单形拟杆菌用于制造预防与治疗焦虑抑郁症药物中的应用

专利名称：单形拟杆菌用于制造预防与治疗焦虑抑郁症药物中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210264604.1

专利申请（专利权）人：北京航空航天大学
权利人地址：北京市海淀区学院路37号

专利发明（设计）人：刘红,孟琛,郝梓凯

专利摘要：本发明属于生命科学领域，具体涉及单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)在预防与治疗焦虑抑郁症方面的新用途，本发明提供了单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)在制备防治焦虑抑郁症药物中的应用。所述单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)活菌的用量为每日1×104‑1×1020CFU/mL。

主权利要求：
1.单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)用于制造预防和治疗焦虑抑郁症的药物的用途，其特征在于，所述单形拟杆菌为Bacteroidesuniformis，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，来源于ATCC(AmericanTypeCultureCollection)，保藏号为ATCC8492，所述单形拟杆菌是活细胞形式，所述药物中包含单形拟杆菌ATCC8492，所述药物中单形拟杆
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菌有效量为1×10‑1×10 CFU/mL；所述药物中单形拟杆菌ATCC8492通过如下机制的至少一项来缓解焦虑抑郁症：1)降低血清或脑组织中炎症因子含量；2)降低血清中皮质酮含量；
3)升高短链脂肪酸含量；4)降低肠道屏障通透性；5)降低血脑屏障通透性。
2.权利要求1所述的单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)用于制造缓解焦虑抑郁症的药物的用途所制得的药物，其特征在于，所述药物中含有有效量的单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)，以及药学上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。 说明书 : 单形拟杆菌用于制造预防与治疗焦虑抑郁症药物中的应用技术领域[0001] 本发明属于微生物学领域，具体地，本发明涉及一株单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)在预防与治疗焦虑抑郁症药物中的应用。背景技术[0002] 抑郁症，又称抑郁障碍，是一种常见的心境障碍，常见的症状有心境低落、情绪消沉、自卑抑郁、悲观厌世及自杀意图或行为，部分病例有明显的焦虑。据世界卫生组织最新数据显示，全球抑郁症的发病率为3.1％，平均发病年龄在25岁左右，全球有超过2.64亿各个年龄段的人患有抑郁症，且近年来呈持续上升趋势。[0003] 生活事件在诱发和可能导致严重抑郁障碍中发挥着重要潜在作用。例如，在抑郁症发作前一年，压力生活事件的影响与重度抑郁症的发作密切相关。压力生活事件包括慢性疾病、经济不稳定、失业、分居、丧亲等。有压力的生活事件已发现和抑郁之间有强有力的联系。大多数焦虑和抑郁症患者都曾经历过心理应激事件，因此应激事件目前被视为焦虑和抑郁的诱因之一，能够导致情绪障碍的发生。抑郁症同时也是诱导一系列疾病的诱导因子，如骨关节炎、心血管疾病、冠心病、帕金森病等。许多因素都会导致抑郁症疾病的发生，目前还没有明确的机制可以全方位的解释，其病因与发病机制至今还未研究清楚。治疗抑郁症通常通过心理治疗、药物治疗或两者兼用。心理疗法的主要局限性是训练有素的治疗师很少，而且治疗费用昂贵。尽管抗抑郁药的治疗方法多种多样，但相当大比例的患者对治疗都没有充分反应，要么是部分反应，要么根本没有反应。而且，这些药物在长期服用时会产生很多副作用，如头痛头晕、肝毒性、高血压、失眠等不良反应。抑郁症影响着全世界数以百万计的人，然而目前本领域还没有一种有效的、副作用小的防治焦虑抑郁症的方法或药物，因此本领域迫切需要开发一些新的，无毒副作用的，用于防治焦虑抑郁症的方法或药物。[0004] 近年来，肠道菌群被发现与人体健康密切相关，例如肠易激综合征、肥胖症、心脏病等，特别是肠道菌群影响脑部的活动，例如压力、恐惧、认知等，特别是在情绪处理和行为方面起着关键作用。鉴于肠道微生物组对中枢神经系统，特别是压力、情绪、焦虑和认知的潜在影响，将肠道微生物作为改善或治疗精神疾病的潜在手段具有重要的临床意义，应用前景具有广泛吸引力。然而，与改善情绪相关的益生菌几乎都是早前发现的一些益生菌，而关于新精神益生菌的研究工作近年来鲜有报道。另外，目前与改善情绪相关的益生菌研究中还未见探究益生菌的预防作用，而预防作用对于长期经历生活压力的人们具有重要的意义。发明内容[0005] 为了解决以上技术问题，经过发明人的深入研究，发现单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)对焦虑抑郁样行为具有预防和治疗的作用，将单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)灌胃实验对象，发现该菌能够抑制焦虑抑郁样行为，有效减轻精神疾病病症，因此适合开发缓解焦虑抑郁症药物。在此基础上完成本发明。[0006] 本发明的目的在于提供一株单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)作为制备预防和治疗焦虑抑郁症药物中的应用。其中单形拟杆菌，全称为单形拟杆菌ATCC8492(BacteroidesuniformisATCC8492)，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，来源于ATCC(AmericanTypeCultureCollection)保藏号为ATCC8492，所述单形拟杆菌是活细胞9形式，所述药物中有效量为1×10CFU/mL。[0007] 本发明所述的包含单形拟杆菌ATCC8492和或其代谢产物的药物通过如下机制中的至少一项来实现其效果：[0008] 1)降低血清或脑组织中炎症因子含量；[0009] 2)降低血清中皮质酮含量；[0010] 3)升高短链脂肪酸含量；[0011] 4)降低肠道屏障通透性；[0012] 5)降低血脑屏障通透性；[0013] 具体的：[0014] 1)降低精神疾病患者血清中炎症因子含量；[0015] 2)降低精神疾病患者脑组织中炎症因子含量；[0016] 3)降低精神疾病患者脑组织中皮质酮含量；[0017] 4)升高精神疾病患者短链脂肪酸含量；[0018] 5)升高精神疾病患者神经递质含量；[0019] 6)降低精神疾病患者肠道屏障通透性；[0020] 7)降低精神疾病患者血脑屏障通透性。[0021] 制备的预防和治疗焦虑抑郁症药物中，含有有效量的单形拟杆菌和/或其代谢产4物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。本发明所述的药物配方如下:1×10 ‑1×2010 CFU/mL的单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)和/或其代谢产物，所述的预防和治疗焦虑抑郁症药物的剂型包括颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂等本领域常见的药物剂型，其特征在于，通过口服或喂食的方式使用该种药物。[0022] 本发明提供了单形拟杆菌在预防和治疗焦虑抑郁症方面的用途。实验对象接受慢性不可预压力进行抑郁造模的同时摄入单形拟杆菌，单形拟杆菌ATCC8492具有抑制实验对象焦虑样和抑郁样行为的作用。同时，经单形拟杆菌ATCC8492治疗的抑郁大鼠与未接受治疗的抑郁大鼠相比，大鼠的焦虑样和抑郁样行为有明显改善。因此，所述菌株能够用以预防和治疗焦虑抑郁症。[0023] 本发明提供的单形拟杆菌ATCC8492具有优秀的抗焦虑抑郁症的功能，可用于制备预防和治疗焦虑抑郁症的药物，为临床干预和控制焦虑抑郁症等精神疾病提供新的思路，具有良好的产业前景。附图说明[0024] 图1显示了实验分组信息和处理步骤。[0025] 图2显示了大鼠行为学测试(高架十字迷宫实验)的比较结果。[0026] 图3显示了大鼠行为学测试(旷场实验)的比较结果。[0027] 图4显示了大鼠行为学测试(强迫游泳实验)的比较结果。具体实施方式[0028] 本发明人经过广泛而深入的研究和实验发现，单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)对焦虑样和抑郁样行为具有预防和治疗作用，将单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)灌胃实验对象，发现该菌能够抑制焦虑抑郁样行为，有效减轻精神疾病病症。在此基础上完成本发明。[0029] 如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“单形拟杆菌”，“Bacteroidesuniformis”可互换使用。[0030] 所述的单形拟杆菌的菌株为BacteroidesuniformisATCC8492,来源于ATCC(AmericanTypeCultureCollection)，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ATCC8492。[0031] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。[0032] (一)实验材料[0033] 大鼠:SPF级SpragueDawley(SD)大鼠购自斯贝福生物技术有限公司，为正常饲养大鼠，6周龄，一共70只。大鼠生长过程处于同一环境，且喂养同样的食物。[0034] 菌株：BacteroidesuniformisATCC8492，来源于ATCC(AmericanTypeCultureCollection)，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ATCC8492。[0035] 常规大鼠饲料:无菌大鼠饲料购自斯贝福生物技术有限公司。[0036] (二)实验方案[0037] 将购回的70只6周龄SD雄性大鼠置于同一环境正常适应性饲养1周后开始正式实验。[0038] 选取正常喂养的SPF级6周龄SD雄性大鼠进行实验，通过行为学测试检测大鼠焦虑抑郁样行为，通过灌胃法为大鼠肠道引入BacteroidesuniformisATCC8492。[0039] 本实施例分2个阶段共7组：第1阶段为预防实验阶段，第2阶段为治疗实验阶段。第1阶段共设置3组,实验周期为4周，第1阶段结束后每组随机选取10只大鼠进行行为学测试检验大鼠焦虑抑郁样行为，剩余的大鼠进入第2阶段的治疗实验。第1阶段大鼠每组具体分组如下：[0040] 对照组(Free‑1，n＝20)：大鼠正常饲养4周，不做任何处理，而且不受其它组的影响。[0041] 慢性不可预刺激组(CUMS，n＝40)：大鼠接受4周的慢性不可预刺激。[0042] 慢性不可预刺激+BacteroidesuniformisATCC8492菌株组(CUMS+B.U，n＝10)：大鼠接受4周的慢性不可预刺激的同时灌胃4周BacteroidesuniformisATCC8492菌液。[0043] 第二阶段共设置4组，实验周期为4周，第2阶段结束后全部大鼠进行行为学测试检验大鼠焦虑抑郁样行为，每组具体分组如下：[0044] 对照组(Free‑2，n＝10)：大鼠继续正常饲养4周，不做任何处理，而且不受其他组的影响。[0045] 灌胃生理盐水组(Control，n＝10)：大鼠接受4周的慢性不可预刺激后灌胃4周生理盐水。[0046] 灌胃氟西汀组(Flx，n＝10)：大鼠接受4周的慢性不可预刺激后灌胃4周抗抑郁药物氟西汀(fluoxetine)。[0047] 灌胃BacteroidesuniformisATCC8492菌株组(B.U，n＝10)：大鼠接受4周的慢性不可预刺激后灌胃4周BacteroidesuniformisATCC8492菌。[0048] BacteroidesuniformisATCC8492菌株厌氧培养[0049] Bacteroidesuniformis菌株于厌氧工作站(Bactron，ShellabBACII)中37℃培养2‑3天，所使用的培养基为M2GSC培养基：Casitone,10g/L,Solarbio,China；YeastExtract,2.5g/L,ThermoFisher,USA；NaHCO3,4.0g/L,Sigma,USA；Glucose,2.0g/L,BeijingChemicalWorks,Beijing,China；SolubleStarch,2.0g/L,XilongScientific,Beijing,China；Cellobiose,2.0g/L,ThermoFisher,USA；Rumenfluid(clarified),10g/L,WizBiotech,China；Resazurin(0.1％w/w),1.0mL/L,ThermoFisher,USA；CysteineHCl,1.0g/L,Innochem,Beijing,China；K2HPO4,0.45g/L,Innochem,Beijing,China；KH2PO4,0.45g/L,BeijingChemicalWorks,Beijing,China；(NH4)2SO4,0.9g/L,GuanghuaSci‑Tech,Guangdong,China；NaCl,0.9g/L,BeijingChemicalWorks,Beijing,China；MgSO4,0.09g/L,BeijingChemicalWorks,Beijing,China；CaCl2,0.09g/L,Beijing9ChemicalWorks,Beijing,China。每只大鼠灌胃菌液浓度为1×10 CFU/mL，灌胃体积为1mL/只，频率为每天一次。菌液需提前培养，每周活化保证新鲜，并分别测定浓度。[0050] 慢性不可预压力[0051] 大鼠接受4周的慢性不可预压力：(1)禁食24小时；(2)禁水24小时；(3)摇晃1小时(160r.p.m)；(4)夹尾1分钟；(5)冷水游泳(4℃，5分钟)；(6)昼夜颠倒；(7)50℃热应激。7种不可预压力随机安排在1周，每天随机安排其中2种。未接受慢性不可预压力的大鼠按照常规饲养，保证不受其它组的影响。[0052] 行为学测试[0053] 为观察研究实验动物神经精神变化，进行了一系列的行为学测试，方法与过程如下：[0054] 1)旷场实验(OF)[0055] 旷场实验测试用于评估动物的焦虑样行为，通过测试动物在新奇开放环境下的自发性活动和探索行为，可用于评价其焦虑程度。将大鼠置于开放式设备(50×50×45cm)中心，让大鼠适应一分钟，然后使用Ethovision软件(Noldus,TrackSys,Nottingham,UK)记录5分钟自发活动。较低的中央区域(距边缘50％)停留时间及进入中央区域的次数作为焦虑样行为的指标。每只大鼠测试结束后放回饲养笼具内，同时清理设备，并用75％的乙醇擦拭内壁及底面以消除大鼠大小便及气味等对后继实验动物的影响。[0056] 2)高架十字迷宫实验(EPM)[0057] 高架十字迷宫是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。将大鼠引入四壁迷宫的中央区域，头朝开臂，此后每只大鼠均放在同一位置，两个开放臂(50×10cm)没有墙壁，两个闭合臂(50×10×30cm)有墙壁，迷宫高出地面一米。在迷宫正上方的摄像机被用来跟踪每只大鼠的运动，并用Ethovision软件(Noldus,TrackSys,Nottingham,UK)记录5分钟内大鼠在开放臂的停留时间以及进入开放臂的次数。较低的进入开放臂的频率和停留时间作为焦虑表现指标。每次实验后用70％乙醇清洗迷宫以消除大鼠大小便及气味等对后继实验大鼠的影响。[0058] 3)强迫游泳实验(FST)[0059] 强迫游泳实验用于评估动物抑郁样行为，其原理是当动物被放进一个有限的空间使之游泳，开始时拼命游泳力图逃脱，很快就变成漂浮不动状态，仅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶尔划动以保持身体不至于沉下去，实际是动物放弃逃脱的希望，属于行为绝望。将大鼠置于装有30cm高度水(25℃左右)的透明塑料桶(40×70cm)中，让大鼠适应一分钟，然后记录大鼠5分钟内的静止时间。静止是指动物保持头部在水面上没有额外的运动。静止时间作为大鼠抑郁样行为的表现指标。每次测试均更换一次实验用水以消除大鼠大小便及气味等对后继实验大鼠的影响。[0060] 实验结果[0061] 1.大鼠行为学测试(高架十字迷宫)比较结果见图2[0062] 预防实验中，相比对照组(Free‑1)，CUMS组大鼠在开放臂的停留时间有下降的趋势(图2A，P＝0.051,F(2，27)＝203.29)，进入开放臂的次数显著下降(图2B，P＝0.023,F(2，27)＝2.98)，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生焦虑样行为。而相比CUMS组，给予单形拟杆菌组(CUMS+B.U)大鼠在开放臂的停留时间显著增加(图2A，P<0.001,F(2，27)＝203.29)，表明单形拟杆菌可以预防缓解大鼠因慢性不可预刺激诱导的焦虑样行为。[0063] 治疗实验中，相比对照组(Free‑2)，Control组大鼠进入开放臂的次数显著下降(图2D，P＝0.041,F(3，34)＝2.98)，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生焦虑样行为。相比Control组大鼠，给予单形拟杆菌组(B.U)大鼠在开放臂的停留时间有增加的趋势(图2C，P＝0.077,F(3，35)＝1.34)，进入开放臂的次数显著增加(图2D，P＝0.018,F(3，34)＝2.98)，表明单形拟杆菌可以治疗缓解大鼠因慢性不可预刺激诱导的焦虑样行为。[0064] 2.大鼠行为学测试(旷场实验)比较结果见图3[0065] 预防实验中，相比对照组(Free‑1)，CUMS组大鼠在中央区域的停留时间(图3A，P＝0.0027,F(2，26)＝5.64)和进入中央区域的次数(图3B，P<0.001,F(2，27)＝9.81)都显著下降，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生焦虑样行为。而相比CUMS组，给予单形拟杆菌组(CUMS+B.U)大鼠在中央区域的停留时间显著增加(图3A，P＝0.046,F(2，26)＝5.64)，表明单形拟杆菌可以预防大鼠因慢性不可预刺激诱导的焦虑样行为。[0066] 治疗实验中，相比对照组(Free‑2)，Control组大鼠在中央区域的停留时间(图3C，P＝0.041,F(3，33)＝1.79)和进入中央区域的次数(图3D，P＝0.0074,F(3，34)＝2.96)都显著下降，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生焦虑样行为。相比Control组，给予单形拟杆菌组(B.U)大鼠在中央区域的停留时间有增加的趋势(图3C，P＝0.071,F(3，33)＝1.79)，表明单形拟杆菌可以治疗缓解大鼠因慢性不可预刺激诱导的焦虑样行为。[0067] 3.大鼠行为学测试(强迫游泳实验)比较结果见图4[0068] 预防实验中，相比对照组(Free‑1)，CUMS组大鼠的不动时间显著增加(图4A，P＝0.036,F(2，27)＝6.034)，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生抑郁样行为。而相比CUMS组，给予单形拟杆菌(CUMS+B.U)显著降低了大鼠的不动时间(图4A，P＝0.0019,F(2，27)＝6.034)，表明单形拟杆菌可以预防大鼠因慢性不可预刺激诱导的抑郁样行为。[0069] 治疗实验中，相比对照组(Free‑2)，Control组大鼠的不动时间显著增加(图4B，P<0.001,F(3，35)＝41.87)，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生抑郁样行为。而相比Control组，给予单形拟杆菌(B.U)显著降低了大鼠的不动时间(图4B，P<0.001,F(3，35)＝41.87)，表明单形拟杆菌可以治疗缓解大鼠因慢性不可预刺激诱导的抑郁样行为。[0070] 结论[0071] 总之，上述研究结果首次证明了，单形拟杆菌可预防和治疗大鼠因慢性不可预压力诱导的焦虑样和抑郁样行为。本结果为单形拟杆菌在作为制备预防和治疗焦虑症和抑郁症药物中的应用提供了强有力的实验支撑。[0072] 本申请提供一株具有改善焦虑抑郁症的BacteroidesuniformisATCC8492。本申请以SD大鼠为实验对象，证明单形拟杆菌ATCC8492具有改善焦虑抑郁症的作用。[0073] 应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述的菌液浓度和/菌株。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。

专利地区：北京

专利申请日期：2022-03-17

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114452305B