一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法

专利名称：一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111631428.2

专利申请（专利权）人：苏州百奥吉生物科技有限公司
权利人地址：江苏省苏州市中国(江苏)自由贸易试验区苏州片区苏州工业园区苏虹西路99号第3幢B区413室

专利发明（设计）人：王越,周志成,高峰

专利摘要：本发明提供了一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，采用一种新型的制备和交联方式将壳聚糖接枝到琼脂糖上，有效改善了微球内部的孔道结构和交联密度，由于壳聚糖的改性修饰，使其比传统琼脂糖微球具有更高的机械强度和流速，也具有了更大的孔径和更高的载量，并提高了产品耐久性，大大拓宽了微球的应用范围和工作环境，适合在大规模分离纯化中应用，并且制备工艺要求低，操作简单，便于实现大规模生产制备。

主权利要求：
1.一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，包括如下步骤：
（1）在乙酸‑抗坏血酸混合溶液中加入壳聚糖，配制成质量体积比1g∶20‑35ml的壳聚糖溶液，搅拌溶解，待完全溶解后进行超声脱气；将琼脂糖溶于去离子水中，溶液浓度为4‑
6wt%，水浴加热至70‑95℃，加入琼脂糖溶液5%体积的无机盐离子溶液，降温至50‑70℃，继续搅拌1‑3小时；
（2）琼脂糖溶液中加入50%氢氧化钠和乙二醇二缩水甘油醚，所述50%氢氧化钠与琼脂糖溶液的体积比为0.05‑0.5：1，所述乙二醇二缩水甘油醚与琼脂糖溶液的体积比为0.15‑
1：1，搅拌60‑90min，然后将壳聚糖溶液在1h‑1.5h内匀速滴加至琼脂糖溶液中，壳聚糖溶液与琼脂糖溶液体积比为2‑4:1，并继续搅拌3‑6小时，后用乙酸调pH至7.0，得到水相；
（3）将乳化剂按照质量体积比0.02‑2g：100ml加入甲苯和全合成机油的混合液中，搅拌均匀，得到油相，加热至60℃，对油相通入氮气，加入沸石颗粒，再将步骤（2）水相加入油相中，油相与水相的体积比例为2‑3:1，搅拌1‑2h，制得将壳聚糖接枝于琼脂糖的液滴的乳液；
（4）停止通气，降温至10℃以下，使微球完全固化；
（5）将再生溶液以乳液体积的2‑3倍加入到乳液中，并充分机械搅拌后得到复合微球；
（6）将复合微球用乙醇和去离子水清洗，并浸泡在复合微球1‑2倍质量的交联剂中1‑2小时，抽干后加入体积与复合微球质量比为1‑3ml：1g的二甲基亚砜，边搅拌边滴加复合微球质量的15‑25%的环氧氯丙烷和10‑20%的50%氢氧化钠溶液，反应8‑12小时，出料并用乙醇和去离子水清洗，所述交联剂包括2，3‑二溴丙醇或环氧氯丙烷；再将步骤（6）操作重复一次。
2.根据权利要求1所述的一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述乙酸‑抗坏血酸混合溶液是在体积百分比为1‑5%的乙酸中加入L型抗坏血酸形成的质量体积浓度为0.6‑1.0%的乙酸‑抗坏血酸混合溶液；加入琼脂糖溶液5%体积的质量体积浓度为5‑15%的无机盐离子溶液；所述无机盐离子溶液中的无机盐包括氯化钠、磷酸钠、碳酸钠或氯化钾。
3.根据权利要求1所述的一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙二醇二缩水甘油醚可替换为丁二醇缩水甘油醚、环氧氯丙烷或烯丙基缩水甘油醚。
4.根据权利要求1所述的一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述乳化剂包括NP‑10、Span60、MOA‑3P、TP‑10、AEO‑5中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，甲苯和全合成机油的混合体积比例为3‑4：2。
6.根据权利要求1所述的一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，全合成机油可替换为液体石蜡、煤油、二甲苯的两种或多种混合。
7.根据权利要求1所述的一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述再生溶液包括甲醇、乙醇、二氯甲烷、二氯乙烷、环氧氯丙烷或丙酮。
8.根据权利要求1所述的一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，在100‑200rpm转速和60℃温度条件下进行搅拌；步骤（6）中，在
100‑250rpm转速和40‑50℃温度条件下进行搅拌。
9.权利要求1‑8任意一项所述的一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法制得的大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球。 说明书 : 一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法技术领域[0001] 本发明属于琼脂糖微球制备技术领域，涉及一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法。背景技术[0002] 壳聚糖为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，其分子结构为2‑乙酰氨基‑2‑脱氧‑D‑吡喃葡萄糖和2‑氨基‑2‑脱氧‑D‑吡喃葡萄糖通过糖苷键连接起来的聚合物。琼脂糖为来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，其中约70％为琼脂糖，30％为支链琼脂糖。琼脂糖具线型结构，由D‑半乳糖和3，6‑脱水半乳糖通过β‑1，4和α‑1，3连接交替形成重复双糖单位。支链琼脂糖则从β‑1，3键分出另一链。这类天然多糖制成的微球具有比表面积大、生物相容性好、易于化学修饰等特点，但单一成分制成的微球力学性能较差，机械强度低，孔径小，使用寿命较短。发明内容[0003] 本发明旨在改善传统琼脂糖微球机械强度差，孔径小，流速低的特征，进而制备出一种机械强度大，流速快，结合载量高的大孔径壳聚糖接枝琼脂糖微球。[0004] 为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：[0005] 本发明提供了一种大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球的制备方法，包括如下步骤：[0006] (1)在乙酸‑抗坏血酸混合溶液中加入壳聚糖，配制成1∶(20‑35)(W/V，指壳聚糖的质量与乙酸‑抗坏血酸混合溶液的体积的比)的壳聚糖溶液，搅拌溶解，待完全溶解后进行超声脱气；将琼脂糖溶于去离子水中，溶液浓度大约为4‑6wt％，水浴加热至70‑95℃，加入琼脂糖溶液5％体积的无机盐离子溶液，降温至50‑70℃，继续搅拌1‑3小时。[0007] (2)琼脂糖溶液中加入(0.05‑0.5)：1(V/V，指50％氢氧化钠的体积与琼脂糖溶液的体积的比)的50％氢氧化钠和(0.15‑1)：1(V/V，指乙二醇二缩水甘油醚的体积与琼脂糖溶液的体积的比)的乙二醇二缩水甘油醚，搅拌60‑90min，然后将壳聚糖溶液在1h‑1.5h内匀速滴加至琼脂糖溶液中，壳聚糖溶液与琼脂糖溶液体积比为(2‑4):1。并继续搅拌3‑6小时，后用乙酸(优选体积浓度为50‑65％乙酸)调pH至7.0。[0008] (3)将乳化剂以(0.02‑2):100(W/V，指乳化剂的质量和混合液的体积的比)比例加入甲苯和全合成机油的混合液中(甲苯和全合成机油的体积比为3.5:2)，搅拌均匀，加热至60℃。对油相通入氮气，加入沸石颗粒，再将步骤(2)混合糖溶液加入油相中，油相与水相的体积比例为(2‑3):1。搅拌1‑2h左右，制得将壳聚糖接枝于琼脂糖的液滴的乳液；[0009] (4)停止通气，降温至10℃以下，使微球完全固化。[0010] (5)将再生溶液以乳液体积的2‑3倍加入到乳液中，并充分机械搅拌后得到复合微球。[0011] (6)将复合微球用乙醇和去离子水清洗，并浸泡在(复合微球)1‑2倍质量的交联剂中1‑2小时，抽干后加入体积与复合微球质量比为(1‑3)：1的二甲基亚砜(二甲基亚砜的体积和复合微球质量的比ml/g)，边搅拌边滴加复合微球质量的15‑25％环氧氯丙烷和(复合微球质量的)10‑20％的50％氢氧化钠溶液。反应8‑12小时，出料并用乙醇和去离子水分别清洗，再将步骤(6)操作重复一次。[0012] 优选地，步骤(1)中，所述乙酸‑抗坏血酸混合溶液是在1‑5％(V/V)乙酸中加入抗坏血酸(L型)形成0.6‑1.0％(W/V，指抗坏血酸的质量与1‑5％乙酸的体积的比g/ml)浓度的乙酸‑抗坏血酸混合溶液；加入琼脂糖溶液5％体积的5‑15％(W/V，指无机盐的质量与溶液的体积的比)的无机盐离子溶液；所述无机盐离子溶液中的无机盐包括但不限于氯化钠，磷酸钠，碳酸钠，氯化钾等起类似作用的化合物。[0013] 优选地，步骤(2)中，所述乙二醇二缩水甘油醚可替换为丁二醇缩水甘油醚，环氧氯丙烷，烯丙基缩水甘油醚等起类似作用的化合物。[0014] 优选地，步骤(3)中，所述乳化剂包括但不限于NP‑10，Span60，MOA‑3P，TP‑10，AEO‑5中的一种或多种，更优选TP‑10和AEO‑5。[0015] 优选地，步骤(3)中，甲苯和全合成机油的质量比为(3‑4)：2。优选地，步骤(3)中，全合成机油可替换为液体石蜡，煤油，二甲苯，等起类似作用的物质的两种或多种混合。[0016] 优选地，步骤(5)中，所述再生溶液包括但不限于甲醇，乙醇，二氯甲烷，二氯乙烷，环氧氯丙烷或丙酮等作用类似的溶剂或溶液，更优选环氧氯丙烷或丙酮。[0017] 优选地，步骤(6)中，所述交联剂包括2，3‑二溴丙醇或环氧氯丙烷。[0018] 更优选地，步骤(3)中，在100‑200rpm转速和60℃温度条件下进行搅拌。步骤(6)中，在100‑250rpm转速和40‑50℃温度条件下进行搅拌。[0019] 本发明还提供了通过上述制备方法制得的大孔径高载量壳聚糖接枝琼脂糖复合微球。[0020] 本发明与现有产品和工艺相比，具有以下优点：[0021] (1)本发明将壳聚糖接枝琼脂糖后使微球整体机械强度明显提升，流速更快；[0022] (2)本发明微球内部孔径较传统琼脂糖微球更大，在层析应用中具有更高的载量和更高的分离效率；[0023] (3)本发明在壳聚糖溶解时便进行改性处理，使其具有更好的溶解度和反应活性，从而提高反应速率，较常规溶解方式大大缩短了反应时间；[0024] (4)本发明不仅可以应用于蛋白层析领域，也可用于中药成分提取和色素去除方面。[0025] (5)本发明制备工艺要求低，操作简单，便于实现大规模生产制备。附图说明[0026] 图1是本发明复合微球显微镜照片。[0027] 图2是本发明测试例中的压力‑流速对比曲线。[0028] 图3是本发明测试例中的分离图谱。[0029] 图4是本发明测试例中的Kav对比曲线。具体实施方式[0030] 为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。[0031] 本发明中，W/V的单位是g/ml，wt％为质量百分数(溶质的质量占全部溶液的质量的百分比)。[0032] 实施例1[0033] (1)在200ml1％(V/V)乙酸中加入2g抗坏血酸(L型)溶解得到1.0％(W/V)浓度的乙酸‑抗坏血酸混合溶液，再加入10g壳聚糖从而配制成1∶20(W/V)的壳聚糖溶液，搅拌至充分溶解，待完全溶解后进行超声脱气3min；将4g琼脂糖溶于100ml去离子水中，溶液浓度为4wt％，在100rpm转速下搅拌，水浴加热至70℃，加入5ml5％(W/V)磷酸钠盐溶液，搅拌1小时，再降温至50℃，继续搅拌1小时。[0034] (2)琼脂糖溶液中加入5ml50％氢氧化钠和15ml乙二醇二缩水甘油醚，搅拌60min，然后将全部壳聚糖溶液在1‑1.5h内匀速滴加至琼脂糖溶液中，并继续搅拌3小时，后用50％乙酸调pH至7.0。[0035] (3)将10g乳化剂TP‑10和AEO‑5(质量比2：3)加入550ml甲苯和全合成机油混合液中(甲苯和全合成机油的体积比为3.5:2)，搅拌均匀，加热至60℃。对油相通入氮气，加入30g沸石颗粒。再取275ml步骤(2)混合糖溶液加入油相中并在100rpm转速下(60℃)机械搅拌1h左右，制得将壳聚糖接枝于琼脂糖的液滴的乳液(约830ml)；[0036] (4)停止通气，利用冰水浴对其降温至10℃以下，使微球完全固化。[0037] (5)将2L环氧氯丙烷加入到乳液中，并充分机械搅拌后再生得到复合微球约300g。[0038] (6)将复合微球用乙醇清洗3遍，再用去离子水清洗5‑6遍，抽干并浸泡在300g环氧氯丙烷中2小时，抽干后加入300ml二甲基亚砜，在50℃和200rpm搅拌速率下，滴加45g环氧氯丙烷和30g50％氢氧化钠溶液。反应8小时，出料，用乙醇清洗2遍，再用去离子水清洗5遍。再将步骤(6)重复一次，增加微球交联强度。[0039] 实施例2[0040] (1)在300ml3％(V/V)乙酸中加入2.1g抗坏血酸(L型)溶解得到0.7％(W/V)浓度的乙酸‑抗坏血酸混合溶液，再加入10g壳聚糖从而配制成1∶30(W/V)的壳聚糖溶液，搅拌至充分溶解，待完全溶解后进行超声脱气3min；将5g琼脂糖溶于100ml去离子水中，溶液浓度为5wt％，在150rpm转速下搅拌，水浴加热至90℃。加入5ml10％(W/V)磷酸钠盐溶液，搅拌1小时，再降温至65℃，继续搅拌1小时。[0041] (2)琼脂糖溶液中加入25ml50％氢氧化钠和60ml丁二醇缩水甘油醚，搅拌75min，然后将全部壳聚糖溶液在1h‑1.5h内匀速滴加至琼脂糖溶液中，并继续搅拌4小时，后用60％乙酸调pH至7.0。[0042] (3)将10g乳化剂TP‑10和AEO‑5(质量比3：2)加入550ml甲苯和全合成机油混合液中(体积比为3.5:2)，搅拌均匀，加热至60℃。对油相通入氮气，加入30g沸石颗粒。再取200ml步骤(2)混合糖溶液加入油相中并在150rpm转速下机械搅拌1h左右，制得将壳聚糖接枝于琼脂糖的液滴的乳液(约750ml)；[0043] (4)停止通气，利用冰水浴对其降温至10℃以下，使微球完全固化。[0044] (5)将2L丙酮加入到乳液中，并充分机械搅拌后再生得到复合微球约220g。[0045] (6)将复合微球用乙醇清洗3遍，再用去离子水清洗5‑6遍，抽干并浸泡在330g环氧氯丙烷中2小时，抽干后加入440ml二甲基亚砜，在50℃和200rpm搅拌速率下，滴加45g环氧氯丙烷和33g50％氢氧化钠溶液。反应10小时，出料，用乙醇清洗2遍，再用去离子水清洗5遍。再将步骤(6)重复一次，增加微球交联强度。[0046] 实施例3[0047] (1)在400ml5％(V/V)乙酸中加入2.4g抗坏血酸(L型)溶解得到0.6％(W/V)浓度的乙酸‑抗坏血酸混合溶液，再加入11.4g壳聚糖从而配制成1∶35(W/V)的壳聚糖溶液，搅拌至充分溶解，待完全溶解后进行超声脱气3min；将6g琼脂糖溶于100ml去离子水中，溶液浓度为6wt％，在150rpm转速下搅拌，水浴加热至95℃。加入5ml15％(W/V)磷酸钠盐溶液，搅拌1小时，再降温至70℃，继续搅拌1小时。[0048] (2)琼脂糖溶液中加入50ml50％氢氧化钠和100ml环氧氯丙烷，搅拌90min，然后将全部壳聚糖溶液匀速滴加至琼脂糖溶液中，并继续搅拌4小时，后用65％乙酸调pH至7.0。[0049] (3)将10g乳化剂TP‑10和AEO‑5(质量比2:3)加入550ml甲苯和全合成机油混合液中(体积比为3.5:2)，搅拌均匀，加热至60℃。对油相通入氮气，加入30g沸石颗粒。再取180ml步骤(2)混合糖溶液加入油相中并在100rpm转速下机械搅拌1h左右，制得将壳聚糖接枝于琼脂糖的液滴的乳液(约730ml)；[0050] (4)停止通气，利用冰水浴对其降温至10℃以下，使微球完全固化。[0051] (5)将2L环氧氯丙烷加入到乳液中，并充分机械搅拌后再生得到复合微球约200g。[0052] (6)将复合微球用乙醇清洗3遍，再用去离子水清洗5‑6遍，抽干并浸泡在400g环氧氯丙烷中2小时，抽干后加入600ml二甲基亚砜，在50℃和200rpm搅拌速率下，滴加50g环氧氯丙烷和40g50％氢氧化钠溶液。反应12小时，出料，用乙醇清洗2遍，再用去离子水清洗5遍。再将步骤(6)重复一次，增加微球交联强度。[0053] 测试例[0054] 一、外观检测[0055] 如图1所示，本发明复合微球在显微镜下外观圆润透明，无碎球和畸形球，从而说明乳化方式和各项参数有效可靠；粒径分布在45‑165μm之间，符合商业化分离介质的粒径分布要求。[0056] 二、流速测试[0057] 1.分别称取100g本发明实施例3制备的复合微球和用作对照的Sepharose6FF琼脂糖微球产品，加入100ml纯水中，充分混匀，倒入26/30层析柱中，自然沉降15min。[0058] 2.在0.1MPa下压柱6min，记录柱高h。[0059] 3.在不同压力下下进行流速测定。测定收集0.1MPa下流出液体积500ml视所需时间，单位s。[0060] 记录流出液的温度T(相应温度条件下对应不同的粘度系数i)[0061] 4.计算公式：[0062] 5.将记录数据进行汇总，并制作压力‑流速对比曲线，如图2所示，可见本发明复合微球在相同压力下较同类型商业化产品具有更高的流速，并且可以耐受更高的压力，流速也同样具有很好的线性关系。以上可表明本发明具有高流速，高耐压的特征。[0063] 三、分离效果测试[0064] 1.化学修饰：①取以本实施例3产品复合微球50g加入100ml三口烧瓶中，加入25g纯水，搅拌加入15g环氧氯丙烷和5g50％氢氧化钠，搅拌均匀，30℃反应2h。出料，用纯水清洗10遍。②将微球加入250ml三口瓶内，加入40ml蛋白A溶液，32℃反应3h。出料，0.1MPBpH8.0清洗3遍。[0065] 2.取上述化学修饰复合微球4.6ml，装入直径1cm的柱子中。[0066] 配制缓冲液：PBS，pH7.4。配制200ml29.5mg/ml抗体A‑辛酸硫铵粗纯样品和100ml29.5mg/ml抗体A‑辛酸硫铵粗纯样品，过滤。[0067] 3.用缓冲液平衡柱子5‑10个柱体积，然后分两次上样。完后再用缓冲液清洗柱子5‑10个柱体积。[0068] 4.再用0.1M柠檬酸‑柠檬酸钠，pH3.0缓冲液洗脱5‑10柱体积。两次分别洗脱下来抗体145mg和77mg。[0069] 5.如图3所示，通过对实施例3本产品复合微球化学修饰后的产品，对于蛋白样品具有很好的分离纯化效果，并且通过洗脱下来的抗体量可以反映出其具有很高的蛋白载量。[0070] 四、孔径分布测试[0071] 微球内部孔径分布常用分配系数Kd来侧面显示，Kd可以看作是溶质分子能够进入的内水体积占总的内水体积的比例。Kd越大表明可以进入的内水体积越多，进而反映内部孔径越大。[0072] 其中： (范围在0‑1)[0073] Vo＝排阻体积/外水体积[0074] Vr＝保留体积/洗脱体积[0075] Vt＝总液体积[0076] 1.取100g本发明复合微球和用作对照的Sepharose6FF琼脂糖微球产品，用纯水清洗5遍，抽干。再用纯水配成50％胶液，充分混匀，倒入26/30层析柱中，自然沉降15min。[0077] 2.再进行压柱，记录柱高h＝17.4cm。[0078] 3.配制缓冲液：20mMPB+0.15MNaClpH＝7.0。[0079] 4.样品：①2mg/ml蓝色葡聚糖2000；②混合样品：2.5mg/mlIgG、5mg/ml核糖核酸酶A(溶解于缓冲液中)；③1％丙酮[0080] 5.上样：按照样品③‑①‑②的顺序进行上样，记录保留体积，绘制Kav曲线。结果如表1和图4所示，可见本发明复合微球具有更高的分配系数Kav值，从而具有更大的孔径分布。[0081] 表1是本发明测试例中的Kav对比数值[0082][0083] 本发明采用一种新型的制备和交联方式将壳聚糖接枝到琼脂糖上，有效改善了微球内部的孔道结构和交联密度，由于壳聚糖的改性修饰，使其比传统琼脂糖微球具有更高的机械强度和流速，也具有了更大的孔径和更高的载量，并提高了产品耐久性，大大拓宽了微球的应用范围和工作环境，适合在大规模分离纯化中应用。[0084] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

专利地区：江苏

专利申请日期：2021-12-29

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114377629B