一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗及其构建方法与应用

专利名称：一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗及其构建方法与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111657441.5

专利申请（专利权）人：苏州大学
权利人地址：江苏省苏州市相城区济学路8号

专利发明（设计）人：贡成良,薛仁宇,胡小龙,朱敏,顾宇超,冯永杰

专利摘要：本发明涉及一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗及其构建方法与应用。合成5’端依次为体外T7（或S6）转录启动子、脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点IRES、N6‑甲基腺嘌呤m6A位点、传染性脾肾坏死病毒ISKNV主要衣壳蛋白MCP开放读码框的融合序列P‑IRES‑m6A‑MCP，以P‑IRES‑m6A‑MCP为模板，用T7（或S6）转录酶体外转录RNA，用DNaseI去除DNA模板后，用T4 RNA连接酶连接环化，用RNase R酶去除线性RNA后获环状RNA，即circRNA‑MCP。该circRNA‑MCP免疫注射后可减少传染性脾肾坏死病的发生。

主权利要求：
1.一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）合成5’端依次为体外转录启动子、内部核糖体进入位点IRES、N6‑甲基腺嘌呤m6A位点、传染性脾肾坏死病毒开放读码框的融合序列P‑IRES‑m6A‑MCP；所述体外转录启动子为T7或SP6启动子；所述内部核糖体进入位点IRES为脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点IRES；所述传染性脾肾坏死病毒开放读码框为传染性脾肾坏死病毒衣壳蛋白MCP开放读码框；
（2）将P‑IRES‑m6A‑MCP序列克隆进载体，获重组质粒pP‑IRES‑m6A‑MCP；
（3）pP‑IRES‑m6A‑MCP酶切后回收得到P‑IRES‑m6A‑MCP片段或以pP‑IRES‑m6A‑MCP模板PCR扩增得到P‑IRES‑m6A‑MCP片段；
（4）以P‑IRES‑m6A‑MCP片段为模板，进行体外转录，然后消化去除DNA，获体外转录的RNA；
（5）体外转录的RNA连接为环状RNA，即抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗；
所述传染性脾肾坏死病毒开放读码框的序列为SequenceID:AF370008.1的CDS序列。
2.根据权利要求1所述抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建方法，其特征在于，以P‑IRES‑m6A‑MCP片段为模板，用RNA聚合酶体外转录，用DNase 消化，去除DNA，获体外转录的RNA。
3.根据权利要求1所述抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建方法，其特征在于，体外转录的RNA用RNA连接酶连接后，用RNaseR处理去除线性的RNA分子，获环状RNA。
4.根据权利要求1所述抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建方法构建的抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗。
5.权利要求4所述抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗在制备预防传染性脾肾坏死病毒感染的药物中的应用。 说明书 : 一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗及其构建方法与
应用技术领域[0001] 本发明涉及到基因工程技术领域，具体涉及一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建。背景技术[0002] 目前，常见的疫苗主要有：灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗、重组活载体疫苗、DNA疫苗以及mRNA疫苗等，不同类型的疫苗各有优缺点。传统的减毒疫苗可以激活体液免疫和细胞免疫，但这种类型的疫苗有回复致病性的潜在危险，安全性较差；相对于减毒疫苗，亚单位疫苗安全性好，但诱导细胞免疫排除胞内病原方面效果较差；由于疫苗抗原原位表达，基于病毒载体和核酸（质粒DNA和mRNA）的新的疫苗技术能诱导体液和细胞毒性T细胞免疫反应。mRNA疫苗属于核酸疫苗，是继减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗之后发展起来的第三代疫苗。随着mRNA合成、修饰、传递技术的发展，已证实mRNA注射动物后可发挥疫苗的作用。由于mRNA疫苗无整合宿主基因组风险，无微生物污染，同时可诱导细胞和体液免疫应答，且研发时间短，成本低，易标准化生产，近些年来成为疫苗研发的热点。然而，mRNA疫苗稳定性差，极容易降解，通常需超低温保藏运输，在应用上受到了很大的限制。circRNA是一种无5'端帽子结构和3'‑poly(A)尾巴的闭合环状单链RNA分子，不易被RNaseR和核酸外切酶降解，具有mRNA疫苗优势的同时，可弥补mRNA疫苗的劣势。[0003] 鳜（Sinipercachuatsi）、大口黑鲈（Micropterussalmoides）是水产养殖业中的珍贵品种，但往往因传染性脾肾坏死病毒（Infectionspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV）感染而导致严重损失。免疫技术在鱼类病害防治中日益成为一种安全、有效、环保的新型防控技术。在我国传染性脾肾坏死病灭活疫苗已取得新兽药注册证书（一类），该疫苗是在体外通过病毒感染敏感细胞系获取ISKNV，进一步对ISKNV灭活获得。由于灭活疫苗的免疫持久力差，使用时免疫剂量大从而影响其使用效果和覆盖面。因此，养殖生产中希望有新型疫苗供选择使用。发明内容[0004] 抗传染性脾肾坏死病毒的灭活疫苗的免疫持久力差，使用时免疫剂量大从而影响其使用效果和覆盖面，由于mRNA疫苗无整合宿主基因组风险，可同时诱导细胞和体液免疫应答，且研发时间短，成本低，易标准化生产，近些年来成为疫苗研发的热点。但mRNA疫苗稳定性差，极容易降解而影响使用效果。本发明的目的是提供一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建，发挥mRNA疫苗优势的同时，弥补mRNA疫苗的劣势，为鳜、大口黑鲈传染性脾肾坏死病的免疫防治提供新的选择。[0005] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：[0006] 一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA分子的构建方法，包括下列步骤：[0007] （1）合成5’端依次为体外转录启动子、内部核糖体进入位点IRES、N6‑甲基腺嘌呤m6A位点、传染性脾肾坏死病毒开放读码框的融合序列（P‑IRES‑m6A‑MCP）；[0008] （2）将P‑IRES‑m6A‑MCP序列克隆进载体，获重组质粒pP‑IRES‑m6A‑MCP；[0009] （3）pP‑IRES‑m6A‑MCP酶切后回收P‑IRES‑m6A‑MCP片段或以pP‑IRES‑m6A‑MCP模板PCR扩增P‑IRES‑m6A‑MCP片段；[0010] （4）以P‑IRES‑m6A‑MCP片段为模板，进行体外转录，然后消化去除DNA，获体外转录的RNA；[0011] （5）体外转录的RNA连接为环状RNA，即抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗。[0012] 具体的上述抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA分子的构建方法如下列步骤：[0013] （1）合成5’端依次为体外转录启动子、内部核糖体进入位点IRES、N6‑甲基腺嘌呤m6A位点、传染性脾肾坏死病毒ISKNV主要衣壳蛋白MCP开放读码框的融合序列（P‑IRES‑m6A‑MCP）；[0014] （2）将P‑IRES‑m6A‑MCP序列克隆进载体，获重组质粒pP‑IRES‑m6A‑MCP；[0015] （3）pP‑IRES‑m6A‑MCP酶切后回收得到P‑IRES‑m6A‑MCP片段或以pP‑IRES‑m6A‑MCP模板PCR扩增得到P‑IRES‑m6A‑MCP片段；[0016] （4）以P‑IRES‑m6A‑MCP片段为模板，用RNA聚合酶体外转录，用DNase 消化，去除DNA，获体外转录的RNA；[0017] （5）体外转录的RNA用RNA连接酶连接后，进一步用RNaseR处理去除线性的RNA分子，获环状RNA，称为circRNA‑MCP，即抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA分子。[0018] 上述技术方案中，步骤（1）中，所述体外转录启动子为T7或SP6启动子，序列分别为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2，所述内部核糖体进入位点IRES选用脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点IRES，其序列为SEQIDNO:3；所述N6‑甲基腺嘌呤m6A位点为SEQIDNO:4；传染性脾肾坏死病毒ISKNV主要衣壳蛋白MCP开放读码框序列为GenBank中的SequenceID:AF370008.1所示序列。融合序列P‑IRES‑m6A‑MCP可以化学合成，也可分别通过PCR从含有IRES的质粒中扩增出IRES、从ISKNV中PCR扩增出MCP编码序列后，然后通过用含有m6A序列的引物通过PCR搭桥获得P‑IRES‑m6A‑MCP序列，进一步的，可以在P‑IRES‑m6A‑MCP序列的二侧添加酶切位点。[0019] 上述技术方案中，步骤（2）将P‑IRES‑m6A‑MCP序列克隆进载体，载体为常规克隆载TM体，例：pFasTBac Dual、pBlueScriptIISK载体。如果P‑IRES‑m6A‑MCP序列二侧含有酶切位点，则可以酶切后，克隆进载体；如果P‑IRES‑m6A‑MCP序列二侧没有酶切位点，则可以通过无缝克隆的方式克隆进载体。[0020] 上述技术方案中，步骤（3）可以用酶从步骤（2）的pP‑IRES‑m6A‑MCP质粒中切出的P‑IRES‑m6A‑MCP片段，也可以通过PCR从pP‑IRES‑m6A‑MCP中扩增出的P‑IRES‑m6A‑MCP片段；步骤（4）以P‑IRES‑m6A‑MCP片段为模板，用RNA聚合酶体外转录，用DNase 消化，去除DNA，获体外转录的RNA；P‑IRES‑m6A‑MCP片段体外转录时根据P‑IRES‑m6A‑MCP序列中所带有的启动子种类（T7或SP6），选择相应的RNA聚合酶进行体外转录；用DNase 消化后，须进一步通过酚、氯仿抽提，尔后，通过乙醇沉淀，获纯净的体外转录的RNA。[0021] 上述技术方案中，步骤（5）将体外转录的RNA用RNA连接酶连接后，进一步用RNaseR处理去除线性的RNA分子。为了获得纯度较高的环状RNA，优选用酚、氯仿抽提，尔后，通过乙醇沉淀获环状RNA，该环状RNA为circRNA‑MCP，即为抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗。[0022] 本发明公开了根据上述抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建方法构建的抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗，作为常识，circRNA‑MCP与适当的佐剂，例：脂质体、脂质纳米粒包裹后，称为可应用的疫苗体系，免疫鱼可以防治传染性脾肾坏死病的发生与流行。[0023] 本发明公开了上述抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗在制备抗传染性脾肾坏死病毒的疫苗中的应用；或者上述抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗在制备抗传染性脾肾坏死病毒的药物中的应用。[0024] 本发明根据一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建，公开了一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建，包括权利要求2根据权利要求1一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建，所述的体外转录启动子为T7或SP6启动子；T7启动子序列为SEQIDNO:1，T7启动子序列为SEQIDNO:2；包括权利要求3根据权利要求1一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建,所述的内部核糖体进入位点IRES为脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点IRES，其序列为SEQIDNO:3；包括权利要求4根据权利要求1一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建,所述的N6‑甲基腺嘌呤m6A位点为SEQIDNO:4；[0025] 本发明抗传染性脾肾坏死病毒病的circRNA疫苗circRNA‑MCP的序列为SEQIDNO:5。[0026] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：[0027] 1.本发明公开的一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建没有见报道；本发明公开的circRNA疫苗为一种核酸疫苗，与DNA疫苗相比，circRNA疫苗没有整合进基因组的安全隐患，生物安全性高，且无须经过转录环节可直接翻译抗原蛋白引起免疫反应；与mRNA疫苗相比，circRNA疫苗结构稳定，抗RNaseR酶和外切核酸酶所引起的降解，具有mRNA疫苗优势的同时，也可弥补了mRNA疫苗的劣势。[0028] 2.现有的抗传染性脾肾坏死病毒疫苗为灭活疫苗，只能刺激机体体液免疫，免疫持续时间短，故存在免疫效果不理想和免疫力持久性差等问题。circRNA疫苗可诱导细胞和体液免疫应答，且研发时间短，成本低，易标准化生产。附图说明[0029] 图1为实施例一中的重组质粒pFASTTMDual‑IRES‑m6A‑MCP的酶切鉴定。泳道M，标准TMDNA分子量，泳道1，pFAST Dual‑IRES‑m6A‑MCP用BamHI、XbaI双酶切产物。[0030] 图2为实施例一中的circRNA‑MCP在EPC细胞中表达MCP的Westernblot检测。2×510个鱼EPC细胞转染circRNA‑MCP48h后，收集细胞，提取总蛋白，SDS‑PAGE分离后，进行Westernblot检测，一抗为鼠抗MCP，二抗为HRP标记山羊抗鼠IgG。内参为α‑Tubulin。泳道1，正常鱼EPC细胞；泳道2，转染4μgcircRNA‑MCP的EPC细胞；泳道3，转染8μgcircRNA‑MCP的EPC细胞。[0031] 图3为实施例一中的组织免疫组化检测MCP基因表达。50μgcircRNA‑MCP免疫注射鲈（长8 12cm，体重35 55g），对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。3天后取肾脏组织，进行~ ~免疫组化实验，一抗为MCP抗体，二抗为FITC标记山羊抗鼠IgG。细胞核用DAPI染色。[0032] 图4为实施例一中的免疫注射circRNA‑MCP诱导鲈产生抗体的效价检测。50μgcircRNA‑MCP注射免疫鲈（长8 12cm，体重35 55g），在第1周、第2周、第3周、第4周随机取3~ ~尾鲈，尾静脉采血，ELISA检测抗体效价。[0033] 图5为实施例二中的circRNA‑MCPPCR鉴定。泳道M，标准分子量DNA，泳道1，circRNA‑MCP的线性分子；泳道2，circRNA‑MCP。[0034] 图6为实施例二中的细胞免疫荧光circRNA‑MCP在鱼EPC细胞中表达MCP。将1×104个EPC细胞转染circRNA‑MCP4μg，48小时后进行细胞免疫荧光实验，一抗为自制MCP小鼠多克隆抗体，二抗为FITC标记山羊抗鼠IgG。细胞核用DAPI染色。[0035] 图7为实施例二中qRT‑PCR检测免疫注射鲈脾、肾组织中的circRNA‑MCP。左图为脾组织，右图为肾组织；control为对照组，注射磷酸盐缓冲液；Circ‑MCP为实验组，注射circRNA‑MCP。具体实施方式[0036] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，其中一些常规方法所示简略；所涉及的具体操作比如酶切、克隆、PCR等都是本领域常规技术。[0037] 实施例一基于T7RNA聚合酶体外转录构建抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗[0038] （1）合成5’端依次为脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点IRES（SEQIDNO:3）、N6‑甲基腺嘌呤m6A位点（SEQIDNO:4）、传染性脾肾坏死病毒ISKNV主要衣壳蛋白MCP开放读码框的融合序列(SequenceID:AF370008.1)，并在5’端添加T7启动子序列（SEQIDNO:1），获TM融合序列T7‑IRES‑m6A‑MCP，克隆进pFastBac Dual载体（Novagen公司）的BamHI和XbaI后TM进行测序验证，将序列正确的克隆命名为pFAST Dual‑IRES‑m6A‑MCP。[0039] （2）pFASTTMDual‑IRES‑m6A‑MCP用BamHI和XbaI双酶切（图1），回收切出的T7‑IRES‑m6A‑MCP片段。[0040] （3）以T7‑IRES‑m6A‑MCP片段为模板，用T7RNA聚合酶进行体外转录，尔后用DNaseI消化DNA模板，进一步用酚/氯仿抽提去除T7RNA聚合酶，再通过乙醇沉淀，获纯净的体外转录的RNA。[0041] （4）纯净的体外转录的RNA用T4RNA连接酶环化，尔后用RNaseR消化未环化的线性分子，进一步用酚/氯仿抽提去除T7RNA连接酶，再通过乙醇沉淀获circRNA‑MCP，序列为SEQIDNO:5，Xho 、EcoR 位点可以更换成其他酶切位点，也可以从序列中移除。[0042] （5）用不同水平的circRNA‑MCP转染鱼EPC细胞，48h后收集细胞，提取总蛋白，SDS‑PAGE分离后，用鼠抗MCP进行Westernblot检测，在转染circRNA‑MCP的EPC细胞蛋白中可检测到代表重组MCP的特异性条带（图2），说明circRNA‑MCP在EPC细胞中表达MCP。[0043] （6）按circRNA‑MCP与脂质体按5μg：1μL的比例混合，尔后注射鲈（长8 12cm，体~重35 55g），每尾注射50μgcircRNA‑MCP，对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。3天后取肾脏~组织，进行免疫组化实验，在注射circRNA‑MCP的肾组织切片中可观察到代表MCP表达的绿色荧光（图3），说明circRNA‑MCP进入肾组织细胞并表达MCP。[0044] （7）circRNA‑MCP与脂质体混合物（5μg：1μL）注射鲈（长8 12cm，体重35 55g），~ ~每尾注射50μgcircRNA‑MCP。免疫注射后，分别在第1、2、3、第4周随机取3尾鲈，取血，分离血清后，用ELISA法测定血清产生抗体的效价(图4)，注射后第3周鲈血清中的抗体效价为1：1600，注射后第4周鲈血清中的抗体效价为1：800。[0045] （8）取传染性脾肾坏死病毒感染发病鳜的肾5g，加5mL磷酸盐缓冲液充分研磨，8000r/min，离心30min，取上清，重复此步骤4次，于超净台中用0.22μm滤膜过滤，滤液为传染性脾肾坏死病毒液，存于4℃。[0046] （9）鲈免疫注射circRNA‑MCP第28天，人工接种步骤（8）中的传染性脾肾坏死病毒液，同设空白对照组（每尾注射磷酸缓冲液200μl）。注射的后的鱼在27 29℃饲养，每天喂~料3次，观察鲈的活动状况，检查、记录发病情况。[0047] 在本实验条件下，空白对照组和免疫组的发病率分别70%、50%，免疫组的发病率比对照组低20%。[0048] 实施例二基于SP6RNA聚合酶体外转录构建抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗[0049] （1）按SEQIDNO:5合成5’端依次为脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点IRES（SEQIDNO:3）、N6‑甲基腺嘌呤m6A位点（SEQIDNO:4）、传染性脾肾坏死病毒ISKNV主要衣壳蛋白MCP开放读码框的融合序列(SequenceID:AF370008.1)，并在5’端添加SP6启动子序列（SEQIDNO:2），获融合序列SP6‑IRES‑m6A‑MCP，克隆进pBlueScriptIISK(+)载体（优宝生物公司）的BamHI和XbaI后进行测序验证，将序列正确的克隆命名为pBlue‑IRES‑m6A‑MCP。[0050] （2）以pBlue‑IRES‑m6A‑MCP为模板，用引物Primer‑F（SEQIDNO:2）和primer‑R（SEQIDNO:6）扩增SP6‑IRES‑m6A‑MCP融合序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回SP6‑IRES‑m6A‑MCP片段。[0051] （3）以SP6‑IRES‑m6A‑MCP片段为模板，用SP6RNA聚合酶进行体外转录，尔后用DNaseI消化DNA模板，进一步用酚/氯仿抽提去除SP6RNA聚合酶，再通过乙醇沉淀，获纯净的体外转录的RNA。[0052] （4）纯净的体外转录的RNA用T4RNA连接酶环化，尔后用RNaseR消化未环化的线性分子，进一步用酚/氯仿抽提去除SP6RNA连接酶，再通过乙醇沉淀获circRNA‑MCP，序列为SEQIDNO:5。[0053] （5）分别以步骤（3）的纯净的体外转录的RNA和步骤（4）circRNA‑MCP为模板，用随机引物体外转录成cDNA后，分别用发散引物circMCP‑F（SEQIDNO:7）和circMCP‑R（SEQIDNO:8）进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，前者无特异性PCR产物，后者可扩增出与理论大小一致的条带（图5），说明circRNA‑MCP已按设计构建。[0054] （6）circRNA‑MCP转染鱼EPC细胞，48h后收集细胞，用MCP的特异性抗体进行细胞免疫荧光实验，能在转染circRNA‑MCP的EPC细胞中观察到代表MCP（图6），说明circRNA‑MCP在鱼细胞中表达MCP。[0055] （7）按circRNA‑MCP与脂质体按5μg：1μL的比例混合，尔后注射鲈（长8 12cm，体~重35 55g），每尾注射50μgcircRNA‑MCP，对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。3天后取脾、肾~脏组织，提取RNA，反转录成cDNA后，用引物qMCP‑1（SEQIDNO:9）和引物qMCP‑2（SEQIDNO:10）通过定量PCR测定circRNA‑MCP的相对水平，以肌动蛋白基因为内参，内参基因表达水平的定量引物为β‑actin‑1（SEQIDNO:11）和β‑actin‑2（SEQIDNO:12），结果如图7所示，说明免疫注射后，circRNA‑MCP进入发脾、肾脏组织。[0056] （8）鲈免疫注射circRNA‑MCP第28天，人工接种实施例一步骤（8）中的传染性脾肾坏死病毒液，同设空白对照组（每尾注射磷酸缓冲液200μl）。注射的后的鱼在27 29℃饲~养，每天喂料3次，观察鲈的活动状况，检查、记录发病情况。[0057] 在本实验条件下，空白对照组和免疫组的发病率分别75%、45%，免疫组的发病率比对照组低30%。[0058] 本发明中，DNA序列为：[0059] SEQIDNO:1：[0060] TAATACGACTCACTATAGG[0061] SEQIDNO:2：[0062] ATTTAGGTGACACTATAGAA[0063] SEQIDNO:3：[0064] CCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCA[0065] SEQIDNO:4：[0066] TCTGGACTAAAGCCGGACTTGT[0067] SEQIDNO:5：[0068] CCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACTCGAGTCTGGACTAAAGCCGGACTTGTGAATTCATGTCTGCAATCTCAGGTGCAAACGTAACCAGCGGGTTCATCGACATCTCCGCGTTTGATGCGATGGAGACCCACTTGTACGGCGGCGACAATGCCGTGACCTACTTTGCCCGTGAGACCGTGCGTAGTTCCTGGTACAGCAAACTGCCCGTCACCCTGTCAAAACAGACTGGCCATGCCAATTTTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGGTGGCGAGGGGCGGCGACTACCTCATTAATGTGTGGCTGCGTGTTAAGATCCCCTCCATCACATCCAGCAAGGAGAACAGCTACATCCGCTGGTGCGACAATCTGATGCACAATCTAGTGGAGGAGGTGTCGGTGTCATTTAACGACCTGGTGGCACAGACCCTCACCAGCGAGTTCCTTGACTTCTGGAACGCCTGCATGATGCCCGGCAGCAAACAGTCTGGCTACAACAAGATGATTGGCATGCGCAGCGACCTGGTGGCCGGCATCACCAACGGCCAGACTATGCCCGCCGTCTACCTTAATTTGCCCATTCCCCTCTTCTTTACCCGTGACACGGGCCTGGCGTTGCCTACCGTGTCTCTGCCGTACAACGAGGTGCGCATCCACTTCAAGCTGCGGCGCTGGGAGGACCTGCTCATCAGCCAGAGCAACCAGGCCGACATGGCCATATCGACCGTCACCCTGGCTAACATTGGCAATGTAGCACCCGCACTGACCAATGTGTCTGTGATGGGCACTTACGCTGTACTGACAAGCGAGGAGCGTGAGGTGGTGGCCCAGTCTAGTCGTAGCATGCTCATTGAACAGTGCCAGGTGGCGCCCCGTGTGCCCGTCACGCCCGCAGACAATTCTTTGGTGCATCTGGACCTCAGGTTCAGTCACCCCGTGAAGGCCTTGTTCTTTGCAGTAAAGAACGTCACCCACCGCAACGTGCAAAGCAACTACACCGCGGCCAGTCCCGTGTATGTCAACAACAAGGTGAATCTGCCATTGATGGCCACCAATCCCCTGTCCGAGGTGTCACTCATTTACGAGAACACCCCTCGGCTCCACCAGATGGGAGTAGACTACTTCACATCTGTCGACCCCTACTACTTTGCGCCCAGCATGCCTGAGATGGATGGTGTTATGACCTACTGCTATACGTTGGACATGGGCAATATCAACCCCATGGGTTCAACCAACTACGGCCGCCTGTCCAACGTCACCCTGTCATGTAAGGTGTCGGACAATGCAAAGACCACCGCGGCGGGCGGTGGCGGCAACGGCTCCGGCTACACGGTGGCCCAAAAGTTTGAACTGGTCGTTATTGCTGTCAACCACAACATCATGAAGATTGCTGACGGCGCCGCAGGCTTCCCTATCCTGTAA[0069] SEQIDNO:6：[0070] TTACAGGATAGGGAAGCCTGC[0071] SEQIDNO:7：[0072] TACACGGTGGCCCAAAAGTT[0073] SEQIDNO:8：[0074] ACACCGGCCTTATTCCAAGC[0075] SEQIDNO:9：[0076] CAGGCGTTCCAGAAGTCAAGG[0077] SEQIDNO:10：[0078] CGTGAGACCGTGCGTAGTTC[0079] SEQIDNO:11：[0080] CCCAGAGCAAGAGAGGTATC[0081] SEQIDNO:12：[0082] GCTGTGGTGGTGAAGGAGTAG

专利地区：江苏

专利申请日期：2021-12-31

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114317572B