一种三氮菌素C的制备方法发明专利

专利名称：一种三氮菌素C的制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202011267950.2

专利申请（专利权）人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
权利人地址：山东省青岛市崂山区松岭路189号

专利发明（设计）人：咸漠,黄伟

专利摘要：一种三氮菌素C的制备方法，属于微生物技术和分离技术领域。为了解决现有技术利用微生物方法生产三氮菌素C存在的问题，并提高三氮菌素C产量和纯度，本发明利用金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens Duggar)发酵，通过甲醇浸提、乙酸乙酯萃取、硅胶柱分离、HPLC纯化等手段获得了三氮菌素C纯品。用本发明所述方法与现有技术相比，产量可提高117％，收率提高约3.5倍，获得的三氮菌素C的纯度大于95％，该方法安全性高，污染低，步骤较为简单，可用于三氮菌素C的生产。

主权利要求：
1.一种三氮菌素C的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、菌株的活化：将金黄色链霉菌接种于TSB培养基中，摇瓶培养，得到菌液；所述的金黄色链霉菌的拉丁文学名为StreptomycesaureofaciensDuggar，保藏编号为ATCC31442，所述摇瓶培养的条件为30℃培养10 12h；
~
步骤二、发酵培养：将步骤一获得的菌液接种于ISP2液体培养基中，发酵培养，获得发酵液；所述发酵的摇床转速为180rpm/min，培养温度为30℃，培养周期为4天；
步骤三、分离纯化：将步骤二获得的发酵液过滤，得到菌丝体和上清液，对菌丝体依次用甲醇浸提，除去甲醇后用乙酸乙酯萃取，上清液用乙酸乙酯进行萃取，合并萃取液体，减压浓缩，得到粗浸膏，通过正相硅胶柱对粗浸膏进行初步分离，再利用半制备HPLC方法进一步分离纯化，得到三氮菌素C；所述正相硅胶柱初步分离是以二氯甲烷和甲醇为流动相按
200:1→100:1→50:1→20:1→10:1→1:1→0:1进行梯度洗脱，取体积比为50：1的CH2Cl2‑MeOH洗脱部位；所述半制备HPLC的紫外吸收在330nm，以体积比为80：20的乙腈和水作为流动相进行液相色谱分离。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一所述TSB培养基的组成为胰蛋白大豆肉汤培养基30g/L，余量为水。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二所述ISP2液体培养基的组成为酵母浸粉4g/L、麦芽浸粉10g/L、葡萄糖4g/L，余量为水；所述液体培养基的pH值为7.2‑
7.4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三菌丝体用甲醇浸提三次，经减压浓缩除去甲醇后，再用乙酸乙酯萃取三次。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三上清液用乙酸乙酯萃取三次。 说明书 : 一种三氮菌素C的制备方法技术领域[0001] 本发明属于微生物发酵技术和分离技术领域，具体涉及一种三氮菌素C的制备方法。背景技术[0002] 三氮菌素C(TriacsinC)，是由链霉菌产生的羟基三氮烯类化合物，是长链脂肪酸酰基辅酶A合成酶的抑制剂，具有调控脂质代谢，降压、血管扩张剂、抑制细胞内钙的动员来抑制胰腺β细胞功能等活性。另外有研究显示三氮菌素C及其类似物还具有抑制轮状病毒复制的活性，有望开发成为抗轮状病毒感染药物。[0003] 由于现阶段三氮菌素家族化合物只能通过微生物发酵获得，唯一有关其发酵纯化的文章《STUDIESONNEWVASODILATORS,WS‑1228AANDB》中报导通过6天的发酵，在18升发酵液中获得150毫克粗提物，然后经过纯化(其中包含利用剧毒试剂苯的萃取步骤)得到30毫克三氮菌素C的产物，收率为20％。如今市场上所销售的三氮菌素C纯度约90％，价格约为10000元/毫克。综上所述，现有技术中利用微生物方法生产三氮菌素C的发酵时间较长，发酵产量低，分离纯化过程复杂并涉及有毒污染试剂，收率低且获得的产品纯度不高，这些都阻碍了三氮菌素的研究与应用。因此为了进一步适应工业生产需求，急需改造三氮菌素C的发酵过程，提高发酵产量并优化三氮菌素C分离纯化过程中涉及的有毒污染试剂并提高其分离效率及产品纯度。发明内容[0004] 为了解决三氮菌素C现有发酵制备及分离纯化工艺存在的问题及提高三氮菌素C的产量和纯度，本发明提供了一种三氮菌素C的制备方法，所述方法包括如下步骤：[0005] 步骤一、菌株的活化：将金黄色链霉菌接种于TSB培养基中，摇瓶培养，得到菌液；[0006] 步骤二、发酵培养：将步骤一获得的菌液接种于ISP2液体培养基中，发酵培养，获得发酵液；[0007] 步骤三、分离纯化：将步骤二获得的发酵液过滤，得到菌丝体和上清液，对菌丝体依次用甲醇醇提，除去甲醇后用乙酸乙酯萃取，上清液用乙酸乙酯进行萃取，合并萃取液体，减压浓缩，得到粗浸膏，通过正相硅胶柱对粗浸膏进行初步分离，再利用半制备HPLC方法进一步分离纯化。[0008] 进一步地限定，步骤一所述的金黄色链霉菌的拉丁文学名为StreptomycesaureofaciensDuggar，保藏编号为ATCC31442。[0009] 在本发明的实施例中，步骤一所述TSB培养基的组成为胰蛋白大豆肉汤培养基30g/L，余量为水；所述摇床培养的条件为30℃培养10～12h。[0010] 在本发明的实施例中，步骤二所述ISP2液体培养基的组成为酵母浸粉4g/L、麦芽浸粉10g/L、葡萄糖4g/L，余量为水；所述液体培养基的pH值为7.2‑7.4。[0011] 在本发明的实施例中，步骤二所述发酵的摇床转速为180rpm/min，培养温度为30℃，培养周期为4天。[0012] 在本发明的实施例中，步骤三菌丝体用甲醇浸提三次，经减压浓缩除去甲醇后，再用乙酸乙酯萃取三次。[0013] 在本发明的实施例中，步骤三上清液用乙酸乙酯萃取三次。[0014] 在本发明的实施例中，步骤三所述正相硅胶柱初步分离是以二氯甲烷和甲醇为流动相按200:1→100:1→50:1→20:1→10:1→1:1→0:1进行梯度洗脱，取体积比为50：1的CH2Cl2‑MeOH洗脱部位。[0015] 在本发明的实施例中，步骤三所述半制备HPLC的紫外吸收在330nm，以体积比为80：20的乙腈和水作为流动相进行液相色谱分离。[0016] 有益效果[0017] 本发明所提供的一种三氮菌素C的制备方法，操作简单，稳定，重复性好。最终获得的菌株摇瓶培养的产量为0.243g/L，比文献《STUDIESONNEWVASODILATORS,WS‑1228AANDB》中报导方法的产量提高117％，整个发酵过程比原文献中缩短1.5天；本发明优化了规模培养后三氮菌素C的分离纯化过程，使用实验室常用的甲醇和乙酸乙酯等溶剂萃取，由60升发酵液中获得粗体物1.6g，经硅胶柱分离、HPLC纯化最后获得1.1克三氮菌素C纯品，纯度大于95％，比原文献中报导的收率提高约3.5倍。整个发酵纯化过程安全性高，污染低，分离获得化合物纯度好，收率高，整个流程较为简单实施力高于原文献。附图说明[0018] 图1：三氮菌素C的结构式；[0019] 图2：TLC检测结果，其中，1为粗提物浸膏；2为组分1；3为组分2；4为组分3；5为组分4；6为组分5；[0020] 图3:三氮菌素C分离纯品HPLC图；[0021] 图4:三氮菌素C标品与利用本发明所述方法制备的三氮菌素C粗提物的HPLC图；[0022] 图5：三氮菌素C标准曲线。具体实施方式[0023] 以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。按以下培养基配方配制培养基备用：[0024] TSB培养基：胰蛋白大豆肉汤培养基30g/L，余量为水。[0025] ISP2液体培养基：酵母浸粉4g/L、麦芽浸粉10g/L、葡萄糖4g/L，余量为水；所述液体培养基的pH值为7.2‑7.4。[0026] 所述金黄色链霉菌购买于美国模式微生物集存库(ATCC)，该菌株的保藏编号为ATCC31442。[0027] 实施例1、三氮菌素C的制备方法[0028] 步骤一、菌株的活化[0029] 每管装有3mLTSB培养基的试管经121℃灭菌20min后备用，将甘油管中保藏的金黄色链霉菌接种至上述试管中，接种量为每管20uL，摇床培养过夜，得到液体菌液，所述摇床培养的转速为180rpm/min，培养温度为30℃。[0030] 步骤二、发酵培养：[0031] 配制液体ISP2培养基，115℃灭菌20min后备。用将步骤一菌株活化所得液体菌液按照2％的体积比转接至装有50mLISP2液体培养基的250mL锥形瓶中，进行摇床培养，获得发酵液。共发酵60L，旋转式摇床的转速为180rpm/min，培养温度为30℃，培养周期为4天。[0032] 步骤三、分离纯化：[0033] 对步骤而获得的发酵液进行过滤，得到菌丝体和上清液，菌丝体用甲醇浸提3次，通过减压浓缩的方式除去甲醇，再用乙酸乙酯萃取3次；上清液直接用乙酸乙酯萃取3次，合并上述两部分的乙酸乙酯萃取液，再通过减压浓缩去除乙酸乙酯，获得粗浸膏1.6g。[0034] 采用实验室常规的正相硅胶柱、半制备HPLC等技术对粗浸膏进行分离纯化，最终获得纯的化合物triacsinC1.1g，收率为68％。具体的分离流程如下：[0035] 正相硅胶柱分离：[0036] 浸膏(1.6g)用甲醇溶解后，加入50g100目的硅胶拌样，分离层硅胶用量为200g，真空浓缩后加入正相柱中，以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂进行正相硅胶分离，洗脱剂的体积为300mL，洗脱剂中二氯甲烷与甲醇的体积比依次为200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、1:1和0:1。经正相硅胶分离得到5个组分，其中，组分1取自体积比为200：1的CH2Cl2‑MeOH洗脱部位；组分2取自体积比为100:1的CH2Cl2‑MeOH洗脱部位；组分3取自体积比为50：1的CH2Cl2‑MeOH洗脱部位；组分4取自体积比为20：1和10:1的CH2Cl2‑MeOH洗脱部位；组分5取自体积比为1:1和0:1的CH2Cl2‑MeOH洗脱部位。然后经TLC及HPLC检测发现目标产物集中在组分3中，TLC检测结果如图2所示，所述TLC检测利用的流动相为二氯甲烷：甲烷＝2：1。[0037] 半制备HPLC分离：[0038] 组分3以乙腈/水为流动相进行液相色谱分离，乙腈和水的体积比为80:20，经HPLC检测获得triacsinC1.1g，纯度大于95％，如图3所示。[0039] 发酵粗产物HPLC检测：[0040] 用少量甲醇将粗浸膏溶解，采用高效液相色谱法对粗浸膏中的三氮菌素进行检测，选用C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，紫外检测器330nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量为10μL，发酵粗产物HPLC检测图如图4所示。[0041] 三氮菌素C的标准曲线的绘制：[0042] 配制浓度梯度为0g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.10g/L、0.20g/L和0.30g/L三氮菌素C的标准品溶液，其对应色谱峰面积见表1，根据表1中的数据，绘制出三氮菌素C的标准曲线见图5。[0043] 表1不同浓度triacsinC标准品对应HPLC峰面积[0044]

专利地区：山东

专利申请日期：2020-11-13

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114480521B