一种不同蒸制次数酒黄精饮片的高效液相指纹糖谱的构建方法

专利名称：一种不同蒸制次数酒黄精饮片的高效液相指纹糖谱的构建方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111645269.1

专利申请（专利权）人：吉林化工学院
权利人地址：吉林省吉林市龙潭区承德街45号

专利发明（设计）人：周鸿立,单佳乐,刘可欣,张萌,杨凤,王玉洁,朱孟楠,曹冬雪

专利摘要：本发明公开了一种不同蒸制次数酒黄精饮片的高效液相指纹图谱糖谱的构建方法。通过采用高效液相色谱和中药指纹图谱相似度评价系统构建不同蒸制次数酒黄精饮片的指纹图谱；确定不同蒸制次数酒黄精饮片的指纹图谱中含有8个共有特征单糖成分，分别为甘露糖（Man）、氨基葡萄糖盐酸盐（GluN）、核糖（Rib）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Arab）；本发明的方法具有样品用量小、特征性强、结果可靠的特点，便于中药材炮制方向推广应用。

主权利要求：
1.一种不同蒸制次数酒黄精饮片的高效液相指纹糖谱的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将黄精生品饮片反复蒸制三次，分别得到一蒸、二蒸、三蒸酒黄精饮片；具体的，每
100kg黄精饮片加20kg黄酒，在黄酒中按酒水比1：1.875加水，使黄精能完全搅拌均匀，闷润
80min，蒸制时间6h、干燥温度70℃、干燥时间13h，得一蒸酒黄精饮片，重复以上步骤得二蒸、三蒸酒黄精饮片；
对生品饮片、一蒸、二蒸及三蒸饮片进行多糖的提取；具体为，取黄精饮片粉碎过60目筛；通过热水回流法按料液比1:15g/ml，提取温度为75℃，提取时间2h，提取两次；合并滤液浓缩，冷冻干燥，得到粗多糖粉末；
纯化：
棉状DEAE纤维素预处理：取棉状DEAE纤维素，用蒸馏水浸泡24h，使其充分溶胀，用布氏漏斗抽滤；再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡2‑3h，抽滤，用蒸馏水反复洗涤，直至洗至pH值7左右；再用0.5mol/L的HCl溶液浸泡2‑3h，再用蒸馏水反复洗至PH值7左右，抽干备用；
取1g粗多糖配置成16.7mg/ml的溶液；称取定量的处理好的棉状DEAE纤维素进行超声去气泡上柱，按比例上样，黄精粗多糖：抽干的棉状DEAE＝1:70g/g；用滴管围绕柱子四周缓慢上样防止糖有大幅度震荡，吸附24h；调节柱子使流速1mg/mL，先用蒸馏水洗脱，至用苯酚‑硫酸法检测后不显色；即可用高浓度0.5mol/L的NaCl洗脱，洗脱至苯酚‑硫酸法检测不显色；收集洗脱液，将水洗与盐洗的洗脱液分别进行浓缩；浓缩后，水洗的洗脱液直接进行冷冻干燥；盐洗的洗脱液透析24h除色素后，再冷冻干燥，得到纯化水洗多糖、盐洗多糖粉末；
样品预处理和测定：分别精密称取多糖5mg，加入2mL2mol/L的三氟乙酸(TFA)，放入水热反应器中，在110℃条件下，水解6h，在此之后，将水解液彻底蒸发，并在进一步干燥，用
95％乙醇将所得粉末样品重新溶解，将粉末样品的再蒸发过程重复至少四次，以去除任何残留的TFA，溶解于60％乙腈中，离心取上清液，过0.45μm的微孔滤膜，进样检测；
将纯化后的多糖样品进行HPLC测定单糖组成，建立高效液相色谱仪指纹糖谱；具体为，采用PMP柱前衍生化法测定单糖组分，色谱条件：ThermUltimate3000高效液相色谱仪(HPLC)与ThermoU3000二极管阵列检测器(DAD)联合使用，液相色谱柱为SupersilODS2柱，5μm，4.6mm×250mm，进样量：20μL；流动相：PBS，pH＝6.8，乙腈，82:18v/v；流速；0.8mL/min；
柱温：30℃；检测器波长245nm；运行时间为：85min，以甘露糖(Man)、核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GluA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)，木糖(Xyl)，阿拉伯糖(Arab)，岩藻糖(Fuc)和氨基葡萄糖盐酸盐(GluN)11种单糖作为标准单糖，所述指纹糖谱共确定了8个共有峰，分别为Man、GluN、Rib、Rha、GalA、Glu、Gal、Arab。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：黄精饮片多糖的主要成分是Glue、Fuc、Arab及Gal，生品纯化水洗的多糖含量最多的是Glu，其次是Fuc和Gal，盐洗的含量最多的是Fuc，其次是Glu和Gal；一蒸纯化水洗的多糖与其他几组相比所含单糖种类最少，只含有9种单糖，主要含有Glu、Gal及Fuc，盐洗的相比于其他几组，其单糖的含量普遍增多，其中Gal占比最大；二蒸纯化水洗的多糖占比最多的是Gal，其次Glu和GalA，盐洗的含量最高的是Gal，其次是Glu；三蒸纯化水洗的多糖中Glu含量最高，其次是Gal和Man，盐洗的含量最高的是Gal；黄精饮片多糖中GluN的含量最少。 说明书 : 一种不同蒸制次数酒黄精饮片的高效液相指纹糖谱的构建
方法技术领域[0001] 本发明属于中药材饮片炮制活性成分检测领域，具体涉及一种不同蒸制次数酒黄精饮片的高效液相指纹糖谱的构建方法。背景技术[0002] 黄精(PolygonatumsibiricumRed.)为百合科黄精属草本植物，主要分布在东北地区，分为黄精、滇黄精和多花黄精。其味甘、性平，归脾、肺、肾经，有着补气养阴，健脾，益肾，润肺的功效。但服用生黄精时，会口舌麻木、刺激性，故需炮制后入药，亦可增强疗效，黄精的炮制大多以蒸制为主。黄精作为药食同源的中药，其化学成分主要为多糖、皂苷、黄酮、木脂素、氨基酸以及微量元素、挥发油等。其中，黄精多糖是其主要成分，具有降血糖、降血脂等药理作用。多糖是2020版《中国药典》规定的黄精的唯一质量控制成分，但是对于炮制后黄精多糖的变化研究尚浅。[0003] 在中药日益重要的背景下，野生生长的中药已经不能满足市场的需要，而通过人工栽培，也无法解决因生长环境、运输、储存及加工处理等因素而影响中药的化学成分的问题，因此质量监控成为了一个重要的研究课题。[0004] 中药指纹图谱技术目前是国内外公认的用于中药质量控制的最有效、准确、直接的方法之一。它所提供的信息多，更为全面的反映了所含化学成分的种类及含量，同时体现了中药成分的整体作用,以评价中药的质量，不仅应用于中药的质量控制，而且广泛应用于中药的药效物质基础研究等方面。[0005] 多糖的质量研究的重点在于单糖组成、分子量、构型等。炮制后黄精多糖的分子结构变化决定了黄精的品质疗效。只有充分了解多糖的结构特点，才能更好的利用其药理作用，因此构建酒黄精炮制饮片多糖的指纹图谱糖谱对饮片炮制控制有重要意义。发明内容[0006] 基于以上背景技术，本发明的主要目的是提供一种不同蒸制次数酒黄精饮片的高效液相指纹糖谱构建方法，能展示生品、一蒸、二蒸和三蒸饮片多糖特征，为中药材饮片炮制控制及药效提供依据。[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：[0008] （1）将黄精生品饮片反复蒸制三次，每100kg黄精饮片加20kg黄酒，在黄酒中加入适量水使黄精能完全搅拌均匀，酒水比1：1.875（分批次拌入），闷润80min，蒸制时间6h、干燥温度70ºC、干燥时间13h，得一蒸酒黄精饮片，重复以上步骤得二蒸、三蒸酒黄精饮片。[0009] （2）炮制好的饮片粉碎过60目筛，通过热水回流法按料液比为1:15g/ml，温度75ºC，提取两次，每次2h，提取液浓缩，冷冻干燥，得固体粉末粗多糖，经棉状DEAE纤维素纯化。[0010] （3）取1g粗多糖配置成16.7mg/ml的溶液。称取棉状DEAE纤维素超声去气泡上柱，按比例上样（粗多糖：抽干的棉状DEAE=1:70(g/g)），吸附24h。调整流速1mg/ml，用蒸馏水洗脱，得水洗纯化多糖，再用高浓度（0.5mol/l）的NaCl洗脱，得盐洗纯化多糖（盐洗的洗脱液需透析24h除色素）。[0011] （4）采用PMP柱前衍生化法测定单糖组分。色谱条件：ThermUltimate3000高效液相色谱仪（HPLC）与ThermoU3000二极管阵列检测器（DAD）联合使用，液相色谱柱为SupersilODS2柱（5μm，4.6mm×250mm）。进样量：20μL；流动相：PBS（pH=6.8）和乙腈（82:18v/v）；流速；0.8mL/min；柱温：30ºC；检测器波长245nm；运行时间为：85min。[0012] （5）采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件对黄精多糖的HPLC指纹图谱数据进行数据处理，以S1样品指纹图谱为参照谱，时间窗宽度为0.1，采用中位数法生成了对照指纹图谱。共确定了8个共有峰，分别为Man、GluN、Rib、Rha、GalA、Glu、Gal、Arab。相似度分析，可以得出多糖的相似度在0.9以上，符合中药色谱指纹图谱相似度的要求。[0013] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：[0014] 本发明首次对不同蒸制次数的酒黄精饮片多糖进行分析，并构建单糖组成指纹图谱，确定了8个共有特征单糖峰，相似度在0.9以上，符合中药色谱指纹图谱相似度的要求，为酒黄精饮片炮制药效成分控制提供依据。[0015] 图1是对照指纹图谱（中位数法）（1‑8号色谱峰为各批次共有峰）；图2是不同蒸制次数的饮片多糖样品HPLC指纹图谱。具体实施方式[0016] 本发明结合附图和实施例作进一步说明，以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。[0017] 实例1酒黄精饮片炮制[0018] 参照CN113616729A中所公开的炮制工艺，每100kg黄精饮片加20kg黄酒，在黄酒中加入适量水使黄精能完全搅拌均匀，酒水比1：1.875（分批次拌入），闷润80min，蒸制时间6h、干燥温度70ºC、干燥时间13h，得一蒸酒黄精饮片，重复以上步骤得二蒸、三蒸酒黄精饮片。[0019] 实例2多糖的提取与纯化[0020] 1.提取[0021] 取黄精饮片粉碎过60目筛。通过热水回流法按料液比1:15（g/ml），提取温度为75ºC，提取时间2h，提取两次。合并滤液浓缩，冷冻干燥，得到粗多糖粉末，以便下一步纯化。[0022] 2.纯化[0023] 棉状DEAE纤维素预处理：取棉状DEAE纤维素，用蒸馏水浸泡24h，使其充分溶胀，用布氏漏斗抽滤；再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡2‑3h，抽滤，用蒸馏水反复洗涤，直至洗至pH值7左右；再用0.5mol/L的HCl溶液浸泡2‑3h，再用蒸馏水反复洗至PH值7左右，抽干备用。[0024] 上柱：取1g粗多糖配置成16.7mg/ml的溶液。称取定量的处理好的棉状DEAE纤维素进行超声去气泡上柱，按比例上样(黄精粗多糖：抽干的棉状DEAE=1:70(g/g))。用滴管围绕柱子四周缓慢上样防止糖有大幅度震荡，吸附24h。调节柱子使流速1mg/mL，先用蒸馏水洗脱，至用苯酚‑硫酸法检测后不显色；即可用高浓度（0.5mol/L）的NaCl洗脱，洗脱至苯酚‑硫酸法检测不显色。收集洗脱液，将水洗与盐洗的洗脱液分别进行浓缩。浓缩后，水洗的洗脱液直接进行冷冻干燥；盐洗的洗脱液透析24h除色素后，再冷冻干燥，得到纯化水洗多糖、盐洗多糖粉末，不同蒸制次数黄精多糖水洗、盐洗的得率见表1。[0025] 表1不同蒸制次数黄精多糖水洗、盐洗的得率[0026][0027] 实例2单糖组分的测定[0028] 单糖线性回归方程绘制：分别精密称取Man6mg、Rib5mg、Rha10mg、GluA5mg、GalA10mg、Glu10mg、Gal10mg、Xyl4mg、Arab10mg、Fuc10mg、GluN6mg混合，以60%乙腈为溶剂定容至10mL，配制成11种单糖混合标准品溶液。分别取混合标准品溶液1mL，以60%乙腈为稀释溶剂，稀释3倍、6倍、10倍、12倍和24倍，得到具有一定浓度梯度的11种单糖混合标准溶液，以单糖浓度（c）的对数值（logc）为横坐标，峰面积（S）的对数值（logS）为纵坐标进行线性回归，得11种单糖的线性回归方程。此外，根据实际检测结果继续稀释混合标准品溶液，直到检测出各种单糖的信号峰的信噪比（S/N）不小于10（即定量限）和信噪比（S/N）不小于3（即检测限）。精密度测试，11种单糖的混合标准溶液，重复进样6次，从而绘制单糖2标准曲线，见表2，相关系数R都在0.99以上，表明单糖组分的各个浓度与峰面积拟合度好，具有较好的线性关系。[0029] 样品预处理和测定：分别精密称取多糖5mg，加入2mL2mol/L的三氟乙酸（TFA），放入水热反应器中，在110ºC条件下，水解6h。在此之后，将水解液彻底蒸发，并在进一步干燥，用95%乙醇将所得粉末样品重新溶解，将粉末样品的再蒸发过程重复至少四次，以去除任何残留的TFA。溶解于60%乙腈中，离心取上清液，过0.45μm的微孔滤膜，进样检测，得分离的峰面积代入线性回归方程中，计算其各单糖的质量浓度，计算单糖组分摩尔比。[0030] 色谱条件：单糖的液相色谱分析采用高效液相色谱联合蒸发光检测器（HPLC‑ELSD），色谱柱采用SupersilNH2‑S5μm(4.6mm×250mm)色谱柱，高效液相采用赛默飞Ultimate3000，使用Chromeleon7.2软件记录并数据处理，干燥空气作为载气，进样量20μL。色谱条件设置为：流动相为乙腈和水（75:25v/v）；流速1.0mL/min；雾化温度35ºC；柱温30ºC；蒸发温度45ºC；运行时间40min；增益1；气体压力27psi。[0031] 表211种单糖标准品的标准曲线[0032][0033] 根据表3可以看出11种标准品的出峰时间依次是Man（15.96min）、GluN（18.559min）、Rib（20.92min）、Rha（22.48min）、GluA（24.38min）、GalA（27.17min）、Glu（32.05min）、Gal（36.10min）、Xyl（39.01min）、Arab（40.15min）、Fuc（47.45min）。将样品的峰面积带入到单糖标准曲线，计算单糖摩尔比。[0034] 表3标准品的平均保留时间[0035][0036] \[0037] 表4生品、一蒸、二蒸、三蒸黄精饮片多糖的单糖组成及摩尔比[0038][0039] 从表4可看出，黄精饮片多糖的主要成分是Glue、Fuc、Arab及Gal。生品纯化水洗的多糖含量最多的是Glu，其次是Fuc和Gal；盐洗的含量最多的是Fuc，其次是Glu和Gal。一蒸纯化水洗的多糖与其他几组相比所含单糖种类最少，只含有9种单糖，主要含有Glu、Gal及Fuc；盐洗的相比于其他几组，其单糖的含量普遍增多，其中Gal占比最大。二蒸纯化水洗的多糖占比最多的是Gal，其次Glu和GalA；盐洗的含量最高的是Gal，其次是Glu。三蒸纯化水洗的多糖中Glu含量最高，其次是Gal和Man；盐洗的含量最高的是Gal。黄精饮片多糖中GluN的含量最少。[0040] 实例2不同蒸制次数的黄精饮片多糖的HPLC指纹图谱的建立[0041] 1.指纹图谱建立结果[0042] 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件对黄精多糖的HPLC指纹图谱数据进行数据处理，以S1样品指纹图谱为参照谱，时间窗宽度为0.1，经过多点校正，自动匹配，采用中位数法生成了对照指纹图谱，见附图1。指纹图谱共确定了8个共有峰，分别为Man、GluN、Rib、Rha、GalA、Glu、Gal、Arab。生品水洗、盐洗多糖，一蒸水洗、盐洗多糖，二蒸水洗、盐洗多糖，三蒸水洗、盐洗多糖各进两针构建HPLC指纹图谱如附图2所示。[0043] 2.共有指纹峰的峰面积[0044] 根据表5可知，在该色谱条件下，多糖的各个特征峰均能较好的分离，且保留时间稳定，共有峰都能较好地出现，与此同时，各个谱图的共有峰面积都占总峰面积的80%以上，说明不同蒸制次数的黄精多糖的化学成分差别不大，该指纹图谱符合指纹图谱评价要求，可以进行下一步的谱效关系分析。[0045] 表5黄精多糖指纹图谱共有峰匹配数据表[0046][0047] 表6黄精多糖指纹图谱共有峰匹配数据表（续一）[0048][0049] 表7黄精多糖指纹图谱共有峰匹配数据表（续二）[0050][0051] 3.相似度的计算[0052] 相似度分析见表8，可以看出黄精多糖的相似度在0.9以上，符合中药色谱指纹图谱相似度的要求。[0053] 表8相似度结果[0054][0055] 表9相似度结果（续上表）[0056][0057] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明的构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

专利地区：吉林

专利申请日期：2021-12-30

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114354793B