断的敏感性和特异性。[0018] (2)本发明系统的通过高通量测序及qRT‑PCR方法研究了血清tsRNAs在肝癌患者血清中的差异表达谱,进一步验证其在肝癌诊断中的应用价值。[0019] (3)本发明通过qRT‑PCR对大样本进行了多阶段验证,采用了绝对定量进行验证;保证了肝癌血清tsRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用,也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。附图说明[0020] 图1为实施例中5种tsRNAs分别对肝癌病人和健康对照组的诊断效果的ROC图。[0021] 图2为tsRNA:tRF‑Gln‑TTG‑006在肝癌病人组与健康对照组血清的表达水平。[0022] 图3为tsRNA:tRF‑Gln‑TTG‑006分别对肝癌病人和健康对照组的诊断效果的ROC图。具体实施方式[0023] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。[0024] 一种与肝癌相关的血清tsRNA标志物,所述的血清tsRNA标志物为以下序列中的中的任意一种或包含该序列的组合:[0025] tRF‑Gln‑TTG‑006:SEQIDNo.1;[0026] 一种探针,所述探针能特异性捕获包括上述的与肝癌相关的血清tsRNA标志物。该探针是由AppliedBiosystems公司定制合成的TaqMantsRNA探针。[0027] 上述的血清tsRNA标志物、探针在肝癌诊断试剂盒制备中的应用。[0028] 一种肝癌诊断试剂盒,所述试剂盒用于检测血清中的上述的tsRNA标志物的表达量。[0029] 所述的试剂盒中包括上述的探针。所述的试剂盒还包括PCR反应常用的试剂和酶。所述的试剂盒包括dNTP/AMV逆转录酶及缓冲液、MgCl2、DEPC水和Taq酶等。[0030] 本发明首先分离了肝癌病人及与病人年龄性别等信息匹配的健康对照的血清样本,提取RNA进行tsRNA测序分析,经过初步筛选后通过大样本进行验证,进而筛选出一组与肝癌高度相关的且具有较高敏感性和特异性的tsRNA标志物,并基于此研发出可应用于肝癌临床诊断的试剂盒,为肝癌的筛查和早期诊断提供基础。[0031] 本发明解决问题的技术方案包括:[0032] (1)以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血样,系统收集完整的临床病例信息资料。[0033] (2)血清tsRNA差异表达谱筛选分析:筛选肝癌患者、与肝癌患者年龄性别相匹配的健康人对照,分离血清,通过测序分析血清tsRNA表达谱,筛选出差异表达的tsRNAs并通过大样本进行多阶段验证。[0034] (3)对前面筛选到的差异表达的血清tsRNAs进行定量分析,明确与肝癌发病相关的血清tsRNAs。[0035] (4)基于以上筛选到的血清tsRNA,研发诊断试剂盒。[0036] 本发明按照SOP收集符合标准的血样,收集完整的病理学资料(包括年龄、性别、病理类型、WHO分级、TMN分期等),接着采用小RNA高通量测序、Real‑time PCR等方法进行检测。[0037] 具体来说包括以下几个部分:[0038] (1)收集病人样本:①经影像学诊断、病理学确认的肝癌病例;②所有样本为术前,未经放化疗和新辅助治疗的;③健康对照为与病人年龄性别匹配的正常人。本研究共采用100例符合标准的肝癌病人血清样本进行研究。[0039] (2)使用Trizol(Invitrogenlifetechnologies)法提取血清总RNA。[0040] (3)RNA质量检测:通过变性琼脂糖凝胶电泳检测28S和18S核糖体RNA条带。[0041] (4)小RNA高通量测序:[0042] ①将以上提取的总RNA进行PAGE电泳回收;[0043] ②tsRNAs被大量的RNA修饰,会干扰小RNAseq文库的构建。在对总RNA样本进行文库准备之前,先进行以下处理:将链接引物(adaptorprime)酶联在小RNA分子的3′与5′端:所有sRNA文库构建和深度测序均由Aksomics(中国上海)完成。测序文库的大小选择用于RNA生物类型测序使用自动凝胶切割器。利用安捷伦生物分析仪2100对这些文库进行了严格的定量分析。根据安捷伦生物分析仪2100构建sRNA文库。IlluminaNextSeq仪器标准小RNA测序,测序类型为50bp单读。[0044] ③进行RT‑PCR反应后进行测序[0045] ④数据分析与处理[0046] (5)qRT‑PCR方法[0047] ①提取血清总RNA,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品;[0048] ②使用AppliedBiosystems公司的TaqMantsRNA茎环引物进行逆转,合成cDNA;[0049] ③使用AppliedBiosystems公司的TaqMantsRNA荧光探针进行PCR反应;[0050] ④检测比较肝癌患者与健康正常对照血清样本中tsRNA的表达变化。[0051] (6)制备肝癌tsRNA诊断试剂盒[0052] ①前期通过小RNA高通量测序检测肝癌患者和正常对照之间的拷贝差异和表达差异的tsRNA,通过qRT‑PCR技术进一步对肝癌患者和健康对照中差异较显著的血清tsRNA进行检测,作为辅助肝癌诊断的指标。最后筛选到与肝癌相关的血清tsRNA:tRF‑Gln‑TTG‑006作为诊断标志物。在此基础上研发肝癌诊断试剂盒,该试剂盒包括一个tsRNA的探针,AMV逆转录酶、Taq酶、MgCl2,DEPC水和dNTP等试剂。[0053] (7)数据分析[0054] 所有统计检验均使用GraphPadPrism软件7(圣地亚哥,CA)进行。数据以平均值±SEMs表示。P<0.05为差异有统计学意义。组间样本的正态性和等方差分别用Shapiro‑Wilk检验和Brown‑Forsythe检验进行评估。当样本组间达到正态性和方差相等时,采用单因素方差分析(随后采用Bonferroni多重比较检验)、双因素方差分析(随后采用Bonferroni多重比较检验)或t检验。[0055] 以下是本发明进一步的说明:[0056] 在探索阶段,发明人分别对30例肝癌血清和30例健康对照血清,运用小RNA高通量测序,通过筛选发现有30种tsRNAs(细胞质的tsRNAs来自GtRNAdb数据库;线粒体的tsRNA由tRANscan‑SE软件预测产生)在肝癌血清样本中发生显著变化(变化倍数>2)。[0057] 根据测序结果,发明人选择了在肝癌患者中表达升高的tsRNAs进行分析(升高倍数>2),共10种符合要求,考虑到长度等限制因素,其中有5种tsRNA可以由AppliedBiosystems公司定制合成相应的TaqMan探针进行检测,包括:[0058] 分别采用两种分析方法对以上5种tsRNAs进行检测,基于绝对定量的方法,对有统计学显著差异的tsRNAs在另外24例肝癌病例和24例对照中进行进一步进行一一验证,进而观察研究结果的稳定程度,结果如图1所示。[0059] 绝对定量分析:合成相应的tsRNA标准品,制作标准曲线,分别提取100uL血清样本中的RNA,通过QRT‑PCR检测,得到样本CT值,通过标曲计算得到绝对浓度。分析方法结果显示,同时满足上述筛选条件的tsRNAs为tRF‑Gln‑TTG‑006在肝癌病例组和健康对照组中的表达存在显著差异。[0060] 根据以上结果,接着在另外100例健康对照和100例肝癌患者血清中对上述tsRNA进行进一步检测验证,结果显示,tRF‑Gln‑TTG‑006在肝癌样本中显著升高,结果如图2所示。[0061] 进一步分析上述tsRNAs用于肝癌诊断的效果,ROC曲线(ReceiverOperatingCharacteristicCurve,受试者工作特征曲线)分析发现tRF‑Gln‑TTG‑006对肝癌有较好的诊断效果,结果如图3所示。曲线下面积达到0.908,特异性达到80%,敏感度达到77.4%,与传统基于甲胎蛋白AFP的检测方式相比敏感度(39%~65%)和特异性(约76%)均有着很大提升。

专利地区:江苏

专利申请日期:2021-07-28

专利公开日期:2024-06-18

专利公告号:CN113584169B

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