一种眼用制剂及其制备方法和应用发明专利

专利名称：一种眼用制剂及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210289345.8

专利申请（专利权）人：易舟(上海)生物医药有限公司
权利人地址：上海市浦东新区自由贸易试验区李时珍路396号1幢1楼2136室

专利发明（设计）人：辛瑜

专利摘要：本发明提供了一种眼用制剂及其制备方法和应用。一种抑制眼部视网膜渗漏和/或降低视网膜新生血管数的眼用制剂，其包括维生素A或其药学上可接受的盐，以及转甲状腺素蛋白；所述转甲状腺素蛋白为由SEQ ID NO:1所示氨基酸组成的蛋白质；所述转甲状腺素蛋白的含量为5‑30μmol/L；所述维生素A或其药学上可接受的盐的含量为2‑10μmol/L。本发明还提供了该眼用制剂的制备方法和应用。本发明的眼用制剂中所述的转甲状腺素蛋白与所述的化合物能够协同配合，从而将其用于治疗眼部疾病时能够显著提高对于与眼部血管新生和/或眼部视网膜渗漏等相关的眼部疾病的治疗效果。

主权利要求：
1.一种抑制眼部视网膜渗漏和/或降低视网膜新生血管数的眼用制剂，其特征在于，其包括维生素A或其药学上可接受的盐，以及转甲状腺素蛋白；所述转甲状腺素蛋白为由SEQIDNO:1所示氨基酸组成的蛋白质；所述转甲状腺素蛋白的含量为5‑30μmol/L；所述维生素A或其药学上可接受的盐的含量为2‑10μmol/L；所述眼用制剂为滴剂、喷剂或凝胶剂；所述的维生素A为维生素A1和/或维生素A2；所述眼用制剂中维生素A或其药学上可接受的盐能够与TTR结合，协同跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底。
2.如权利要求1所述的眼用制剂，其特征在于，所述转甲状腺素蛋白的含量为10‑20μmol/L；和/或，所述维生素A或其药学上可接受的盐的含量为5μmol/L。
3.如权利要求2所述的眼用制剂，其特征在于，所述转甲状腺素蛋白的含量为10、15或
20μmol/L。
4.如权利要求1 3任一项所述的眼用制剂，其特征在于，所述眼用制剂中还含有药学上~可接受的辅料；
和/或，所述眼用制剂以每日施用1‑3次进行施用。
5.如权利要求4所述的眼用制剂，其特征在于，所述眼用制剂以每日2次、每次1滴、持续
3个月进行施用；和/或，所述眼用制剂以每日1次、每次1滴、持续5天进行施用；和/或，所述眼用制剂以每日2次、每次1滴、持续2周进行施用。
6.如权利要求4所述的眼用制剂，其特征在于，所述辅料为生理盐水、表面活性剂和/或透明质酸；
和/或，所述眼用制剂以每次施用量为0.3 0.8nmol蛋白/眼进行施用。
~
7.如权利要求6所述的眼用制剂，其特征在于，所述表面活性剂为吐温80；所述透明质酸的含量≤6％。
8.如权利要求7所述的眼用制剂，其特征在于，所述吐温80的含量为5%；所述透明质酸的含量为1 4％。
~
9.如权利要求8所述的眼用制剂，其特征在于，所述吐温80的含量为5%；所述透明质酸的含量为2％。
10.如权利要求4所述的眼用制剂，其特征在于，所述眼用制剂为治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的眼用制剂。
11.如权利要求1 10任一项所述的眼用制剂的制备方法，其特征在于，将如权利要求1~ ~
10中所述的维生素A或其药学上可接受的盐与所述的转甲状腺素蛋白混合。
12.如权利要求1 10任一项所述的眼用制剂在制备协同跨越角膜屏障以抑制眼部视网~膜渗漏和/或降低视网膜新生血管数的药物中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述应用为在制备协同跨越角膜屏障以治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的滴眼药物中的应用。 说明书 : 一种眼用制剂及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种含有转甲状腺素蛋白与特定化合物的眼用制剂及其制备方法和应用。背景技术[0002] 双氯芬酸及其钠盐：双氯芬酸及其钠盐属于非甾体抗炎药，有明显的镇痛，消炎及解热作用。双氯芬酸钠滴眼液，用于治疗葡萄膜炎、角膜炎、巩膜炎，抑制角膜新生血管的形成；治疗眼内手术后、激光滤帘成形术后或各种眼部损伤的炎症反应；抑制白内障手术中缩瞳反应；用于准分子激光角膜切削术后止痛及消炎；治疗春季结膜炎、季节过敏性结膜炎等过敏性眼病；预防和治疗白内障及人工晶体术后炎症及黄斑囊样水肿；以及青光眼滤过术后促进滤过泡形成等。双氯芬酸钠滴眼液针对眼表使用或眼部开放式创伤使用，目前的市售产品有迪非，含量为1mg/mL。双氯芬酸、双氯芬酸钠的结构式如下所示：[0003] 双氯芬酸，[0004] 双氯芬酸钠。[0005] 维生素A：维生素A包括视黄醇(A1)、3‑脱氢视黄醇(A2)，是一类脂溶性维生素，对热、酸、碱稳定。维生素A有促进生长、繁殖，维持骨骼、上皮组织、视力和粘膜上皮正常分泌等多种生理功能，维生素A及其类似物有阻止癌前期病变的作用。维生素A缺乏时表现为生长迟缓、暗适应能力减退而形成夜盲症。维生素A滴眼液用于促进角膜细胞的生长以及干眼症的治疗。其中视黄醇(A1)、3‑脱氢视黄醇(A2)的结构式如下所示：[0006][0007] 木犀草素：是一种天然黄酮类化合物，存在于多种植物中。具有多种药理活性，如消炎、抗过敏、降尿酸、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等，临床主要用于止咳、祛痰、消炎、降尿酸、治疗心血管疾病，以及治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症、SARS、肝炎等。木犀草素，多以糖苷的形式存在于多种植物中。木犀草素及其糖苷形式的结构式分别如下所示：[0008] 木犀草素，[0009] 木犀草苷。[0010] 目前未有上述这些药物与转甲状腺素蛋白(TTR)能够动态特异性结合的报道。[0011] CN109481668A中公开了转甲状腺素蛋白(TTR)可用于制备抑制血管新生的药物，但将其用于治疗眼部疾病时效果仍然有待提高。发明内容[0012] 针对现有技术中单独将转甲状腺素蛋白(TTR)用于治疗眼部疾病时效果仍不够理想等缺陷，本发明提供了一种眼用制剂及其制备方法和应用。本发明的眼用制剂中的转甲状腺素蛋白与特定化合物能够协同配合，从而将其用于治疗眼部疾病时能够显著提高对于与眼部血管新生和/或眼部视网膜渗漏等相关的眼部疾病的治疗效果。[0013] 本发明人通过大量实验，意外发现将转甲状腺素蛋白与本发明中的特定化合物共同施用眼部时，所述的化合物能够与转甲状腺素蛋白协同配合、共同作用，从而能够有效治疗或缓解与眼部血管新生和/或眼部视网膜渗漏等相关的眼部疾病。[0014] 为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种眼用制剂，其包括化合物、其药学上可接受的盐、其糖苷、其溶剂合物、其药学上可接受的盐的溶剂合物、或其晶型，以及转甲状腺素蛋白；所述化合物选自双氯芬酸、维生素A和木犀草素中的一种或多种。[0015] 本发明中，所述的盐通常是药学上可接受的盐，其通常是指本发明化合物与相对无毒的、药学上可接受的酸或碱制备得到的盐。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的碱与这类化合物的原型接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括但不限于：锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、镁盐、锌盐、铋盐、铵盐、二乙醇胺盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的酸与这类化合物的原型接触的方式获得酸加成盐。所述的药学上可接受的酸包括无机酸，所述无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、磷酸、亚磷酸、硫酸等。所述的药学上可接受的酸包括有机酸，所述有机酸包括但不限于：乙酸、丙酸、草酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、异烟酸、酸式柠檬酸、油酸、单宁酸、泛酸、酒石酸氢、抗坏血酸、龙胆酸、富马酸、葡糖酸、糖酸、甲酸、乙磺酸、双羟萘酸(即4,4’‑亚甲基‑双(3‑羟基‑2‑萘甲酸))、氨基酸(例如谷氨酸、精氨酸)等。当本发明的化合物中含有相对酸性和相对碱性的官能团时，可以被转换成碱加成盐或酸加成盐。具体可参见Berge etal.,"PharmaceuticalSalts",JournalofPharmaceuticalScience66:1‑19(1977)、或、HandbookofPharmaceuticalSalts:Properties,Selection,andUse(P.HeinrichStahlandCamilleG.Wermuth,ed.,Wiley‑VCH,2002)。在某一较佳实施例中，所述的药学上可接受的盐为钠盐，例如为双氯芬酸钠。[0016] 较佳地，所述的糖苷为木犀草苷。[0017] 较佳地，所述的维生素A为维生素A1和/或维生素A2。在本发明某一较佳实施例中，所述的维生素A可以购自国药，国药编号为CATOCCHM700908，CAS：68‑26‑8。[0018] 较佳地，所述眼用制剂中，所述转甲状腺素蛋白的含量为4‑30μmol/L，优选5‑30μmol/L，更优选10‑20μmol/L，例如为10、15或20μmol/L。[0019] 较佳地，所述眼用制剂中，所述双氯芬酸(或例如其钠盐双氯芬酸钠)的含量为5‑20μmol/L，例如为10μmol/L。[0020] 较佳地，所述眼用制剂中，所述维生素A的含量为2‑10μmol/L，例如为5μmol/L。[0021] 较佳地，所述眼用制剂中，所述木犀草素(或例如其糖苷形式木犀草苷)的含量为2‑10μmol/L，例如为5μmol/L。[0022] 较佳地，所述眼用制剂中，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：[0023] (a)由SEQIDNO.1所示氨基酸组成的蛋白质，编码其的核苷酸序列优选如SEQIDNO:2所示；[0024] (b)在(a)中的氨基酸序列上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的蛋白质；[0025] (c)在(a)或(b)中的氨基酸序列上经过亲水性修饰或疏水性修饰的序列所示的蛋白质。[0026] 其中，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质的氨基酸序列可以是如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示。[0027] 其中，所述(c)中，所述亲水性修饰或疏水性修饰在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上进行，优选在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上使用长链疏水片段例如正十二烷进行所述修饰、或、在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上通过使用马来酰亚胺连接正十二烷进行所述修饰。[0028] 本领域技术人员应当知晓的是，所述的转甲状腺素蛋白(TTR)与本发明中所述的化合物相互协调配合从而提升治疗效果的情况及结果应当同样适用于现有技术(如CN111437398A，在此引入其全文并入本发明)中所提及的这些TTR的衍生蛋白(例如氨基酸序列如SEQIDNO:5所示的大鼠源TTR，氨基酸序列如SEQIDNO:6所示的小鼠源TTR，或氨基酸序列如SEQIDNO:7所示的人源TTR‑CL，其为人源成熟TTR丢失C末端‑TNPKE后的蛋白质产物)。[0029] 较佳地，所述眼用制剂中还含有药学上可接受的辅料例如生理盐水、表面活性剂和/或透明质酸，所述表面活性剂例如为吐温80，其含量优选为5％(v/v)；所述透明质酸的质量体积百分比的含量优选≤6％，优选1‑4％，更优选2％。本发明中，所述的生理盐水的使用量可按照本领域规定的标准进行使用即可。[0030] 本发明中，所述的“药学上可接受的”通常是指辅料等一般无毒、安全，并且适合于患者使用。所述的“患者”优选哺乳动物，更优选为人类。[0031] 较佳地，所述眼用制剂可以是以本领域常规施用于眼部的产品形式存在，例如可以为滴剂例如滴眼液，还可以为喷剂、凝胶剂或眼用脂质体等。[0032] 较佳地，所述眼用制剂以每日施用1‑3次、每次施用量优选为0.3‑0.8nmol蛋白/眼进行施用。[0033] 较佳地，所述眼用制剂以每日2次、每次1滴、持续3个月进行施用。[0034] 较佳地，所述眼用制剂以每日1次、每次1滴、持续5天进行施用。[0035] 较佳地，所述眼用制剂以每日2次、每次1滴、持续2周进行施用。[0036] 在某一较佳实施例中，所述眼用制剂由10μmol/L转甲状腺素蛋白、2％(质量体积百分比)透明质酸、10μmol/L双氯芬酸钠和生理盐水组成。[0037] 在某一较佳实施例中，所述眼用制剂由10μmol/L转甲状腺素蛋白、2％(质量体积百分比)透明质酸、5μmol/L维生素A、5％(v/v)吐温80和生理盐水组成。[0038] 在某一较佳实施例中，所述眼用制剂由10μmol/L转甲状腺素蛋白、2％(质量体积百分比)透明质酸、5μmol/L木犀草苷和生理盐水组成。[0039] 较佳地，所述眼用制剂为抑制眼部视网膜渗漏和/或降低视网膜新生血管数的眼用制剂，所述眼用制剂优选为治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的眼用制剂。[0040] 为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了如本发明第一方面所述的眼用制剂的制备方法，将如本发明第一方面中所述的化合物与所述的转甲状腺素蛋白混合即可。[0041] 为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了如本发明第一方面所述的眼用制剂在制备抑制眼部视网膜渗漏和/或降低视网膜新生血管数的药物中的应用；优选为在制备治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的药物中的应用。[0042] 本发明中，所述的“溶剂合物”是指本发明化合物与化学计量或非化学计量的溶剂结合形成的物质。溶剂合物中的溶剂分子可以有序或非有序排列的形式存在。所述的溶剂包括但不限于：水、甲醇、乙醇等。[0043] 本发明中，所述的“药学上可接受的盐的溶剂合物”中的“药学上可接受的盐”和“溶剂合物”如上所述，是指本发明化合物1、与相对无毒的、药学上可接受的酸或碱制备得到的2、与化学计量或非化学计量的溶剂结合形成的物质。所述的“药学上可接受的盐的溶剂合物”包括但不限于本发明所述辅料的盐酸一水合物。[0044] 本发明中，所述的“化合物”、“药学上可接受的盐”、“糖苷”、“溶剂合物”和“药学上可接受的盐的溶剂合物”可以以晶型或无定型的形式存在。术语“晶型”是指其中的离子或分子是按照一种确定的方式在三维空间作严格周期性排列，并具有间隔一定距离周期重复出现规律；因上述周期性排列的不同，可存在多种晶型，也即多晶型现象。术语“无定型”是指其中的离子或分子呈现杂乱无章的分布状态，即离子、分子间不具有周期性排列规律。[0045] 本发明中，所述的“包括或包含”可以是指除了包括后面所列举的成分，还存在其他成分；在某些情况下，也可以是指“由……组成”，即只包括后面所列举的成分而不存在其他成分。[0046] 本发明中，所述的转甲状腺素蛋白是一种四聚体载体蛋白，可在血浆和脑脊液中运输甲状腺激素。研究发现转甲状腺素蛋白进入细胞是通过高密度脂蛋白受体SRB1所介导的(Landers,K.A.,etal.,Transthyretinuptakeinplacentalcellsisregulatedbythehigh‑densitylipoproteinreceptor,scavengerreceptorclassBmember1.MolCellEndocrinol,2018.474:p.89‑96)。从结构上看(三维结构见图1)，转甲状腺素蛋白的四聚体表面具有显著的亲水结构域(深色)与疏水结构域(浅色)，转甲状腺素蛋白的核心疏水结构域能够携带强疏水的甲状腺素分子跨越各种细胞(见图2)。此外，不同物种的转甲状腺素蛋白的氨基酸序列高度保守，人源的转甲状腺素蛋白与SD大鼠及C57BL/6小鼠来源的转甲状腺素蛋白的氨基酸序列相似度>95％(见图3)。[0047] 本发明中，所提及的化合物等通常可以通过商购获得，例如购自国药集团、百灵威科技有限公司等。[0048] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实施例。[0049] 本发明所用试剂和原料均市售可得。[0050] 本发明的积极进步效果在于：本发明的眼用制剂中的转甲状腺素蛋白与所述的特定化合物能够协同配合，从而将其用于治疗眼部疾病时能够显著提高对于与眼部血管新生和/或眼部视网膜渗漏等相关的眼部疾病的治疗效果。在本发明某一较佳实施例中，本发明的眼用制剂不仅可以有效治疗DR、AMD以及ROP，还能够起到滋养作用，对眼部本身因其他原因产生的视网膜渗漏以及新生血管增加的情况也一定的缓解效果。附图说明[0051] 图1显示了转甲状腺素蛋白(TTR)的三维结构(PDBID：1ICT)。[0052] 图2显示了TTR核心疏水结构域携带强疏水的甲状腺素分子跨越各种细胞。[0053] 图3显示了人源TTR与SD大鼠、C57BL/6小鼠及家兔来源的TTR氨基酸序列相似度>95％，其中，SD大鼠来源的TTR氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，C57BL/6小鼠来源的TTR氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。[0054] 图4A显示了蛋白结构为TTR二聚体，双氯芬酸配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合两分子双氯芬酸。[0055] 图4B显示了双氯芬酸与TTR氨基酸残基的相互作用。[0056] 图5A显示了通过Discoverystudio软件进行分子模拟发现维生素A1能够与TTR多聚体的疏水通道稳定结合，图中蛋白结构为TTR二聚体，维生素A1配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合一分子维生素A1。[0057] 图5B显示了维生素A1与TTR氨基酸残基的相互作用。[0058] 图6A显示了通过Discoverystudio软件进行分子模拟发现维生素A2能够与TTR多聚体的疏水通道稳定结合，图中蛋白结构为TTR二聚体，维生素A2配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合一分子维生素A2。[0059] 图6B显示了维生素A2与TTR氨基酸残基的相互作用。[0060] 图7A显示了通过Discoverystudio软件进行分子模拟发现木犀草苷能够与TTR多聚体稳定结合，图中蛋白结构为TTR二聚体，木犀草苷配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合一分子木犀草苷。[0061] 图7B显示了木犀草苷与TTR氨基酸残基的相互作用。[0062] 图8A显示了通过Discoverystudio软件进行分子模拟发现磺胺甲恶唑能够与TTR多聚体稳定结合，图中蛋白结构为TTR二聚体，磺胺甲恶唑配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合一分子磺胺甲恶唑。[0063] 图8B显示了磺胺甲恶唑与TTR氨基酸残基的相互作用。具体实施方式[0064] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。[0065] 实施例1人源转甲状腺素蛋白(TTR)的重组制备[0066] (1)重组质粒pETx‑rhaPBAD‑ttr的构建：对pET‑21a质粒(购于ATCC中国菌种保藏中心)进行改造重构(重构后所得质粒与原始pET‑21a质粒在序列上的差别在约75％左右，具体序列如SEQIDNO:4所示)，利用rhaPBAD启动子(鼠李唐诱导型)替代T7启动子，同时连接人源TTR优化核酸序列(如SEQIDNO:2所示，TTR的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)，所得质粒整体的核酸序列如SEQIDNO:3所示。经测序验证(测序公司为南京金斯瑞生物科技有限公司)，构建成功。[0067] (2)重组人源TTR的表达和纯化：将步骤(1)构建的pETx‑rhaPBAD‑ttr质粒转化入E.coliBL21(DE3)细胞，将所得重组E.coliBL21(DE3)在LB培养基中培养，制备种子液，再以5％的接种量，接入至5LTB培养基中，温度37℃，搅拌桨转速150rpm，培养至OD600为1.5‑2.0；加入0.4‑2％(质量体积百分比)鼠李糖诱导16‑20h(表1)。通过高压均质机将菌体破碎+ TM后，上清液通过镍(Ni )柱层析制备得到人源TTR。使用内毒素吸附柱(Pierce HighCapacityEndotoxinRemovalSpinColumns,ThermoFisher)去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体。所得人源TTR蛋白产量如表1所示。在OD600为1.5‑2.0时，以0.4‑2％鼠李糖诱导16‑20h，可获得的蛋白产量≥50mg/g湿菌体。[0068] 表1人源TTR的重组表达[0069][0070] 实施例2计算机模拟TTR与各个配体分子的结合形态[0071] 参照PDB数据库中，TTR二聚体与双氯芬酸的静态共结晶模型(PDF：3CFQ)，如图4A所示。图4A中，蛋白结构为TTR二聚体，双氯芬酸配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合两分子双氯芬酸。图4B中显示了双氯芬酸与TTR氨基酸残基的相互作用。[0072] 通过Discoverystudio软件进行分子模拟发现维生素A1(视黄醇)能够与TTR多聚体的疏水通道稳定结合。图5A中显示的蛋白结构为TTR二聚体，维生素A1配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合一分子维生素A1。图5B中显示了维生素A1与TTR氨基酸残基的相互作用。[0073] 通过Discoverystudio软件进行分子模拟发现维生素A2(3‑脱氢视黄醇)能够与TTR多聚体的疏水通道稳定结合。图6A中显示的蛋白结构为TTR二聚体，维生素A2配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合一分子维生素A2。图6B中显示了维生素A2与TTR氨基酸残基的相互作用。[0074] 通过Discoverystudio软件进行分子模拟发现木犀草苷能够与TTR多聚体稳定结合。图7A中显示的蛋白结构为TTR二聚体，木犀草苷配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合一分子木犀草苷。图7B中显示了木犀草苷与TTR氨基酸残基的相互作用。[0075] 从以上结果可以看出，TTR与这些配体分子之间的作用力主要为范德华力、氢键作用、疏水作用等非共价作用力，从本质上说不会改变TTR和配体之间的化学结构。[0076] 实施例3TTR与各个潜在配体分子动态特异性结合参数的测定[0077] 使用nanoITC(TA)测定TTR与实施例2中所提及的各个配体分子或其盐的亲和结合平衡解离常数Kd，在10μmol/L的TTR溶液(1000μL)中，以1μL/min的速度滴加100μmol/L的上述各种配体溶液，使用内置软件计算亲和结合平衡解离常数Kd(表2)。[0078] 表2各种配体分子与TTR的亲和结合平衡解离常数[0079][0080] 如表2所示，各种配体分子与TTR的亲和结合平衡解离常数均接近10‑8mol/L，与单克隆抗体识别单一抗原表位的能力接近，说明上述配体分子能与TTR特异性识别与结合。[0081] 实施例4人源TTR‑配体分子复合物跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底[0082] 将实施例1中所制得的人源TTR配置为10μmol/L(含有生理盐水，2％低分子量透明质酸以及10μmol/L双氯芬酸钠/5μmol/L维生素A+5％(v/v)吐温80/5μmol/L木犀草苷(添加比例参照实施例2中计算机模拟的结果)，分别对C57BL/6小鼠(8周龄)及SD大鼠(8周龄)进行滴眼，经过3‑72h后处死，取玻璃体与眼底样本提取蛋白，使用兔抗‑His‑tag抗体为一抗，驴抗兔抗体为二抗，通过ELISA，测定C57BL/6小鼠及SD大鼠的玻璃体与眼底样本中人源TTR的含量。参照中国药典2020年版第二部第115页，双氯芬酸钠滴眼液条目，测定样品中双氯芬酸钠含量；参照中国药典2020版第二部第1472页，维生素A条目，测定样品中维生素A含量；参照英国药典BP2017，Luteolin‑7‑glucoside条目，测定样品中木犀草苷含量。[0083] 滴眼后，在C57BL/6小鼠及SD大鼠玻璃体与眼底样本内的人源TTR以及各配体分子的含量半衰期接近60h，说明可以在玻璃体与眼底样本内有效存在60h，有足够的治疗浓度和治疗时间(表3)。[0084] 表3人源TTR及配体分子跨越C57BL/6小鼠及SD大鼠角膜屏障进入玻璃体及眼底[0085][0086][0087][0088][0089] 实施例5人源TTR‑配体分子复合物滴眼方式治疗DR(糖尿病视网膜病变)SD大鼠[0090] 8周龄SD大鼠，体重200‑250g，禁食12‑18h，腹腔注射2％STZ(60mg/kg)，48h及72h后剪尾采血，血糖试纸检测均高于16.7mM，造模成功，获得DRSD大鼠。DRSD大鼠分为6组，1组为DRSD大鼠不加任何处理(5只)，另外5组均为5只/组，左眼、右眼各每日滴加2次，每次30μL，其中，左眼为采用实施例1所制得的人源TTR滴眼，或者采用实施例1所制得的人源TTR+配体滴眼，具体为分别采用10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸)，10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸+10μmol/L双氯芬酸钠)、10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L维生素A+5％吐温80)、10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L木犀草苷)滴眼，右眼为采用生理盐水溶液+2％透明质酸，或者生理盐水溶液+2％透明质酸+配体滴眼，以作为对照，具体为分别采用生理盐水溶液+2％透明质酸，生理盐水溶液+2％透明质酸+10μmol/L双氯芬酸钠，生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L维生素A+5％吐温80，生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L木犀草苷滴眼。此外，另有1组正常SD大鼠作为对照(5只)。所有SD大鼠继续饲养3个月后，分别剥取视网膜进行EvansBlue染色观察视网膜血管渗漏情况，Trypsin酶解观察新生血管密度。[0091] 结果显示，STZ诱导SD大鼠饲养3个月后，与正常对照相比，DRSD大鼠不加任何处理的对照组的视网膜血管渗漏、新生血管数量均显著提升，而滴加人源TTR或者人源TTR/双氯芬酸钠、人源TTR/维生素A、人源TTR/木犀草苷组的眼球视网膜渗漏现象显著抑制，视网膜新生血管数显著下降，说明了DR的临床病理现象得到了缓解(表4)。[0092] 表4人源TTR/人源TTR‑配体分子复合物治疗STZ诱导SD大鼠DR病理状况[0093][0094][0095] 实施例6人源TTR‑配体分子复合物滴眼方式治疗AMD(老年性黄斑变性)C57BL/6小鼠[0096] 9周龄C57/BL6小鼠，用氪激光(647nm)对视网膜进行光凝，功率360mW，直径50μm，时间0.05s，每眼8个光凝点，诱导脉络膜新生血管生成，并逐步向视网膜增生移行，获得AMDC57BL/6小鼠。AMDC57BL/6小鼠分为6组，1组为AMDC57BL/6小鼠不加任何处理(5只)，另外5组均为5只/组，左眼、右眼各每日滴加2次，每次30μL，其中，左眼为采用实施例1所制得的人源TTR滴眼，或者采用实施例1所制得的人源TTR+配体滴眼，具体为分别采用10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸)、10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸+10μmol/L双氯芬酸钠)、10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L维生素A+5％吐温80)、10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L木犀草苷)滴眼，右眼为采用生理盐水溶液+2％透明质酸，或者生理盐水溶液+2％透明质酸+配体滴眼，以作为对照，具体为分别采用生理盐水溶液+2％透明质酸，生理盐水溶液+2％透明质酸+10μmol/L双氯芬酸钠，生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L维生素A+5％吐温80，生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L木犀草苷滴眼。此外，另有1组正常C57BL/6小鼠作为对照(5只)。滴眼2周后，处死动物，剥离视网膜并进行EvansBlue染色观察视网膜血管渗漏情况，以及Trypsin酶解观察新生血管密度。[0097] 结果如表5所示，表中显示，与正常对照组相比，AMDC57BL/6小鼠不加任何处理的对照组视网膜血管渗漏、新生血管数量均显著提升；而滴加了人源TTR或者人源TTR/双氯芬酸钠、人源TTR/维生素A、人源TTR/木犀草苷组的视网膜渗漏情况及新生血管情况得到显著的缓解。[0098] 表5人源TTR/人源TTR‑配体分子复合物治疗激光视网膜光凝诱导C57BL/6小鼠AMD病理状况[0099][0100][0101] 实施例7人源TTR‑配体分子复合物滴眼方式治疗ROP(早产儿视网膜病变)SD大鼠[0102] 出生一周乳鼠(SD大鼠)，放入高压氧舱饲养，正常对照组放入正常环境饲养(正常对照组，5只)。高压氧舱饲养5天后取出，获得ROPSD大鼠。将所有ROPSD大鼠连同正常对照组一起在正常环境中继续饲养5天。在该5天中，ROPSD大鼠分为6组，1组为ROPSD小鼠不加任何处理(5只)，另外5组均为5只/组，左眼、右眼各每日滴加1次，每次30μL，其中，左眼为采用实施例1所制得的人源TTR滴眼，或者采用实施例1所制得的人源TTR+配体滴眼，具体为分别采用10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸)、10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸+10μmol/L双氯芬酸钠)、10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L维生素A+5％吐温80)、10μmol/L人源TTR(生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L木犀草苷)滴眼，右眼为采用生理盐水溶液+2％透明质酸，或者生理盐水溶液+2％透明质酸+配体滴眼，以作为对照，具体为分别采用生理盐水溶液+2％透明质酸，生理盐水溶液+2％透明质酸+10μmol/L双氯芬酸钠，生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L维生素A+5％吐温80，生理盐水溶液+2％透明质酸+5μmol/L木犀草苷滴眼。正常环境饲养5天后处死乳鼠并剥取视网膜进行EvansBlue染色，观察视网膜血管渗漏情况。[0103] 结果如表6所示，表中显示，与正常对照组相比，ROPSD大鼠不加任何处理的对照组视网膜血管渗漏显著提升；而滴加了人源TTR或者人源TTR/双氯芬酸钠、人源TTR/维生素A、人源TTR/木犀草苷组的视网膜渗漏情况得到显著的缓解。[0104] 表6人源TTR/人源TTR‑配体分子复合物治疗高压氧舱诱导SD大鼠乳鼠ROP病理状况[0105][0106] 结合实施例5‑7的数据还可以看出，即使是正常的SD大鼠，成年的SD大鼠的视网膜渗漏情况要比幼年的SD大鼠严重，另外，其他一些原因，例如，实验操作、个体差异等，也可能会造成视网膜渗漏以及新生血管数增加，这就表明即使是未经造模的正常对照眼也存在一定程度的视网膜渗漏以及新生血管增加的情况。通过使用人源TTR/双氯芬酸钠或者人源TTR/维生素A后，不仅可以治疗DR、AMD以及ROP，还可以起到滋养作用，对眼部本身因其他原因产生的视网膜渗漏以及新生血管增加的情况也有一定的缓解效果。[0107] 对比例1：[0108] 具体实施方式同实施例4，区别在于，将未与TTR结合的各个配体分子按照实施例4相同的操作步骤对C57BL/6小鼠(8周龄)及SD大鼠(8周龄)进行滴眼测试，结果显示，各个配体分子单独无法进入C57BL/6小鼠及SD大鼠的玻璃体及眼底(表7)。[0109] 表7各个配体分子跨越C57BL/6小鼠及SD大鼠角膜屏障进入玻璃体及眼底[0110][0111][0112] 对比例2：[0113] 具体实施方式同实施例5，表8中显示了其中右眼滴眼后的结果数据。结果显示，各个配体分子单独滴眼无法改善STZ诱导SD大鼠DR病理状况(表8)。[0114] 表8各配体单独滴眼治疗STZ诱导SD大鼠DR病理状况[0115][0116] 对比例3：[0117] 具体实施方式同实施例6，表9中显示了其中右眼滴眼后的结果数据。结果显示，各个配体分子单独滴眼无法改善激光视网膜光凝诱导C57BL/6小鼠AMD病理状况(表9)。[0118] 表9各配体单独滴眼治疗激光视网膜光凝诱导C57BL/6小鼠AMD病理状况[0119][0120] 对比例4：[0121] 具体实施方式同实施例7，表10中显示了其中右眼滴眼后的结果数据。结果显示，各个配体分子单独滴眼无法改善高压氧舱诱导SD大鼠乳鼠ROP病理状况(表10)。[0122] 表10各配体单独滴眼治疗高压氧舱诱导SD大鼠乳鼠ROP病理状况[0123][0124] 对比例5：[0125] 磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)的抗菌谱广，抗菌作用强，能阻碍细菌生长，对葡萄球菌、大肠杆菌特别有效；适用于呼吸系统、泌尿系统及肠道感染等；主要用于治疗禽霍乱等。其可用于制备滴眼液例如复方磺胺甲恶唑钠滴眼液(本品为复方制剂，每10毫升含磺胺甲恶唑钠400毫克，氨基己酸200毫克、甘草酸二钾10毫克、马来酸氯苯那敏2毫克。主要用于敏感菌所引起的细菌性结膜炎、睑腺炎(麦粒肿)及细菌性眼睑炎)。[0126] 通过Discoverystudio软件进行分子模拟发现磺胺甲恶唑能够与TTR多聚体稳定结合。图8A中显示的蛋白结构为TTR二聚体，磺胺甲恶唑配体分子使用箭头指示，一分子TTR二聚体可以结合一分子磺胺甲恶唑。图8B中显示了磺胺甲恶唑与TTR氨基酸残基的相互作用。[0127] 参考实施例3的步骤，在10μmol/L的TTR溶液(1000μL)中，以1μL/min的速度滴加100μmol/L的磺胺甲恶唑钠盐溶液，使用内置软件计算亲和结合平衡解离常数Kd为7.03×‑810 mol/L。[0128] 参照实施例4的步骤使用TTR/磺胺甲恶唑钠盐对大鼠和小鼠进行滴眼3‑72小时后，大鼠和小鼠的角膜出现损伤，即，磺胺甲恶唑钠盐与TTR配合使用时会烧伤角膜，不具有生物安全性。可见，用Discoverystudio软件分子模拟筛选出同样具有生物活性、具有消炎作用且均可以与TTR结合的配体后，进行试验验证时并不是都可以提高治疗效果。[0129] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

专利地区：上海

专利申请日期：2020-09-16

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114558112B