一种恩格列净中间体及其有关物质的高效液相色谱检测方法

专利名称：一种恩格列净中间体及其有关物质的高效液相色谱检测方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111615625.5

专利申请（专利权）人：浙江海翔药业股份有限公司,浙江海翔川南药业有限公司,上海海翔医药科技发展有限公司
权利人地址：浙江省台州市椒江区外沙支路100号

专利发明（设计）人：徐定洪,唐梓杰,石岳崚,赵富录,陈明龙,徐丹萍,李金涛

专利摘要：本发明提供了一种恩格列净中间体及其有关物质的高效液相色谱检测方法。该检测方法包括：采用辛烷基硅烷键合硅胶或五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以pH值为2.5～6.5的磷酸水溶液或磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈‑甲醇溶液或乙腈‑四氢呋喃溶液为流动相B，进行梯度洗脱；将含恩格列净中间体及其有关物质的样品，用稀释剂配制成样品溶液，将样品溶液注入液相色谱仪，检测并记录色谱图。本发明的检测方法具有分析时间短、灵敏度高、专属性及耐用性好等优点，通过该方法可以简单、快速、灵敏、准确、可靠地检测恩格列净中间体A及其有关物质，有利于有效监测和控制产品质量。

主权利要求：
1.一种恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8的高效液相色谱检测方法，其中所述恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8的结构式如下：所述检测方法的特征在于，
1)色谱条件：
采用辛烷基硅烷键合硅胶或五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以pH值为2.5～6.5的磷酸水溶液或磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈‑甲醇溶液或乙腈‑四氢呋喃溶液为流动相B，进行梯度洗脱；
其中，
流动相B中乙腈与甲醇或乙腈与四氢呋喃的体积比为100:0～70:30；
所述梯度洗脱如下：
流动相的流速为0.8～1.2ml/min；所述色谱柱的柱温为20～40℃；检测波长为210～
230nm；进样体积为5～10μl；
2)检测步骤：
分别将空白溶液、系统适应性溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述色谱柱的柱长为150～250mm，填料粒径3～5μm，柱内径为4.6mm。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相A为pH值为2.5～3.5的磷酸水溶液或磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢铵和磷酸氢二铵；磷酸盐缓冲液的浓度为0.005～0.01mol/L。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相B中乙腈与甲醇的体积比为80:
20，或者，乙腈与四氢呋喃的体积比为90:10。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述梯度洗脱如下：
6.根据权利要求1所述的检测方法，其中，流动相的流速为1.0ml/min；所述色谱柱的柱温为25～35℃；检测波长为220nm；所述供试品溶液的浓度为0.3～0.8mg/ml。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其中，稀释剂为有机溶剂和纯化水的混合溶液；所述有机溶剂与纯化水的体积比为40：60～60：40。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其中，所述有机溶剂为乙腈、甲醇，或者乙腈和甲醇的混合有机溶剂，其中所述混合有机溶剂中乙腈与甲醇的体积比为30～50：5～15。
9.根据权利要求2所述的检测方法，其中，所述色谱柱选自ThermoAccucoreXLC8，
150mm×4.6mm，4μm；PhenomenexKinetexF5，250×4.6mm，5μm；ACE3C18‑PFP，150×
4.6mm，3μm；或者AgilentZORBAXRX‑C8，250×4.6mm，5μm。
10.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述流动相A为pH值为3的磷酸水溶液。
11.根据权利要求7所述的检测方法，其中，稀释剂为有机溶剂和纯化水的混合溶液；所述有机溶剂与纯化水的体积比为50：50。
12.根据权利要求8所述的检测方法，其中，所述有机溶剂为乙腈、甲醇，或者乙腈和甲醇的混合有机溶剂，其中所述混合有机溶剂中乙腈与甲醇的体积比为40：10。
13.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在检测步骤之前进行溶液配制：空白溶液：稀释剂
杂质对照品贮备液：分别取有关物质A1对照品、有关物质A2对照品、有关物质A3对照品、有关物质A4对照品、有关物质A5对照品、有关物质A6对照品、有关物质A7对照品和有关物质A8对照品，先用乙腈溶解，再用稀释剂配制成各杂质对照品贮备液；
系统适应性溶液：取恩格列净中间体A对照品和所述各杂质对照品贮备液，先用乙腈溶解，再用稀释剂配制成系统适应性溶液；
供试品溶液：取恩格列净中间体A，先用乙腈溶解，再用稀释剂配制成供试品溶液。
14.根据权利要求1所述的检测方法，其中，按照峰面积归一化法计算恩格列净中间体A的纯度及其有关物质A1‑A8的含量；恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8之间的分离度均大于1.5；恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8的定量限均为0.03％；恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8的检测限均为0.01％。 说明书 : 一种恩格列净中间体及其有关物质的高效液相色谱检测方法技术领域[0001] 本发明涉及药物化学分析领域，具体涉及一种恩格列净中间体及其有关物质的高效液相色谱检测方法。背景技术[0002] 恩格列净(Jardiance)是由勃林格殷格翰和礼来公司联合开发的一款钠‑葡萄糖协同转运蛋白‑2(SGLT‑2)抑制剂类药物，能够阻断肾脏中葡萄糖的再吸收作用，将过多的葡萄糖排泄到体外，从而达到降低血糖水平的效果，而且该降糖效果不依赖于β细胞功能和胰岛素抵抗。[0003] 恩格列净的关键中间体为恩格列净中间体A(CAS号：915095‑94‑2)，分子式：C17H16ClIO2，分子量：414.67，结构式如下：[0004][0005] 恩格列净中间体A[0006] 根据专利文献CN101193903B，恩格列净中间体A的合成路线如下：[0007] 通常情况下，经过上述合成路线的反应，所得恩格列净中间体A中会含有未反应完全的起始原料、中间体以及降解产物等有关物质，其中，[0008] 恩格列净有关物质A1为合成工艺起始原料，分子式：C13H7ClFIO，分子量：360.55，化学结构式如下：[0009][0010] 恩格列净有关物质A2为合成工艺起始原料的位置异构体，分子式：C13H7ClFIO，分子量：360.55，化学结构式如下：[0011][0012] 恩格列净有关物质A3为第一步反应产生的中间体，分子式：C17H14ClIO3，分子量：428.65，化学结构式如下：[0013][0014] 恩格列净有关物质A6为第一步反应中有关物质A2的衍生杂质，分子式：C17H14ClIO3，分子量：428.65，化学结构式如下：[0015][0016] 恩格列净有关物质A7为第一步反应的工艺杂质，由中间体A脱碘产生，分子式：C17H15ClO3，分子量：302.75，化学结构式如下：[0017][0018] 恩格列净有关物质A8为第一步反应的工艺杂质，由起始原料A1与两分子(S)‑3‑羟基四氢呋喃反应产生，分子式：C21H21IO5，分子量：480.29，化学结构式如下：[0019][0020] 恩格列净有关物质A5为第二步反应中有关物质A7的衍生杂质，分子式：C17H17ClO2，分子量：288.77，化学结构式如下：[0021][0022] 恩格列净有关物质A4为第二步反应中有关物质A6的衍生杂质，分子式：C17H16ClIO2，分子量：414.67，化学结构式如下：[0023][0024] CN112986456A公开了一种恩格列净中间体的分析检测方法，但是该方法不能有效地分离上述合成路线的恩格列净中间体A及其有关物质。[0025] CN106706768B公开了一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法，同样，该方法不能有效地分离上述合成路线的恩格列净中间体A及其有关物质。[0026] 所以，为了追踪和控制药品质量，建立有效的恩格列净中间体A及其有关物质的检测方法十分必要。发明内容[0027] 为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种恩格列净中间体A及其有关物质的高效液相色谱检测方法，该方法具有分析时间短、灵敏度高、专属性及耐用性好等优点，通过该方法可以简单、快速、灵敏、准确、可靠地检测恩格列净中间体A及其有关物质，有利于有效监测和控制产品质量。[0028] 本发明提供的技术方案如下：[0029] 一种恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8的高效液相色谱检测方法，其中所述恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8的结构式如下：[0030][0031][0032] 本发明的检测方法的特征在于，[0033] 1)色谱条件：[0034] 采用辛烷基硅烷键合硅胶或五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以pH值为2.5～6.5的磷酸水溶液或磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈‑甲醇溶液或乙腈‑四氢呋喃溶液为流动相B，进行梯度洗脱；[0035] 2)检测步骤：[0036] 分别将空白溶液、系统适应性溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图。[0037] 进一步地，本发明所用的色谱柱是以辛烷基硅烷键合硅胶或五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂，可选用的品牌不限，例如安捷伦、岛津、赛默飞、沃特世(Waters)、YMC等等；所述色谱柱的柱长为150～250mm，填料粒径3～5μm，柱内径为4.6mm；优选选自ThermoAccucoreXLC8，150mm×4.6mm，4μm；PhenomenexKinetexF5，250×4.6mm，5μm；ACE3C18‑PFP，150×4.6mm，3μm；AgilentZORBAXRX‑C8，250×4.6mm，5μm。[0038] 进一步地，优选pH值为2.5～3.5的磷酸水溶液或磷酸盐缓冲液，更优选pH值为3的磷酸水溶液。[0039] 进一步地，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢铵和磷酸氢二铵，磷酸盐缓冲液的浓度为0.005～0.01mol/L。[0040] 进一步地，所述流动相B中乙腈与甲醇或乙腈与四氢呋喃的体积比为100:0～70:30；优选乙腈与甲醇的体积比为80:20，或者，优选乙腈与四氢呋喃的体积比为90:10。[0041] 进一步地，所述梯度洗脱程序见表1。[0042] 表1[0043][0044] 优选梯度洗脱程序见表2。[0045] 表2[0046][0047] 进一步地，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min；优选为1.0ml/min。[0048] 进一步地，所述色谱柱的柱温为20～40℃；优选为25～35℃，更优选为30℃。[0049] 进一步地，检测波长为210～230nm；优选为220nm。[0050] 进一步地，稀释剂为有机溶剂和纯化水的混合溶液；所述有机溶剂与纯化水的体积比为40：60～60：40，优选有机溶剂与纯化水的体积比为50：50。[0051] 进一步地，所述有机溶剂为乙腈、甲醇，或者乙腈和甲醇的混合有机溶剂，其中所述混合有机溶剂中乙腈与甲醇的体积比为30～50：5～15，优选40：10。[0052] 进一步地，所述供试品溶液的浓度为0.3～0.8mg/ml，优选为0.5mg/ml。[0053] 进一步地，所述进样体积为5～10μl。[0054] 进一步地，在检测步骤之前进行溶液配制：[0055] 空白溶液：稀释剂[0056] 杂质对照品贮备液：分别取有关物质A1对照品、有关物质A2对照品、有关物质A3对照品、有关物质A4对照品、有关物质A5对照品、有关物质A6对照品、有关物质A7对照品和有关物质A8对照品，先用乙腈溶解，再用稀释剂配制成各杂质对照品贮备液；各杂质对照品贮备液中有关物质的浓度均为0.3～0.8mg/ml，优选为0.5mg/ml；[0057] 系统适应性溶液：取恩格列净中间体A对照品和所述各杂质对照品贮备液，先用乙腈溶解，再用稀释剂配制成系统适应性溶液；系统适应性溶液中恩格列净中间体A的浓度为0.3～0.8mg/ml，优选为0.5mg/ml，各有关物质的浓度均为3～8μg/ml，优选为5μg/ml；[0058] 供试品溶液：取恩格列净中间体A，先用乙腈溶解，再用稀释剂配制成供试品溶液；供试品溶液中恩格列净中间体A的浓度为0.3～0.8mg/ml，优选为0.5mg/ml。[0059] 本发明中使用的恩格列净中间体A对照品经结构确证，纯度＞99％；本发明中使用的恩格列净中间体A为随机抽取的生产批次。[0060] 进一步地，本发明按照峰面积归一化法计算恩格列净中间体A的纯度及其有关物质A1‑A8的含量；以满足信噪比S/N不小于10，样品浓度的0.03％为定量限；以满足信噪比S/N约为3，样品浓度的0.01％为检测限。更进一步地，恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8之间的分离度均大于1.5；恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8的定量限均为0.03％；恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8的检测限均为0.01％。[0061] 本发明所述的测定恩格列净中间体A及其有关物质的高效液相色谱方法，通过综合考察色谱柱、流动相、梯度洗脱程序、流速、以及柱温对分离检测的影响，优化了检测方法，具有分析时间短(25～35min)，灵敏度高(定量限为0.03％；检测限为0.01％)，专属性(恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8分离度不小于1.5)及耐用性好等优点，为恩格列净中间体A合成中的质量追踪和质量控制提供了简单、快速、灵敏、准确、可靠的方法。附图说明[0062] 图1是按实施例1条件检测的空白溶液的液相色谱图。[0063] 图2是按实施例1条件检测的系统适应性溶液的液相色谱图。[0064] 图3是按实施例1条件检测的供试品溶液的液相色谱图。[0065] 图4是按实施例1条件检测的定量限溶液的液相色谱图。[0066] 图5是按实施例1条件检测的检测限溶液的液相色谱图。[0067] 图6是按实施例4条件检测的系统适应性溶液的液相色谱图。[0068] 图7是按实施例5条件检测的系统适应性溶液的液相色谱图。[0069] 图8是按实施例6条件检测的系统适应性溶液的液相色谱图。[0070] 图9是按实施例7条件检测的系统适应性溶液的液相色谱图。[0071] 图10是按对比例1条件检测的系统适应性溶液的液相色谱图。[0072] 图11是按对比例2条件检测的系统适应性溶液的液相色谱图。[0073] 图12是按对比例2条件检测的系统适应性溶液的液相色谱图。具体实施方式[0074] 下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。[0075] 本发明实施例所用的高效液相色谱仪是安捷伦公司的液相色谱仪。[0076] 本发明实施例所用的恩格列净中间体A及其有关物质为海翔药业自制并经结构确证。[0077] 实施例1[0078] (1)色谱条件[0079] 液相色谱仪：Agilent1260液相色谱仪，DAD检测器[0080] 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(ThermoAccucoreXLC8，150×4.6mm，4μm)[0081] 流速：1.0ml/min柱温：30℃[0082] 检测波长：220nm 进样量：5μl[0083] 流动相A：磷酸水溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3[0084] 流动相B：乙腈‑甲醇(80:20V/V)[0085] 稀释剂：乙腈‑甲醇‑纯化水(40:10:50V/V/V)[0086] 梯度洗脱程序见表3。[0087] 表3[0088][0089] (2)溶液配制[0090] 杂质对照品贮备液：取有关物质A1对照品、有关物质A2对照品、有关物质A3对照品、有关物质A4对照品、有关物质A5对照品、有关物质A6对照品、有关物质A7对照品和有关物质A8对照品各约25mg，精密称定，分别置于50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。[0091] 系统适应性溶液：取恩格列净中间体A对照品约50mg，精密称定，置100ml容量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液各1ml置上述100ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。[0092] 供试品溶液：取恩格列净中间体A约25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀。[0093] 恩格列净中间体对照品贮备液：取恩格列净中间体A对照品约25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。[0094] 定量限溶液：精密量取所述杂质对照品贮备液及所述恩格列净中间体对照品贮备液各1ml至100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取3ml上述溶液至100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。[0095] 检测限溶液：精密量取所述定量限溶液3ml置10ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。[0096] (3)测定[0097] 分别将空白溶液(即，稀释剂)、系统适应性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图。[0098] 空白溶液(即，稀释剂)、系统适应性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液的色谱图分别见图1～图5。[0099] 图1表明空白对检测无干扰；图2表明恩格列净中间体A及各有关物质之间分离度良好，均大于1.5；图3表明供试品溶液中检出有关物质A3和有关物质A5，其他有关物质未检出；图4表明恩格列净中间体A及各有关物质的定量限均为0.03％；图5表明恩格列净中间体A及各有关物质的检测限均为0.01％。以上图谱和数据表明本申请检测方法的专属性好，检测灵敏度高。[0100] 实施例2[0101] (1)色谱条件[0102] 将流速、柱温、流动相比例、流动相pH、波长及进样量按表4和表5在一定范围内变动，其它色谱条件同实施例1。[0103] (2)溶液配制[0104] 杂质对照品贮备液：取有关物质A1对照品、有关物质A2对照品、有关物质A3对照品、有关物质A4对照品、有关物质A5对照品、有关物质A6对照品、有关物质A7对照品和有关物质A8对照品各约25mg，精密称定，分别置于50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；[0105] 系统适应性溶液：取恩格列净中间体A对照品约50mg，精密称定，置100ml容量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液各1ml置上述100ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。[0106] 供试品溶液：取恩格列净中间体A约25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀。[0107] (3)测定[0108] 分别将空白溶液(即，稀释剂)、系统适应性溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图。[0109] 将波长及进样量在一定范围内变动，选择合适波长及进样量，系统适应性溶液结果见表4。[0110] 表4考察波长和进样量的色谱条件[0111]波长，进样量选择 210nm，5μl 220nm，5μl 230nm，5μl 220nm，10μl有关物质A1(％) 0.906 0.915 0.770 0.940有关物质A2(％) 0.729 0.826 0.899 0.854有关物质A3(％) 0.661 0.947 0.883 0.977有关物质A4(％) 1.110 1.010 0.713 1.045有关物质A5(％) 0.878 0.992 0.659 1.022有关物质A6(％) 0.722 1.024 0.695 1.053有关物质A7(％) 0.760 0.924 0.475 0.948有关物质A8(％) 0.616 1.013 0.988 1.041中间体A(％) 93.617 92.348 93.918 92.120[0112] 结果表明波长在210～230nm时，系统适应性溶液(约含1％有关物质A1‑A8)检测结果较准确，优选为220nm；进样量为5μl～10μl时，检查结果一致，但比较主峰峰高，优选为5μl，主峰峰高955。[0113] 将流速、柱温、流动相比例和流动相pH的色谱参数在一定范围内变动，进行单因素考察，具体色谱条件见表5、供试品溶液结果见表6。[0114] 表5考察耐用性的色谱条件[0115][0116][0117] 表6测定结果[0118][0119] 结果表明色谱参数在一定范围内变动时，恩格列净中间体A与各有关物质的分离度均不小于1.5，恩格列净中间体A及各有关物质的检出结果基本稳定，方法耐用性好。[0120] 实施例3[0121] (1)色谱条件[0122] 同实施例1[0123] (2)溶液配制[0124] 60％线性溶液：取恩格列净中间体A约15mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀。[0125] 80％线性溶液：取恩格列净中间体A约20mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀。[0126] 100％线性溶液：取恩格列净中间体A约25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀。[0127] 120％线性溶液：取恩格列净中间体A约30mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀。[0128] 160％线性溶液：取恩格列净中间体A约40mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.5ml乙腈溶解，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀。[0129] 定量限溶液：精密量取100％线性溶液1ml至100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取3ml上述溶液至100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。[0130] (3)测定[0131] 分别将空白溶液(即，稀释剂)、定量限溶液、各线性溶液依次注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图，线性结果见表7。[0132] 表7线性结果[0133] 考察因素 0.03％ 60％ 80％ 100％ 120％ 160％浓度(μg/ml) 0.15 300.2 402.4 501.2 605.2 800.4峰面积 1.984 3609.104 4786.131 5896.250 7108.533 9345.529[0134] 结果表明，线性曲线y＝11.6578x+54.3088，R＝0.99991，样品浓度在0.15μg/ml～800.4μg/ml时线性良好。[0135] 实施例4[0136] (1)色谱条件[0137] 液相色谱仪：Agilent1260液相色谱仪，DAD检测器[0138] 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(ThermoAccucoreXLC8，150×4.6mm，4μm)[0139] 流速：1.0ml/min柱温：20℃[0140] 检测波长：220nm 进样量：5μl[0141] 流动相A：磷酸盐缓冲溶液，0.005mol/LKH2PO4溶液，用磷酸调节pH值为2.5[0142] 流动相B：乙腈[0143] 稀释剂：乙腈‑纯化水(40:60V/V)[0144] 梯度洗脱程序见表8。[0145] 表8[0146][0147] (2)溶液配制[0148] 同实施例2。[0149] (3)测定[0150] 分别将空白溶液(即，稀释剂)、系统适应性溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图，系统适应性图谱见图6。结果表明，恩格列净中间体A与有关物质分离度均不小于1.5，恩格列净中间体A及有关物质的检出结果基本稳定。[0151] 实施例5[0152] (1)色谱条件[0153] 液相色谱仪：Agilent1260液相色谱仪，DAD检测器[0154] 色谱柱：五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(PhenomenexKinetexF5，250×4.6mm，5μm)[0155] 流速：1.0ml/min柱温：25℃[0156] 检测波长：220nm 进样量：5μl[0157] 流动相A：磷酸盐缓冲溶液，0.005mol/LNaH2PO4溶液，用磷酸调节pH值为3.5[0158] 流动相B：乙腈[0159] 稀释剂：乙腈‑纯化水(60:40V/V)[0160] 梯度洗脱程序见表9。[0161] 表9[0162][0163] (2)溶液配制[0164] 同实施例2。[0165] (3)测定[0166] 分别将空白溶液(即，稀释剂)、系统适应性溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图，系统适应性图谱见图7。结果表明，恩格列净中间体A与有关物质分离度均不小于1.5，恩格列净中间体A及有关物质的检出结果基本稳定。[0167] 实施例6[0168] (1)色谱条件[0169] 液相色谱仪：Agilent1260液相色谱仪，DAD检测器[0170] 色谱柱：五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(ACE3C18‑PFP，150×4.6mm，3μm)[0171] 流速：1.0ml/min柱温：30℃[0172] 检测波长：220nm 进样量：5μl[0173] 流动相A：磷酸盐缓冲溶液，0.01mol/L(NH4)2HPO4溶液，用磷酸调节pH值为6.5[0174] 流动相B：乙腈‑甲醇(70:30V/V)[0175] 稀释剂：乙腈‑纯化水(50:50V/V)[0176] 梯度洗脱程序见表10。[0177] 表10[0178][0179] (2)溶液配制[0180] 同实施例2。[0181] (3)测定[0182] 分别将空白溶液(即，稀释剂)、系统适应性溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图，系统适应性图谱见图8。结果表明，恩格列净中间体A与有关物质分离度均不小于1.5，恩格列净中间体A及有关物质的检出结果基本稳定。[0183] 实施例7[0184] (1)色谱条件[0185] 液相色谱仪：Agilent1260液相色谱仪，DAD检测器[0186] 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AgilentZORBAXRX‑C8，250×4.6mm，5μm)[0187] 流速：1.0ml/min柱温：40℃[0188] 检测波长：220nm进样量：5μl[0189] 流动相A：磷酸盐缓冲溶液，0.01mol/LNH4H2PO4溶液，用磷酸调节pH值为4.5，[0190] 流动相B：乙腈‑四氢呋喃(90:10V/V)[0191] 稀释剂：甲醇‑纯化水(50:50V/V)[0192] 梯度洗脱程序见表11。[0193] 表11[0194][0195] (2)溶液配制[0196] 同实施例2。[0197] (3)测定[0198] 分别将空白溶液(即，稀释剂)、系统适应性溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图，系统适应性图谱见图9。结果表明，恩格列净中间体A与有关物质分离度均不小于1.5，恩格列净中间体A及有关物质的检出结果基本稳定。[0199] 对比例1[0200] 该实验重复了对比文献CN112986456A的实施例1的检测方法，作为本申请的对比实验，具体实验条件如下：[0201] (1)色谱条件[0202] 液相色谱仪：Agilent1260液相色谱仪，DAD检测器[0203] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AgilentZORBAXEclipsePlusC18，100×4.6mm，3.5μm)[0204] 流速：1.0ml/min柱温：30℃[0205] 检测波长：225nm进样量：10μl[0206] 流动相A：0.005mol/L乙酸铵溶液，用氨水调节pH值为7.5[0207] 流动相B：乙腈[0208] 稀释剂：二甲基亚砜‑乙腈(20:80V/V)[0209] 梯度洗脱程序见表12。[0210] 表12[0211][0212] (2)溶液配制[0213] 杂质对照品贮备液：取有关物质A1对照品、有关物质A2对照品、有关物质A3对照品、有关物质A4对照品、有关物质A5对照品、有关物质A6对照品、有关物质A7对照品和有关物质A8对照品各约25mg，精密称定，分别置于50ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。[0214] 系统适应性溶液：取恩格列净中间体A对照品约50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液各1ml置上述50ml容量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。[0215] 供试品溶液：取恩格列净中间体A约50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。[0216] (3)测定[0217] 分别将空白溶液(即，稀释剂)、系统适应性溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图，系统适应性图谱见图10。[0218] 图10结果表明，采用对比文献CN112986456A的检测方法，有关物质A6与有关物质A3未分离，恩格列净中间体A拖尾，对有关物质A4检测有干扰，无法有效地分离和检测恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8。[0219] 对比例2[0220] 该实验重复了对比文献CN106706768B实施例1的检测方法，作为本申请的对比实验，具体实验条件如下：[0221] (1)色谱条件[0222] 液相色谱仪：Agilent1260液相色谱仪[0223] 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AgilentZORBAXRx‑C8，250×4.6mm，5μm)或苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(Generall‑MPH250×4.6mm，5μm)[0224] 流速：1.0ml/min柱温：25℃[0225] 检测波长：224nm 进样量：20μl[0226] 流动相A：磷酸水溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3.5，[0227] 流动相B：甲醇‑乙腈(50:50V/V)[0228] 稀释剂：流动相[0229] 梯度洗脱程序见表13。[0230] 表13[0231][0232] (2)溶液配制[0233] 杂质对照品贮备液：取有关物质A1对照品、有关物质A2对照品、有关物质A3对照品、有关物质A4对照品、有关物质A5对照品、有关物质A6对照品、有关物质A7对照品和有关物质A8对照品各约20mg，精密称定，分别置于50ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；[0234] 系统适应性溶液：取恩格列净中间体A对照品约40mg，精密称定，置50ml容量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液各1ml置上述50ml容量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。[0235] 供试品溶液：取恩格列净中间体A约40mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。[0236] (3)测定[0237] 分别将空白溶液(即，稀释剂)、系统适应性溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，并记录色谱图，使用C8柱的系统适应性图谱见图11，使用苯基柱的系统适应性图谱见图12。[0238] 图11和图12结果表明，采用对比文献CN106706768B的检测方法，空白基线噪音大，分析时间长；使用C8柱时，恩格列净中间体A与有关物质A4、有关物质A2与有关物质A3、有关物质A1与有关物质A5均未分离；使用苯基柱时，恩格列净中间体A与有关物质A4、有关物质A2与有关物质A5均未分离；这两种方法都无法有效分离和检测恩格列净中间体A及其有关物质A1‑A8。[0239] 以上描述了本发明的具体实施例，需要理解的是，本发明并不局限于上述特定的实施例，本领域技术人员对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

专利地区：浙江

专利申请日期：2021-12-27

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114264747B