抑制肥胖的人参半纤维素及其制备方法和应用

专利名称：抑制肥胖的人参半纤维素及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410625266.9

专利申请（专利权）人：长春中医药大学
权利人地址：吉林省长春市净月开发区博硕路1035号

专利发明（设计）人：王明星,高亚楠,陈佳琪

专利摘要：本发明公开了一种抑制肥胖的人参半纤维素及其制备方法和应用，制备过程采用纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶的复合酶辅助碱溶液提取，提取后过柱纯化，得到人参半纤维素。本发明确定了人参半纤维素的最佳提取方案，该方案提高了人参半纤维素的提取效率，改善了传统提取方法造成的半纤维素化学结构的改变。并且将其应用于肥胖活性的抑制，为生物医学和保健品等领域研发改善肥胖相关产品提供一种新原料。

主权利要求：
1.抑制肥胖的人参半纤维素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：人参半纤维素的提取
取人参切片粉碎后分散在蒸馏水中，然后添加纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶的复合酶恒温水浴酶解，酶解完成后升温灭酶后过滤，滤渣中加入碱性提取液继续提取，提取完成后过滤调节滤液pH至中性，浓缩后醇沉过夜，沉淀溶解后冷冻干燥，得到初品；
所述恒温水浴酶解温度50‑60℃，时间1.5‑2.5h；所述的碱性提取液中碱为NaOH，质量浓度4‑10%；人参酶解滤渣与碱性提取液液料比为20‑30mL/g，时间为80‑100min、温度为80‑
100℃；
人参粉碎物与蒸馏水的液料比为5‑10mL/g；纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶的质量比为1：1：1，所述木瓜蛋白酶酶活力为10000‑50000U/g，所述纤维素酶酶活力为10000‑
800000U/g，所述淀粉酶为中温α‑淀粉酶，酶活力为10000‑30000U/g；以人参蒸馏水分散体系体积计，所述复合酶添加量为5‑9%；
步骤二：人参半纤维素的纯化
（2.1）人参半纤维素初品用配备有紫外检测器的FastFlow工作站分离纯化，DEAE‑纤维素为柱料填充物，洗脱液先采用蒸馏水洗脱，然后以NaCl溶液洗脱，根据FastFlow工作站绘制的洗脱曲线，收集曲线最高处NaCl洗脱液冷冻干燥；
（2.2）通过FastFlow工作站进一步分离纯化人参半纤维素，柱料为SepharoseCL‑
4B凝胶，用蒸馏水洗脱，根据FastFlow工作站绘制的洗脱曲线，收集主要峰最高处的溶液，冷冻干燥，得人参半纤维素。
2.根据权利要求1所述的抑制肥胖的人参半纤维素的制备方法，其特征在于，步骤一中采用体积浓度5‑10%的HCl调节pH。
3.根据权利要求1所述的抑制肥胖的人参半纤维素的制备方法，其特征在于，步骤一中所述醇沉采用无水乙醇，加入无水乙醇至混合液中醇含量为80wt%。
4.根据权利要求1所述的抑制肥胖的人参半纤维素的制备方法，其特征在于，步骤一中所述升温灭酶温度80‑100℃，步骤一及步骤二中所述冷冻干燥温度均为‑50℃。
5.根据权利要求1所述的抑制肥胖的人参半纤维素的制备方法，其特征在于，步骤（2.1）中所述NaCl溶液浓度为0.5‑2mol/L。
6.根据权利要求1所述的抑制肥胖的人参半纤维素的制备方法，其特征在于，步骤（2.1）及步骤（2.2）中洗脱流速均为0.5‑1.0mL/min。
7.一种权利要求1‑6任一项所述方法制备的具有抑制肥胖作用的人参半纤维素。
8.一种权利要求1‑6任一项所述方法制备的具有抑制肥胖作用的人参半纤维素或权利要求7所述的抑制肥胖的人参半纤维素在制备抑制肥胖药品中的应用。 说明书 : 抑制肥胖的人参半纤维素及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及天然产物提取与药物制备和食品保健技术领域，更具体的说是涉及抑制肥胖的人参半纤维素及其制备方法和应用。背景技术[0002] 近年来随着社会发展及饮食方式的变化，全球肥胖问题日益严重。据报道，摄入过多的碳水化合物是导致肥胖的主要原因之一。碳水化合物被人体过量的摄入后，可在人体消化酶分解后在胃和小肠被吸收，最终以葡萄糖的形式进入血液，部分用于人体必需的能量，过多的葡萄糖在胰岛素的作用下被用于合成糖原和脂肪。α‑葡萄糖苷酶是一类催化碳水化合物水解、释放出葡萄糖的酶，对碳水化合物的消化吸收起着非常重要的作用。因此，抑制α‑葡萄苷酶活性，延缓葡萄糖释放，从源头上抑制人体对碳水化合物的吸收，是改善肥胖的有效途径。人参具有大补元气、补脾益肺的功效，而在现代医学理论中，人参具有调节血脂、降血糖、抗肥胖的作用。半纤维素是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的多糖，其作为有效和安全的天然化合物，具有增强免疫力、降脂、降血糖、促进减肥和调节肠道微生物群的活性。然而，半纤维素的活性在很大程度上未得到关注，尤其是半纤维素抗肥胖活性以及其作用机制的研究。[0003] 现代生物学和医学研究发现，人参多糖具有促进能量消耗、调节血脂、降血糖的作用。多糖包括纤维素、果胶和半纤维素。迄今为止，对人参半纤维素的研究较少，这主要是由于半纤维素提取较为困难，传统提取半纤维素方法的提取率低，不适当的提取方法不仅会改变半纤维素的化学结构，还会导致半纤维素的降解。[0004] 因此，如何提供一种针对人参多糖的半纤维素的提取方法是本领域技术人员亟待解决的问题。发明内容[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种人参半纤维素及其制备方法和抑制肥胖的用途，制备方法简单、提取效率高、纯度高，为生物医学和保健品等领域研发改善肥胖相关产品提供一种新原料。[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0007] 抑制肥胖的人参半纤维素的制备方法，包括以下步骤：[0008] 步骤一：人参半纤维素的提取[0009] 取人参切片粉碎后分散在蒸馏水中，然后添加纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶的复合酶恒温水浴酶解，酶解完成后升温灭酶后过滤，滤渣中加入碱性提取液继续提取，提取完成后过滤调节滤液pH至中性，浓缩后醇沉过夜，沉淀溶解后冷冻干燥，得到初品；[0010] 步骤二：人参半纤维素的纯化[0011] （2.1）人参半纤维素初品用配备有紫外检测器的FastFlow工作站分离纯化，DEAE‑纤维素为柱料填充物，洗脱液先采用蒸馏水洗脱，然后以NaCl溶液洗脱，根据FastFlow工作站绘制的洗脱曲线，收集曲线最高处NaCl洗脱液冷冻干燥；[0012] （2.2）通过FastFlow工作站进一步分离纯化人参半纤维素，柱料为SepharoseCL‑4B凝胶，用蒸馏水洗脱，根据FastFlow工作站绘制的洗脱曲线，收集主要峰最高处的溶液，冷冻干燥，得人参半纤维素。[0013] 优选的，步骤一中所述恒温水浴酶解温度50‑60℃，时间1.5‑2.5h；所述的碱性提取液中碱为NaOH，质量浓度4‑10%；人参酶解滤渣与碱性提取液液料比为20‑30mL/g，时间为80‑100min、温度为80‑100℃。[0014] 更优选的，步骤一中所述的碱性提取液中碱为NaOH，质量浓度7.32%；人参与碱性提取液液料比为24.8mL/g，时间为90min、温度为100℃。[0015] 优选的，步骤一中人参粉碎物与蒸馏水的液料比为5‑10mL/g；纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉酶的质量比为1：1：1，所述木瓜蛋白酶酶活力为10000‑50000U/g，所述纤维素酶酶活力为10000‑800000U/g，所述淀粉酶为中温α‑淀粉酶，酶活力为10000‑30000U/g；以人参蒸馏水分散体系体积计，所述复合酶添加量为5‑9%。[0016] 优选的，步骤一中采用体积浓度5‑10%的HCl调节pH。[0017] 优选的，步骤一中所述醇沉采用无水乙醇，加入无水乙醇至混合液中醇含量为80wt%。[0018] 优选的，步骤一中所述升温灭酶温度80‑100℃，步骤一及步骤二中所述冷冻干燥温度均为‑50℃。[0019] 优选的，步骤（2.1）中所述NaCl溶液浓度为0.5‑2mol/L。[0020] 优选的，步骤（2.1）及步骤（2.2）中洗脱流速均为0.5‑1.0mL/min。[0021] 本发明还提供了一种如上技术方案所述方法制备的人参半纤维素。[0022] 本发明还提供了一种如上技术方案所述方法制备的人参半纤维素以及提供的人参半纤维素在制备抑制肥胖药品及相关产品中的应用。[0023] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种抑制肥胖的人参半纤维素的制备方法，具有如下有益效果：[0024] 本发明采用酶辅助碱溶液提取方法，确定了人参半纤维素最佳提取方案，该方案提高了人参半纤维素的提取效率，改善了传统提取方法造成的半纤维素化学结构的改变。并且将其应用于抑制肥胖活性产品的制备，为生物医学和保健品等领域研发改善肥胖相关产品提供一种新原料。附图说明[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。[0026] 图1为单因素实验结果图；[0027] 图2‑7为响应面分析结果图；[0028] 图8‑12为多糖物理结构和化学组成分析图；[0029] 图13‑18为人参半纤维素体外抑制α‑葡萄糖苷酶活性分析图；[0030] 图19为人参半纤维素荧光淬灭分析和圆二色光谱分析图；[0031] 图20‑28为人参半纤维素抗肥胖活性评估图。具体实施方式[0032] 下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0033] 人参半纤维素的制备方法，包括以下步骤：[0034] 步骤一：人参半纤维素的提取[0035] 取人参切片粉碎至粒径1‑3mm，分散在蒸馏水中，人参粉碎物与蒸馏水的液料比为5‑10mL/g，然后添加纤维素酶（800000U/g）、木瓜蛋白酶（50000U/g）和中温α‑淀粉酶（10000U/g）的复合酶，60℃恒温水浴2h酶解，然后100℃高温灭酶后过滤，滤渣中加入NaOH继续提取，提取完成后过滤，以体积浓度10%的HCl调节滤液pH至中性，浓缩，加入无水乙醇至混合液中醇含量为80wt%，醇沉过夜，沉淀溶解，‑50℃冷冻干燥得到初品；[0036] 步骤二：人参半纤维素的纯化[0037] （2.1）人参半纤维素初品用配备有紫外检测器的FastFlow工作站分离纯化，洗脱液先后采用蒸馏水和浓度为2mol/L的Nacl溶液，以1.0mL/min的流速洗脱，根据FastFlow工作站绘制的洗脱曲线，收集曲线最高处NaCl洗脱液，洗脱液以5mL/管收集，‑50℃冷冻干燥；[0038] （2.2）通过FastFlow工作站进一步分离纯化人参半纤维素，柱料为SepharoseCL‑4B凝胶，用蒸馏水洗脱，以1.0mL/min的流速洗脱，根据FastFlow工作站绘制的洗脱曲线，收集主要峰最高处的洗脱液，洗脱液以5mL/管收集，‑50℃冷冻干燥，得人参半纤维素。[0039] 人参半纤维素提取的单因素分析：为找出碱性条件下半纤维素提取的最佳条件,本实验进行了最佳工艺条件的探索，采用复合酶（（木瓜蛋白酶（50000U/g）、纤维素酶（800000U/g）、中温α‑淀粉酶（10000U/g），木瓜蛋白酶、纤维素酶、中温α‑淀粉酶=1：1：1）辅助碱溶液提取法，设计单因素分析结合响应面实验，以NaOH含量、液料比、温度、酶含量、时间为自变量，木聚糖含量为因变量，考察不同提取条件对木聚糖提取率的影响，结果如图1所示。[0040] 响应面分析：基于图1所示的单因素实验的结果，选择NaOH浓度、料液比、提取温度和酶含量四个因素，设计响应面试验方案，见表1；根据其高效液相结果中木聚糖的比例，确定半纤维素提取的最佳提取条件，响应面试验方案基于Design‑Expert软件设计，见表2。[0041] 表1响应面分析因素及水平表[0042][0043] 表2响应面实验设计[0044][0045] 基于单因素分析结果，采用通过Design‑Expert12软件分析，以木聚糖含量为响应值，分别对NaOH浓度、料液比、温度和酶含量4个因素进行线性回归拟合，回归方程为：Y=44.63+0.875A+0.675B+0.758C+3.16D+1.75AB‑0.2AC‑0.075AD+0.2BC+2 2 2 2 20.325BD+1.02CD‑4.18A‑0.425B‑0.55C‑0.025D，R=0.9400，表明该模型具有较高的拟合度。表4为响应面二次模型的方差分析，用F值和P值检验回归方程的统计学显著性。从Fisher'sF检验可以看出，模型F值较高（13.42）且P值较低（P<0.0001），二次回归模型的方差分析显示模型显著，模型拟合良好，失拟项P值无显著性（P＞0.05），说明所建立的模型可用于分析和预测不同提取条件下木聚糖含量的变化。RAdj2=0.8699，说明此模型能解释86.99%的试验数据变异性。由分析结果中F值和P值可知四个因素的重要性顺序为：D>A>C>B，即：酶含量>NaOH浓度>温度>料液比。[0046] 表3Box‑Behnken试验设计的因素与水平方案及结果[0047][0048] 表4Box‑Behnken试验设计方差分析[0049][0050] 基于单因素结合响应面分析结果，最终得到人参半纤维素最佳提取方法：[0051] 取人参切片粉碎分散至蒸馏水中，人参粉碎物与蒸馏水的液料比为5‑10mL/g，添加复合酶（纤维素酶：木瓜蛋白酶：淀粉酶=1：1：1）置于60℃恒温水浴2h，以人参蒸馏水分散体系体积计，所述复合酶添加量为9%，酶解完成后100℃高温使酶灭活后过滤，滤渣中加入质量浓度7.32%的NaOH溶液中，液料比为24.8ml/g，在100℃条件下继续提取90min，过滤，滤液加体积浓度10%HCl调至中性，浓缩，加入无水乙醇至混合液中醇含量为80wt%，醇沉过夜，沉淀溶解，‑50℃冷冻干燥。[0052] 基于苯酚‑硫酸法、间羟基联苯法、BCA法测定人参半纤维素理化性质。[0053] 苯酚‑硫酸法测总糖含量：标准曲线的绘制：精密称取葡萄糖标准品0.3022g，置于1000mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。取出20mL置于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，配制成0.3022mg/mL的溶液。分别移取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL置于具塞玻璃试管中，加水补足至1mL。每管加入6%苯酚溶液1mL，摇匀，沿管壁缓慢加入浓硫酸5mL，迅速摇匀。冷却后，于490nm波长处测定吸光度，并绘制标准曲线。样品的制备及检测：精密称定人参粗多糖0.1121g，置于500mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。取1mL置于具塞玻璃试管中，每管加入6%苯酚溶液1mL，摇匀，沿管壁缓慢加入浓硫酸5mL，迅速摇匀。冷却后，于490nm波长处测定吸光度，代入标准曲线，计算总糖的浓度及含量。[0054] 公式：X（%）=C×X0×V/M[0055] 式中：X‑为样品的多糖的含量；C‑为所测样品的多糖的浓度，X0‑为稀释倍数，V‑为溶解人参多糖粉末的体积，M‑为人参多糖粉末的质量。[0056] 间羟基联苯法测酸性多糖含量：标准曲线的绘制：精密称定葡萄糖醛酸适量，加水定容，配置成0.2mg/ml的溶液，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL置于具塞玻璃试管中，加水补足至1ml，加入四硼酸钠硫酸溶液5ml，摇匀，在沸水浴中加热10min，取出冷却至室温，加入100ul间羟基联苯，摇匀，室温放置40min，在525nm波长处测定吸光值，并绘制标准曲线。样品的制备与检测：取苯酚硫酸法中的样品50ul，加水补至1ml，加入四硼酸钠硫酸溶液5ml，摇匀，在沸水浴中加热10min，取出冷却至室温，加入100ul间羟基联苯，摇匀，室温放置40min，525nm波长处测定吸光值，代入标准曲线，计算糖醛酸的浓度及含量。[0057] 公式：X（%）=C×X0/C0[0058] 式中：X‑为样品的糖醛酸的含量，C‑为所测样品的糖醛酸的浓度，X0‑为稀释倍数，C0‑为人参多糖的浓度。[0059] BCA法测蛋白含量：标准曲线的绘制：精密称定BSA粉末0.1110g，用超纯水稀释至1.1mg/mL，分别为1，3，5，7，9，11ul的BSA标准溶液于96孔板中，补水至20ul，加入配制好的BCA（A液:B液=1：50）200ul，振荡摇匀，烘箱孵育30min，于562nm波长处测定吸光度，并绘制标准曲线。样品的制备：取苯酚硫酸法中的样品20ul，加入配制好的BCA（A液:B液=1：50）200ul，振荡摇匀，烘箱孵育30min，于562nm波长处测定吸光度，代入标准曲线，计算蛋白质的浓度及含量。[0060] 公式：X（%）=C×X0/C0[0061] 式中：X‑为样品的蛋白质的含量，C‑为所测样品的蛋白质的浓度，X0‑为稀释倍数，C0‑为人参多糖的浓度。[0062] 检测发现，经过纯化后的人参半纤维素的总糖含量为80.12%，糖醛酸含量为15.57%，蛋白质含量为3.17%。[0063] 人参半纤维素结构分析：[0064] 基于GPC测定人参半纤维素的分子量：使用配备有激光检测器（LS）、微分折射率检测器（DRI）和填充有明胶（SB‑803，ShodexOHpak）的柱（SB‑806，Shodex‑OHpak）的凝胶渗透色谱系统（ELEOSsystem）测定人参半纤维素分子量，色谱法使用蒸馏水+0.02%NaN3的流动相，流速为1mL/min，柱温为40℃、进样量为500ul。[0065] 基于HPLC测定人参半纤维素的单糖组成：精准称取人参半纤维素5mg，加入2ml三氟乙酸（2mol/L）溶解，充入氮气，置于100℃水解8h后，吹干，再加适量甲醇溶解残渣并吹干，重复3次，即得到人参半纤维素的酸水解产物。[0066] 将酸水解产物用2ml超纯水溶解，加入1ml的NaOH溶液（0.3mol/L），再加入0.5mol/L的PMP甲醇溶液1.2ml，置于70℃水浴反应30min，取出并冷却至室温，加HCl调节PH至7后，加入适量的氯仿萃取3次，上层水相层为人参半纤维素衍生物，经过0.45μm滤膜过滤后，备用。[0067] 高效液相（LC‑2030Cplus，岛津，日本），配备检测器为紫外检测器，柱温箱为30℃，色谱柱：Kromasil‑100‑5‑C18(4.6mm×250mm)，流动相：A：磷酸二氢钾缓冲溶液（1000ml）：乙腈（177ml）；B：磷酸二氢钾缓冲溶液（1000ml）：乙腈（667ml）。梯度洗脱曲线为：0‑10分钟，0%‑8%B；10.01‑30分钟，8%‑30%B；30.1‑40分钟，30%‑30%B；进样量为10ul，流速0.8ml/min，波长250nm。[0068] 基于FTIR和NMR确定人参半纤维素的官能团以及其化学结构：将1mg干燥的人参半纤维素与100‑200mg干燥的溴化钾（KBr）粉末研磨均匀，经压片机压片后，进行傅立叶变换‑1 ‑1红外光谱扫描分析，扫描范围为4000cm ‑400cm 。[0069] 通过核磁共振（NMR）光谱对人参半纤维素进行分析。将20mg半纤维素样品在75℃的烘箱中干燥4h。然后，在303K和328K下溶解在500μL含有4，4‑二甲基‑4‑硅戊烷磺酸钠1 13的D2O中。在室温下使用Bruker300.17 HNMR装置和75.48MHz CNMR装置（Bruker1 13AvanceII300，Switzerland）以及傅立叶变换模式下的双探针记录HNMR和 CNMR光谱。使用MestReNova软件（V14.0，MestrelabResearch）处理采集的数据。[0070] 结果如图8‑12所示，通过分析多糖的分子量、单糖的组成及比例、官能团、多糖的连接方式等，揭示其物理结构及化学组成。研究表明，采用酶辅助碱溶液提取得到的人参半纤维素总糖含量为80.12%，分子量为2196Da，人参半纤维素主要由木糖和半乳糖构成，是具有β‑D‑木糖结构的酸性多糖。此外，人参半纤维素为六糖重复单元，组分中均存在α和β构型多糖，且大多数结构为β构型。半纤维素是由几种不同的中性和酸性单糖组成的支链杂多糖。本研究结果与文献报道一致。此外，文献表明，β‑D‑木糖结构参与抑制高脂饮食诱导的肥胖小鼠的脂肪生成并调节糖代谢，这也为后续研究人参半纤维素抑制α‑葡萄糖苷酶的活性研究提供理论依据。[0071] 人参半纤维素体外抑制α‑葡萄糖苷酶活性以及其作用机制分析，结果如图13‑18所示：[0072] 体外抑制α‑葡萄糖苷酶活性实验：以PNPG为底物，测定不同人参提取物对α‑葡萄糖苷酶活性的抑制作用。反应体系依次加入0.1mol/LpH6.8的PBS磷酸缓冲液（40μL），人参半纤维素和阿卡波糖（20μL）和0.4U/mL的α‑葡萄糖苷酶溶液（10μL），37℃保温10min，再加入反应底物10mmol/LPNPG溶液（50μL），37℃反应20min后加入0.2mol/L的Na2CO3溶液终止反应。阿卡波糖作为阳性对照。由于PNPG在α‑葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，PNP在405nm处有最大吸收，测定其吸光度，计算人参各组分对α‑葡萄糖苷酶的抑制率。实验同时设空白组，对照组和样品空白组。抑制率公式如下：[0073] 抑制率（%）=([(A对照‑A空白)‑(A样品‑A样品空白)]/(A对照‑A空白))×100%。[0074] 体外抑制α‑葡萄糖苷酶的半抑制浓度确定：在96孔板中加入0.1mol/L的PBS缓冲液（80μL）和0.1U/mL的α‑葡萄糖苷酶溶液（20μL），然后加入不同浓度（阿卡波糖从0‑0.25mg/mL，半纤维素溶液从0‑0.9mg/mL）的样品。0.1mol/L的PBS缓冲液（0.12mL）作为空白对照。在37℃的水浴中孵育30min后，再加入0.02mL的PNPG溶液（1.2mg/mL），在37℃再孵育40min后，最后加入1.0mol/L的Na2CO3（80μL）以停止反应。用酶标仪在405nm处测定吸光度值。样品抑制α‑葡萄糖苷酶的能力以相对酶活性表示，用以下公式计算：[0075] 相对酶活性（%）=((AS‑ASO))/((AO‑AOO))×100%；[0076] 其中AO是酶与P‑NPG的吸光度；AOO是PNPG的吸光度；AS是样品与酶和PNPG的吸光度；ASO是样品与PNPG的吸光度。IC50是指使50%的酶活性丧失的样品浓度。[0077] 人参半纤维素与α‑葡萄糖苷酶的可逆性研究：制备一系列浓度梯度（0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL）的人参半纤维素样品溶液，每个浓度取100μL分别加入96孔板中，在同浓度的样品孔中加入一系列浓度梯度（0.05、0.10、0.15和0.20U/mL）的α‑葡萄糖苷酶溶液（20μL）。在37℃孵育10min后，加入0.02mL的PNPG（1.2mg/mL）。用酶标仪每隔30s在405nm处测量反应混合物的吸光度，直到反应时间达到5min。初始反应速率（V，ΔOD/min）为405nm处第1次和第10次的吸光度差。根据α‑葡萄糖苷酶催化底物的初始反应速率与α‑葡萄糖苷酶浓度的关系，绘出相关曲线并拟合，根据其相关性来分析人参半纤维素对酶抑制的可逆性。[0078] 人参半纤维素对α‑葡萄糖苷酶的抑制动力学研究：配置一系列浓度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的人参半纤维素多糖溶液，每个浓度取100μL加入96孔板中，再加入20μL浓度为0.1U/mL的α‑葡萄糖苷酶溶液，在37℃孵育5min。抑制模型根据酶的Km（解离常数）和Vmax（最大反应速度）进行评估，Km和Vmax用Lineweaver‑Burk图来确定，即酶的反应速度（V）与底物（PNPG）浓度的双倒数图（1/V与1/[PNPG]）。[0079][0080][0081] 对于上述公式，Ki为抑制常数、米氏常数为Km、初始反应速率为V（ΔOD/min）和最大反应速率Vmax（ΔOD/min）；样品和PNPG溶液的浓度分别用[I]（mg/mL）和[S]（mg/mL）表示。[0082] 人参半纤维素对α‑葡萄糖苷酶的荧光淬灭分析，结果如图19所示：以280nm为激发波长，波长为200‑500nm内，在不同温度（298K，304K，310K）下，α‑葡萄糖苷酶（0.4U/mL）与一系列浓度的人参半纤维素（0、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL）反应15min后体系的荧光发射光谱强度，激发和发射波长之间的狭缝宽度为5nm。以相应浓度的人参半纤维素为样品空白组，以α‑葡萄糖苷酶（0.4U/mL）为对照组，测量人参半纤维素溶液对α‑葡萄糖苷酶荧光光谱的影响。[0083] 圆二色光谱分析，结果如图19所示：采用圆二色谱仪在远紫外区（190nm‑260nm）范围内，路径长度为1.0mm，扫描速度为100nm/min，响应时间为1s。人参半纤维素（0、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL）与0.4U/mL的α‑葡萄糖苷酶的混合后在37℃下单独孵育15分钟后进行扫描。每个光谱是3次连续扫描的平均值，试验开始用20mmol/L的PBS缓冲液进行校正。[0084] 经过纯化后，随着人参半纤维素的浓度增加，α‑葡萄糖苷酶活性呈现剂量依赖性降低，并且其抑制作用接近于阳性对照阿卡波糖。人参半纤维素具有抑制α‑葡萄糖苷酶活性能力，这可能与木糖和阿拉伯糖以及β‑D‑木糖结构有关。接下来，我们探究了人参半纤维素抑制α‑葡萄糖苷酶的作用机制。结果表明，半纤维素抑制α‑葡萄糖苷酶的反应是可逆的，且属于混合型抑制，即竞争性抑制和非竞争性相结合的抑制类型。可逆性抑制意味着半纤维素可以通过较弱的非共价关联（疏水作用或氢键）与α‑葡萄糖苷酶结合，会降低酶的活性，而非不可逆地使酶失活。进一步研究发现，人参半纤维素有效地猝灭了α‑葡萄糖苷酶的内源荧光，且该过程为静态猝灭过程。并且，人参半纤维素与α‑葡萄糖苷酶相互作用后，其二级结构会发生变化。总之，人参半纤维素在调节机体内葡萄糖水解方面具有广阔的应用前景，具有作为预防和治疗肥胖的功能性食品成分的潜力。[0085] 人参半纤维素抗肥胖活性评估，结果如图20‑28所示：[0086] 以3T3‑L1脂肪细胞为模型，采用CCK8法检测人参半纤维素抑制3T3‑L1前细胞的细胞存活率：用含有10%FBS、100μg/mL的青链霉素的DMEM培养3T3‑L1前脂肪细胞或3T3‑L1脂5肪细胞，置于在37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期的细胞，以浓度为1×10/ml接种于96孔板中，放入细胞培养箱，培养12h后。分别加入不同浓度的人参半纤维素（10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml），继续培养12h。每孔加入10μL的CCK8溶液，培养3h，置酶标仪450nm处测量吸光值，计算细胞存活率。[0087] 细胞肥胖模型的建立以及分组：3T3‑L1脂肪细胞从3T3‑L1前脂肪细胞分化而来。43T3‑L1前脂肪细胞分化操作如之前所述。3T3‑L1前脂肪细胞以每皿5×10个细胞的密度接种在3cm培养皿中24小时。在2天后融合后，去除DMEM培养基（含有10%FBS）。3T3‑L1前脂肪细胞在分化培养基（MDI）（含有补充有10%FBS/DMEM、浓度为0.5mM/L的3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤（IBMX）、10μg/mL的胰岛素以及1.0μM/L地塞米松）刺激细胞2天后，改用10%FBS/DMEM和胰岛素（10μg/mL）培养细胞2天后，得到分化后的脂肪细胞。将细胞分组：（1）空白对照（Control）组：DMED培养未经过分化的3T3‑L1前脂肪细胞；（2）模型（MDI）组：MDI培养基诱导分化成3T3‑L1脂肪细胞；（3）人参半纤维素组：含不同浓度人参半纤维素（10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml）的MDI培养基。[0088] 采用qRT‑PCR和ELISA检测人参半纤维素对肥胖模型细胞中炎症因子表达的影响：使用ELISA试剂盒分析各组细胞中炎症因子TNF‑α、IL‑6和MCP‑1的水平。使用TRIzol试剂从3T3‑L1脂肪细胞中提取总RNA。使用FastKinggDNADispelingRTSuperMix试剂盒，将RNA逆转录为cDNA。在BIO‑RADCFX96的帮助下进行qPCR分析™实时系统。用2‑Δ ΔCt法测定信使核糖核酸的相对表达水平。然后通过与GAPDH进行比较来对结果进行归一化。引物序列如下表所示：[0089][0090] 油红O染色判断人参半纤维素对3T3‑L1脂肪细胞脂质积累的影响：通过油红O染色评估脂质积聚。分化的3T3‑L1脂肪细胞用PBS在pH7.4下洗涤两次，并在室温下CellOROfixative固定15min。用60%异丙醇洗涤固定的细胞两次，并在室温下用油红O溶液（60%过滤的油红O储备溶液）染色60分钟。接下来，去除染色溶液，并用蒸馏水洗涤细胞三次。显微镜图像用于观察分化细胞中的脂滴染色。[0091] 人参半纤维素显著抑制3T3‑L1脂肪细胞的细胞活性，抑制脂肪细胞的炎症因子IL‑6、TNF‑α、MCP‑1的表达，以及抑制细胞的脂质积累，这证实了人参半纤维素的抗肥胖活性。此外，根据早期的报道，发现木聚糖具有调节肠道菌群、调节血脂、降血糖、抗肥胖的活性。因此，我们推测人参半纤维素通过抑制α‑葡萄糖苷酶活性以达到抗肥胖的目的，这可能是由于人参半纤维素结构中β‑D‑木糖的存在。这为后续进一步研究人参半纤维素的抗肥胖活性作用机制以及医药保健品的开发奠定基础并提供理论依据。[0092] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。[0093] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

专利地区：吉林

专利申请日期：2024-05-20

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN118221846B