操纵双链DNA末端的方法发明专利

专利名称：操纵双链DNA末端的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202080051846.1

专利申请（专利权）人：华大青兰生物科技(无锡)有限公司
权利人地址：江苏省无锡市宜兴市环科园恒通路128号

专利发明（设计）人：林继伟,王洪琦

专利摘要：操纵双链DNA末端的方法，其原理是利用限制性缺刻酶在双链DNA的一条链上先产生一个或多个缺刻，然后利用寡核苷酸适配体结合同一个或不同的限制性缺刻酶在双链DNA的另一条链上产生切割，切割的位置通过寡核苷酸适配体的设计确定，最终切断目的双链DNA，并在切割处产生各种长度的5’突出末端、各种长度的3’突出末端或平末端。利用本发明的方法产生的双链DNA末端的碱基可以随意设计，这种末端可用于双链DNA拼接，特别是双链DNA的无缝拼接。

主权利要求：
1.产生预定的双链DNA末端的方法，所述方法包括：
使用限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个或多个缺刻，以在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区；
使用具有所述限制性缺刻酶的识别位点的寡核苷酸适配体与所述单链区杂交，并结合使用同一个限制性缺刻酶在目标双链DNA的另一条链的预定位置产生切割，最终切断目标双链DNA，并在切割处产生预定的末端；
其中所述预定的末端是3'悬挂、平末端或5'悬挂；
其中所述限制性缺刻酶的识别序列与切割位置不重合；
其中所述寡核苷酸适配体是具有双链部分和单链部分的DNA分子，所述寡核苷酸适配体在双链部分包含所述限制性缺刻酶的识别位点，但缺少可被该限制性缺刻酶切割的序列，所述寡核苷酸适配体的单链部分能够与目标双链DNA的单链区杂交形成双链结构，该双链结构可被所述限制性缺刻酶识别，并使得目标双链DNA的另一条链的预定位置处于可以介由所述限制性缺刻酶对寡核苷酸适配体上的识别位点的识别而被所述限制性缺刻酶切割的位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述限制性缺刻酶是Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI或Nb.BtsI。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标双链DNA通过在待改造的双链DNA上添加含有限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段获得，所述双链DNA片段的添加位置使得所述限制性缺刻酶能够通过识别所添加的识别序列而在所述预定位置产生一个或多个缺刻。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标双链DNA为线性且在接近其一侧末端的位置上含有所述限制性缺刻酶的识别序列，所述目标双链DNA的一条链的预定位置与根据该识别序列确定的切割位点重合，使用限制性缺刻酶在该预定位置上产生切割，使得切割位点与该侧末端之间的包含识别序列的一段DNA单链从双链上解离，从而在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述目标双链DNA通过在待改造的线性双链DNA的一端添加含有限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段获得，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据该识别序列确定的切割位点重合，利用限制性缺刻酶在该预定位置上产生切割后，从双链上解离的DNA单链是切割位点与所添加的双链DNA片段的游离末端之间的包含识别序列的DNA单链。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标双链DNA在同一条链上含有至少两个序列相同的识别序列，所述至少两个识别序列方向相同且它们之间的距离接近，所述目标双链DNA的一条链的预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，使用所述限制性缺刻酶在所述至少两个识别序列的切割位点上分别切割一次，使得所述至少两个切割位点之间的包含识别序列的DNA单链从双链上解离，从而在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述目标双链通过在待改造的双链DNA上添加含有所述至少两个识别序列的双链DNA片段获得，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标双链DNA分别在两条链上含有至少两个序列相同的识别序列的双链DNA片段，所述至少两个识别序列方向相反且它们之间的距离接近，目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述限制性缺刻酶在所述至少两个识别序列的切割位点上分别切割一次，使得两个切割位点之间的双链解离，从而在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述目标双链通过在待改造的双链DNA上添加含有所述至少两个识别序列的双链DNA片段获得，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合。
10.根据权利要求3‑9任一项的方法，其中在添加到待改造的双链DNA上的双链DNA片段中，至少一个限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的末端，使得在添加所述双链DNA片段之后，所述限制性缺刻酶识别序列在其切割位点一侧紧邻待改造的双链DNA；
或者，在添加到待改造的双链DNA上的双链DNA片段中，至少一个限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的末端之间具有一个或更多个核苷酸，从而使得在添加所述双链DNA片段之后，所述限制性缺刻酶识别序列在其切割位点一侧与待改造的双链DNA之间具有所述的一个或更多个核苷酸。
11.根据权利要求4‑9任一项所述的方法，其中所述解离在30‑75摄氏度下进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述解离在45‑65摄氏度下进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述解离在53‑63摄氏度下进行。
14.根据权利要求1所述的方法，其中产生的单链区的长度是5‑50个碱基。
15.根据权利要求14所述的方法，其中产生的单链区的长度是10‑30个碱基。
16.根据权利要求15所述的方法，其中产生的单链区的长度是15‑20个碱基。
17.根据权利要求1‑9任一项所述的方法，其中寡核苷酸适配体由两条寡核苷酸杂交形成，双链部分是两条寡核苷酸发生杂交的部分，单链部分是两条寡核苷酸中未参与杂交的部分，限制性缺刻酶识别位点位于双链部分；或者寡核苷酸适配体由一条可形成发夹结构的寡核苷酸组成，发夹的茎部是双链部分，开环部为单链部分，限制性缺刻酶识别位点位于发夹的双链部分。
18.根据权利要求1‑9任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，或者寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间具有1个、2个或更多个核苷酸。
19.根据权利要求1‑9任一项的方法，其中所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域位于其单链区上且与其双链区紧邻，或者所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域位于其单链区上且与其双链区之间相隔1个、2个或更多个核苷酸。
20.根据权利要求19的方法，其中所使用的限制性缺刻酶为Nt.AlwI或Nt.BstNBI，所述寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量是2，目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量为2，最终产生4个碱基的3’悬挂。
21.根据权利要求20的方法，其中所使用的寡核苷酸适配体为16种寡核苷酸适配体的混合物，所述16种寡核苷酸适配体的紧邻其双链部分的2个单链核苷酸不同，其它核苷酸均相同，所述紧邻其双链部分的2个单链核苷酸包括4种核苷酸在这两个位置上的所有排列组合。
22.根据权利要求1‑9任一项的方法，其中所述目标双链DNA上与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域包括该目标双链DNA的单链区和与该单链区相邻的部分双链区序列，所述与该单链区相邻的部分双链区序列被称为被入侵区；所述寡核苷酸适配体的单链部分包括能与目标双链DNA的单链区杂交的序列，在该序列与寡核苷酸适配体的双链部分之间还包括能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列，所述能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列被称为入侵区。
23.根据权利要求22的方法，其中入侵区的长度在1‑100碱基之间。
24.根据权利要求23的方法，其中入侵区的长度在1‑30碱基之间。
25.根据权利要求24的方法，其中入侵区的长度在3‑20碱基之间。
26.根据权利要求22或23的方法，其中所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，大于入侵区的核苷酸数量，其中所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的3’一侧，最终产生3’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，再减去入侵区的核苷酸数量；
或者，其中所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，大于入侵区的核苷酸数量，其中所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的5’一侧，最终产生5’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，再减去入侵区的核苷酸数量。
27.根据权利要求22或23的方法，其中所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，等于入侵区的核苷酸数量，最终产生平末端。
28.根据权利要求22或23的方法，其中所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，小于入侵区的核苷酸数量，其中所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的3’一侧，最终产生5’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量得到的数量，被入侵区核苷酸数量减去后的差值；
或者，其中所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，小于入侵区的核苷酸数量，其中所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的5’一侧，最终产生3’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量得到的数量，被入侵区核苷酸数量减去后的差值。
29.根据权利要求1‑9任一项的方法，其中所述方法在固定温度下进行，所述温度在37‑
75摄氏度之间。
30.根据权利要求29的方法，其中所述温度在45‑65摄氏度之间。
31.根据权利要求30的方法，其中所述温度是55摄氏度。
32.根据权利要求1‑9任一项的方法，其中所述方法在温度循环下进行；循环的最高温在50‑75摄氏度之间；循环的最低温在37‑55摄氏度之间；每个循环的时间是30秒‑20分钟。
33.根据权利要求32的方法，其中循环的最高温在55‑65摄氏度之间。
34.根据权利要求32的方法，其中循环的最低温在45‑55摄氏度之间。
35.根据权利要求32的方法，其中每个循环的时间是1分钟‑5分钟。
36.根据权利要求1‑9任一项的方法，所述方法在存在D‑海藻糖的条件下进行。
37.在目标单链DNA上任意预定位置产生切割的方法，所述方法包括：
使目标单链DNA的预定区域与寡核苷酸适配体的单链部分杂交，所述寡核苷酸适配体是具有双链部分和单链部分的DNA分子，其在双链部分包含限制性缺刻酶的识别位点，但缺少可被该限制性缺刻酶切割的序列，所述寡核苷酸适配体的单链部分能够与目标单链DNA的预定区域杂交形成双链结构，该双链结构可被所述限制性缺刻酶识别，并使得目标单链DNA的预定位置处于可以介由所述限制性缺刻酶对寡核苷酸适配体上的识别位点的识别而被所述限制性缺刻酶切割的位置；
使用所述限制性缺刻酶在所述目标单链的预定位置产生切割；
其中所述限制性缺刻酶的识别序列与切割位置不重合。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述限制性缺刻酶是Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI或Nb.BtsI。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中寡核苷酸适配体由两条寡核苷酸杂交形成，双链部分是两条寡核苷酸发生杂交的部分，单链部分是两条寡核苷酸中未参与杂交的部分，限制性缺刻酶识别位点位于双链部分；或者寡核苷酸适配体由一条可形成发夹结构的寡核苷酸组成，发夹的茎部包括相互杂交的双链部分和单链部分，限制性缺刻酶识别位点位于茎部的双链部分。
40.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，或者寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间具有1个、2个或更多个核苷酸。
41.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述目标单链DNA是DNA合成仪合成的寡核苷酸、带有f1复制子的质粒在phagemidrescue操作下获得的单链DNA、滚环复制中产生的单链DNA或双链DNA在变性条件下获得的单链DNA。
42.产生预定的双链DNA末端的方法，所述方法包括：
使用第一限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个或更多个缺刻，以在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区；
使用具有第二限制性缺刻酶的识别位点的寡核苷酸适配体与所述单链区杂交，并结合使用第二限制性缺刻酶在目标双链DNA的另一条链的预定位置产生切割，最终切断目标双链DNA，并在切割处产生预定的末端；
其中所述寡核苷酸适配体是具有双链部分和单链部分的DNA分子，所述寡核苷酸适配体包含所述第二限制性缺刻酶的识别位点，还包含所述第二限制性缺刻酶的切割位点的互补序列，但缺少可被第二限制性缺刻酶切割的序列，所述寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的单链区杂交并与所述寡核苷酸适配体的双链部分一起形成可被所述第二限制性缺刻酶识别并切割的双链结构，并使得目标双链DNA的另一条链的预定位置处于可以介由所述第二限制性缺刻酶对寡核苷酸适配体上的识别位点的识别而被所述限制性缺刻酶切割的位置；
所述第一限制性缺刻酶与所述第二限制性缺刻酶相同或不同。
43.根据权利要求42的方法，其中第一限制性缺刻酶是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶，或识别序列与切割位置重合的限制性缺刻酶；第二限制性缺刻酶是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶。
44.根据权利要求42的方法，其中第二限制性缺刻酶是Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI或Nb.BtsI。
45.根据权利要求42的方法，其中第一限制性缺刻酶是Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.BbvCI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI或Nb.BssSI。
46.根据权利要求42的方法，其中所述产生一段单链区是使用第一限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个缺刻或两个缺刻，使得一个缺刻与目标双链DNA的末端之间的DNA双链或者两个缺刻之间的双链DNA发生变性解离后产生单链区。
47.根据权利要求46的方法，其中所述两个缺刻位于目标双链DNA的同一条链上，或位于目标双链DNA的不同链上。
48.根据权利要求46的方法，其中所述解离在30‑75摄氏度下进行。
49.根据权利要求48的方法，其中所述解离在45‑65摄氏度下进行。
50.根据权利要求49的方法，其中所述解离在53‑63摄氏度下进行。
51.根据权利要求42的方法，其中产生的单链区的长度是1‑100个碱基。
52.根据权利要求51的方法，其中产生的单链区的长度是5‑50个碱基。
53.根据权利要求52的方法，其中产生的单链区的长度是10‑30个碱基。
54.根据权利要求53的方法，其中产生的单链区的长度是15‑20个碱基。
55.根据权利要求42的方法，其中所述寡核苷酸适配体包括双链部分和单链部分，寡核苷酸适配体包含第二限制性缺刻酶识别序列，但缺少可被第二限制性缺刻酶切割的序列，而仅有其互补序列，该互补序列构成所述寡核苷酸适配体的单链部分；寡核苷酸适配体的单链部分可与目标双链DNA的单链区杂交，杂交后由寡核苷酸适配体与目标双链DNA形成的结构可以被第二限制性缺刻酶识别并在目标双链DNA的单链区之中或其附近的预定位置发生切割。
56.根据权利要求42的方法，其中所述寡核苷酸适配体由两条寡核苷酸链杂交形成，双链部分是两条寡核苷酸发生杂交的部分，单链部分是两条寡核苷酸中未参与杂交的部分。
57.根据权利要求42的方法，其中所述寡核苷酸适配体由一条可形成发夹结构的寡核苷酸链组成，双链部分是发夹的茎部，单链部分是发夹的开环部分。
58.根据权利要求42的方法，其中所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域与所述寡核苷酸适配体的双链部分紧邻，并且所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域位于所述目标双链DNA的单链区上并与所述目标双链DNA的双链区之间紧邻或相隔1个、2个或更多个核苷酸。
59.根据权利要求58的方法，其中所述第二限制性缺刻酶是Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列位于双链部分，并且所述第二限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，或者寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间具有1个、2个或更多个核苷酸。
60.根据权利要求59的方法，其中所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.AlwI或Nt.BstNBI，所述寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量是2，目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量为2，最终产生4个碱基的3’悬挂；所使用的寡核苷酸适配体为16种寡核苷酸适配体的混合物，所述16种寡核苷酸适配体的紧邻其双链部分的2个单链核苷酸不同，其它核苷酸均相同，所述紧邻其双链部分的2个单链核苷酸包括4种核苷酸在这两个位置上的所有排列组合。
61.根据权利要求58的方法，其中所述第二限制性缺刻酶是Nb.BsrDI或Nb.BtsI，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列位于双链部分的两条链中具有单链部分的那条链上，该识别序列的3'端的一个核苷酸位于单链部分上，识别序列的其它核苷酸位于双链部分上，识别序列的反链互补序列的部分序列位于双链部分并紧邻其5'末端，所述部分序列为除了该反链互补序列的5'端的最后一个核苷酸之外的其它核苷酸。
62.根据权利要求42‑57任一项的方法，其中所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域与所述寡核苷酸适配体的双链部分紧邻；并且所述目标双链DNA上与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域不仅包括该目标双链DNA的单链区，还包括与该单链区相邻的部分双链区序列，所述与该单链区相邻的部分双链区序列被称为被入侵区；所述寡核苷酸适配体的单链部分包括能与目标双链DNA的单链区杂交的序列，在该序列与寡核苷酸适配体的双链部分之间还包括能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列，所述能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列被称为入侵区。
63.根据权利要求62的方法，其中入侵区的长度在1‑100碱基之间。
64.根据权利要求63的方法，其中入侵区的长度在1‑30碱基之间。
65.根据权利要求64的方法，其中入侵区的长度在3‑20碱基之间。
66.根据权利要求62的方法，其中所述第二限制性缺刻酶是Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列位于双链部分，并且所述第二限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，或者寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间具有1个、2个或更多个核苷酸。
67.根据权利要求62的方法，其中所述第二限制性缺刻酶是Nb.BsrDI或Nb.BtsI，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列位于双链部分的两条链中具有单链部分的那条链上，该识别序列的3'端的一个核苷酸位于单链部分上，识别序列的其它核苷酸位于双链部分上，识别序列的反链互补序列的部分序列位于双链部分并紧邻其5'末端，所述部分序列为除了该反链互补序列的5'端的最后一个核苷酸之外的其它核苷酸。
68.根据权利要求42‑61任一项的方法，其中所述方法在固定温度下进行，所述温度在
37‑75摄氏度之间。
69.根据权利要求68的方法，其中所述温度在45‑65摄氏度之间。
70.根据权利要求69的方法，其中所述温度是55摄氏度。
71.根据权利要求42‑61任一项的方法，其中所述方法在温度循环下进行；循环的最高温在50‑75摄氏度之间；循环的最低温在37‑55摄氏度之间；每个循环的时间是30秒‑20分钟。
72.根据权利要求71的方法，其中循环的最高温在55‑65摄氏度之间。
73.根据权利要求71的方法，其中循环的最低温在45‑55摄氏度之间。
74.根据权利要求71的方法，其中每个循环的时间是1分钟‑5分钟。
75.根据权利要求42‑61任一项的方法，其中所述方法在存在D‑海藻糖的条件下进行。
76.根据权利要求42‑61任一项的方法，其中所述第一限制性缺刻酶与所述第二限制性缺刻酶不同，且在所述双链目标DNA在产生单链区之前，使用所述第二限制性缺刻酶的甲基化酶对所述目标双链DNA进行甲基化。
77.根据权利要求76的方法，其中所述甲基化在体外进行，或在宿主细胞体内进行。
78.根据权利要求77的方法，其中所述甲基化在宿主细胞体内进行，所述目标双链DNA与编码所述甲基化酶的基因位于同一个DNA双链上，或者编码所述甲基化酶的基因位于宿主细胞染色体上，以使得宿主细胞表达所述甲基化酶。
79.根据权利要求76的方法，其中所述第二限制性缺刻酶是Nt.BstNBI或Nt.AlwI，所述甲基化酶是M.BstNBI和M.AlwI。
80.根据权利要求79的方法，其中所述第一限制性缺刻酶是Nt.BspQI或Nb.BbvCI或Nt.BbvCI。 说明书 : 操纵双链DNA末端的方法技术领域[0001] 本发明涉及核酸改造的方法，特别是操纵双链DNA末端的方法。背景技术[0002] 对不同来源的DNA进行切割并按照需求进行组合拼接是分子生物学最基本的操作之一。有两种方式可以将两个DNA片段拼接起来，一种是用连接酶将末端匹配的双链DNA连接起来，即连接酶法，这种方式拼接的DNA末端一般具有少于4个碱基的悬挂；另一种是用利用两段DNA片段之间的同源序列进行拼接，主要有聚合酶循环拼接法(PCA)、Gibson拼接法等，同源序列的长度一般是十几个碱基到几千个碱基之间。连接酶法原理简单、方法成熟，目前仍然是DNA拼接的主要方式，其被拼接的DNA通常由限制性内切酶水解产生。[0003] 限制性内切酶是一类能在DNA双链特定位置发生双链切割的酶，酶切结果通常是精确的、可预测的。限制性内切酶作为人类掌握的第一代基因编辑工具，至今仍发挥着无可替代的作用。多年来，不断地有新的限制性内切酶被发现，也不断有新的被工程改造的限制性内切酶被筛选出来。科研工作者在众多限制性内切酶之间可以选择的同时，其工具箱也被多种或经常使用、或偶尔使用、或根本用不到的限制性内切酶所填充。并为此花费大量经费，因为一种常用限制性内切酶的价格在几百元到几千元之间，而一个称得上趁手的工具箱，一般需要十几种到上百种的限制性内切酶。限制性内切酶的储存时间一般在几个月到两年之间，为此需要定期更新。[0004] 在这种一直追求丰富工具箱的道路上，也有人尝试获得一种通用的限制性内切酶。US4935357A提到了一种可以在单链DNA任意位置切割的酶切方式，其所用的限制性内切酶是IIS类型的，这是一类识别序列和切割位置并不重叠的限制性内切酶，比如FokI，其识别序列是GGATG，但切割位置是GGATG所在链的随后第九碱基与第十碱基之间以及另一条链上的随后第十三与第十四碱基之间(图1)，产生4个碱基的5’悬挂末端。在实际酶切中，FokI的识别序列与酶切位置并不需要位于同一段连续的双链上，比如图1中的正链，如果GGATG后面的碱基来自另一条单链，这条单链能够与反链的碱基产生杂交，FokI也能把这条单链切断，而且这条单链无需具备FokI识别序列。这时反链加上正链的前半部分就构成了一个适配体，只要调整反链上的碱基组成，这个适配体可用于任意单链的切割。这个方法的局限是，其作用底物是单链，酶切后的产物也是单链，并不能直接用于连接酶法的拼接。[0005] 限制性缺刻酶是一类与限制性内切酶相似的DNA内切酶，与限制性内切酶不同的是，其只切断其识别序列所在双链DNA的其中一条链，而不会对另一条链产生切割。因此如果不是两个识别序列靠得很近并且位于不同链上，限制性缺刻酶水解产生的DNA不会产生双链断裂的效果。发明内容[0006] 因此，本发明涉及以下技术方案：[0007] 本发明第一方面提供一种产生预定的双链DNA末端的方法，所述方法包括：[0008] 使用限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个或多个缺刻，以在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区；[0009] 使用具有所述限制性缺刻酶的识别位点的寡核苷酸适配体与所述单链区杂交，并结合使用同一个限制性缺刻酶在目标双链DNA的另一条链的预定位置产生切割，最终切断目标双链DNA，并在切割处产生预定的末端；[0010] 其中所述预定的末端是3′悬挂、平末端或5′悬挂；[0011] 其中所述限制性缺刻酶的识别序列与切割位置不重合；[0012] 其中所述寡核苷酸适配体是具有双链部分和单链部分的DNA分子，所述寡核苷酸适配体在双链部分包含所述限制性缺刻酶的识别位点，但缺少可被该限制性缺刻酶切割的序列，所述寡核苷酸适配体的单链部分能够与目标双链DNA的单链区杂交形成双链结构，该双链结构可被所述限制性缺刻酶识别，并使得目标双链DNA的另一条链的预定位置处于可以介由所述限制性缺刻酶对寡核苷酸适配体上的识别位点的识别而被所述限制性缺刻酶切割的位置。[0013] 在一些实施方案中，所述限制性缺刻酶是Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI或Nb.BtsI。[0014] 在一些实施方案中，所述目标双链DNA通过在待改造的双链DNA上添加含有限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段获得，所述双链DNA片段的添加位置使得所述限制性缺刻酶能够通过识别所添加的识别序列而在所述预定位置产生一个或多个缺刻。[0015] 在一些实施方案中，所述目标双链DNA为线性且在接近其一侧末端的位置上含有所述限制性缺刻酶的识别序列，所述目标双链DNA的一条链的预定位置与根据该识别序列确定的切割位点重合，使用限制性缺刻酶在该预定位置上产生切割，使得切割位点与该侧末端之间的包含识别序列的一段DNA单链从双链上解离，从而在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区。[0016] 在一些实施方案中，所述目标双链DNA通过在待改造的线性双链DNA的一端添加含有限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段获得，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据该识别序列确定的切割位点重合，利用限制性缺刻酶在该预定位置上产生切割后，从双链上解离的DNA单链是切割位点与所添加的双链DNA片段的游离末端之间的包含识别序列的DNA单链。[0017] 在一些实施方案中，所述目标双链DNA在同一条链上含有至少两个序列相同的识别序列，所述至少两个识别序列方向相同且它们之间的距离接近，所述目标双链DNA的一条链的预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，使用所述限制性缺刻酶在所述至少两个识别序列的切割位点上分别切割一次，使得所述至少两个切割位点之间的包含识别序列的DNA单链从双链上解离，从而在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区。[0018] 在一些实施方案中，所述目标双链通过在待改造的双链DNA上添加含有所述至少两个识别序列的双链DNA片段获得，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合。[0019] 在一些实施方案中，所述目标双链DNA分别在两条链上含有至少两个序列相同的识别序列的双链DNA片段，所述至少两个识别序列方向相反且它们之间的距离接近，目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述限制性缺刻酶在所述至少两个识别序列的切割位点上分别切割一次，使得两个切割位点之间的双链解离，从而在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区。[0020] 在一些实施方案中，所述目标双链通过在待改造的双链DNA上添加含有所述至少两个识别序列的双链DNA片段获得，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合。[0021] 在一些实施方案中，在添加到待改造的双链DNA上的双链DNA片段中，至少一个限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的末端，使得在添加所述双链DNA片段之后，所述限制性缺刻酶识别序列在其切割位点一侧紧邻待改造的双链DNA；[0022] 或者，在添加到待改造的双链DNA上的双链DNA片段中，至少一个限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的末端之间具有一个或更多个核苷酸，从而使得在添加所述双链DNA片段之后，所述限制性缺刻酶识别序列在其切割位点一侧与待改造的双链DNA之间具有所述的一个或更多个核苷酸。[0023] 在一些实施方案中，所述解离在30‑75摄氏度下进行，优选在45‑65摄氏度下进行，更优选在53‑63摄氏度下进行。[0024] 在一些实施方案中，在产生的单链区的长度是5‑50个碱基，优选是10‑30个碱基，更优选是15‑20个碱基。[0025] 在一些实施方案中，寡核苷酸适配体由两条寡核苷酸杂交形成，双链部分是两条寡核苷酸发生杂交的部分，单链部分是两条寡核苷酸中未参与杂交的部分，限制性缺刻酶识别位点位于双链部分；或者寡核苷酸适配体由一条可形成发夹结构的寡核苷酸组成，发夹的茎部包括相互杂交的双链部分和单链部分，限制性缺刻酶识别位点位于茎部的双链部分。[0026] 在一些实施方案中，所述寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，或者寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间具有1个、2个或更多个核苷酸。[0027] 在一些实施方案中，所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域位于其单链区上且与其双链区紧邻，或者所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域位于其单链区上且与其双链区之间相隔1个、2个或更多个核苷酸。[0028] 在一些实施方案中，所使用的限制性缺刻酶为Nt.AlwI或Nt.BstNBI，所述寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量是2，目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量为2，最终产生4个碱基的3’悬挂。[0029] 在一些实施方案中，所使用的寡核苷酸适配体为16种寡核苷酸适配体的混合物，所述16种寡核苷酸适配体的紧邻其双链部分的2个单链核苷酸不同，其它核苷酸均相同，所述紧邻其双链部分的2个单链核苷酸包括4种核苷酸在这两个位置上的所有排列组合。[0030] 在一些实施方案中，所述目标双链DNA上与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域包括该目标双链DNA的单链区和与该单链区相邻的部分双链区序列，所述与该单链区相邻的部分双链区序列被称为被入侵区；所述寡核苷酸适配体的单链部分包括能与目标双链DNA的单链区杂交的序列，在该序列与寡核苷酸适配体的双链部分之间还包括能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列，所述能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列被称为入侵区。[0031] 在一些实施方案中，入侵区的长度在1‑100碱基之间，优选在1‑30碱基之间，更优选在3‑20碱基之间。[0032] 在一些实施方案中，所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，大于入侵区的核苷酸数量，其中所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的3’一侧，最终产生3’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，再减去入侵区的核苷酸数量；[0033] 或者，其中所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，大于入侵区的核苷酸数量，其中所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的5’一侧，最终产生5’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，再减去入侵区的核苷酸数量。[0034] 在一些实施方案中，所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，等于入侵区的核苷酸数量，最终产生平末端。[0035] 在一些实施方案中，所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，小于入侵区的核苷酸数量，其中所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的3’一侧，最终产生5’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量得到的数量，被入侵区核苷酸数量减去后的差值；[0036] 或者，其中所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，小于入侵区的核苷酸数量，其中所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的5’一侧，最终产生3’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量得到的数量，被入侵区核苷酸数量减去后的差值。[0037] 在一些实施方案中，所述方法在固定温度下进行，所述温度在37‑75摄氏度之间，优选在45‑65摄氏度之间，更优选是55摄氏度。[0038] 在一些实施方案中，所述方法在温度循环下进行；循环的最高温在50‑75摄氏度之间，优选是55‑65度；循环的最低温在37‑55摄氏度之间，优选是45‑55度；每个循环的时间是30秒‑20分钟，优选是1分钟‑5分钟。[0039] 在一些实施方案中，所述方法在存在D‑海藻糖的条件下进行。[0040] 本发明的第三方面提供在目标单链DNA上任意预定位置产生切割的方法，所述方法包括：[0041] 使目标单链DNA的预定区域与寡核苷酸适配体的单链部分杂交，所述寡核苷酸适配体是具有双链部分和单链部分的DNA分子，其在双链部分包含限制性缺刻酶的识别位点，但缺少可被该限制性缺刻酶切割的序列，所述寡核苷酸适配体的单链部分能够与目标单链DNA的预定区域杂交形成双链结构，该双链结构可被所述限制性缺刻酶识别，并使得目标单链DNA的预定位置处于可以介由所述限制性缺刻酶对寡核苷酸适配体上的识别位点的识别而被所述限制性缺刻酶切割的位置；[0042] 使用所述限制性缺刻酶在所述目标单链的预定位置产生切割；[0043] 其中所述限制性缺刻酶的识别序列与切割位置不重合。[0044] 在一些实施方案中，所述限制性缺刻酶是Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI或Nb.BtsI。[0045] 在一些实施方案中，寡核苷酸适配体由两条寡核苷酸杂交形成，双链部分是两条寡核苷酸发生杂交的部分，单链部分是两条寡核苷酸中未参与杂交的部分，限制性缺刻酶识别位点位于双链部分；或者寡核苷酸适配体由一条可形成发夹结构的寡核苷酸组成，发夹的茎部是双链部分，开环部为单链部分，限制性缺刻酶识别位点位于茎部的双链部分。[0046] 在一些实施方案中，所述寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，或者寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间具有1个、2个或更多个核苷酸。[0047] 在一些实施方案中，所述目标单链DNA是DNA合成仪合成的寡核苷酸、带有f1复制子的质粒在phagemidrescue操作下获得的单链DNA、滚环复制中产生的单链DNA或双链DNA在变性条件下获得的单链DNA。[0048] 本发明的第二方面提供产生预定的双链DNA末端的方法，所述方法包括：[0049] 使用第一限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个或更多个缺刻，以在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区；[0050] 使用具有第二限制性缺刻酶的识别位点的寡核苷酸适配体与所述单链区杂交，并结合使用第二限制性缺刻酶在目标双链DNA的另一条链的预定位置产生切割，最终切断目标双链DNA，并在切割处产生预定的末端；[0051] 其中所述寡核苷酸适配体是具有双链部分和单链部分的DNA分子，所述寡核苷酸适配体包含所述第二限制性缺刻酶的识别位点，还包含所述第二限制性缺刻酶的切割位点的互补序列，但缺少可被第二限制性缺刻酶切割的序列，所述寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的单链区杂交并与所述寡核苷酸适配体的双链部分一起形成可被所述第二限制性缺刻酶识别并切割的双链结构，并使得目标双链DNA的另一条链的预定位置处于可以介由所述第二限制性缺刻酶对寡核苷酸适配体上的识别位点的识别而被所述限制性缺刻酶切割的位置；[0052] 所述第一限制性缺刻酶与所述第二限制性缺刻酶相同或不同。[0053] 在一些实施方案中，第一限制性缺刻酶是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶，或识别序列与切割位置重合的限制性缺刻酶；第二限制性缺刻酶是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶。[0054] 在一些实施方案中，第二限制性缺刻酶是Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI或Nb.BtsI。[0055] 在一些实施方案中，第一限制性缺刻酶是Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.BbvCI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI或Nb.BssSI。[0056] 在一些实施方案中，所述产生一段单链区是使用第一限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个缺刻或两个缺刻，使得一个缺刻与目标双链DNA的末端之间的DNA双链或者两个缺刻之间的双链DNA发生变性分离后产生单链区。[0057] 在一些实施方案中，所述两个缺刻位于目标双链DNA的同一条链上，或位于目标双链DNA的不同链上。[0058] 在一些实施方案中，所述解离在30‑75摄氏度下进行，优选在45‑65摄氏度下进行，更优选在53‑63摄氏度下进行。[0059] 在一些实施方案中，产生的单链区的长度是1‑100个碱基，优选是5‑50个碱基，更优选是10‑30个碱基，更优选是15‑20个碱基。[0060] 在一些实施方案中，所述寡核苷酸适配体包括双链部分和单链部分，寡核苷酸适配体包含第二限制性缺刻酶识别序列，但缺少可被第二限制性缺刻酶切割的序列，而仅有其互补序列，该互补序列构成所述寡核苷酸适配体的单链部分；寡核苷酸适配体的单链部分可与目标双链DNA的单链区杂交，杂交后由寡核苷酸适配体与目标双链DNA形成的结构可以被第二限制性缺刻酶识别并在目标双链DNA的单链区之中或其附近的预定位置发生切割。[0061] 在一些实施方案中，所述寡核苷酸适配体由两条寡核苷酸链杂交形成，双链部分是两条寡核苷酸发生杂交的部分，单链部分是两条寡核苷酸中未参与杂交的部分。[0062] 在一些实施方案中，所述寡核苷酸适配体由一条可形成发夹结构的寡核苷酸链组成，双链部分是发夹的茎部，单链部分是发夹的开环部分。[0063] 在一些实施方案中，所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域与所述寡核苷酸适配体的双链部分紧邻，并且所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域位于所述目标双链DNA的单链区上并与所述目标双链DNA的双链区之间紧邻或相隔1个、2个或更多个核苷酸。[0064] 在一些实施方案中，所述第二限制性缺刻酶是Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列位于双链部分，并且所述第二限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，或者寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间具有1个、2个或更多个核苷酸。[0065] 在一些实施方案中，所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.AlwI或Nt.BstNBI，所述寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量是2，目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量为2，最终产生4个碱基的3’悬挂；所使用的寡核苷酸适配体为16种寡核苷酸适配体的混合物，所述16种寡核苷酸适配体的紧邻其双链部分的2个单链核苷酸不同，其它核苷酸均相同，所述紧邻其双链部分的2个单链核苷酸包括4种核苷酸在这两个位置上的所有排列组合。[0066] 在一些实施方案中，所述第二限制性缺刻酶是Nb.BsrDI或Nb.BtsI，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列位于双链部分的两条链中具有单链部分的那条链上，该识别序列的3′端的一个核苷酸位于单链部分上，识别序列的其它核苷酸位于双链部分上，识别序列的反链互补序列的部分序列位于双链部分并紧邻其5′末端，所述部分序列为除了该反链互补序列的的5′端的最后一个核苷酸之外的其它核苷酸。[0067] 在一些实施方案中，所述目标双链DNA的另一条链与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域与所述寡核苷酸适配体的双链部分紧邻；并且所述目标双链DNA上与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域不仅包括该目标双链DNA的单链区，还包括与该单链区相邻的部分双链区序列，所述与该单链区相邻的部分双链区序列被称为被入侵区；所述寡核苷酸适配体的单链部分包括能与目标双链DNA的单链区杂交的序列，在该序列与寡核苷酸适配体的双链部分之间还包括能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列，所述能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列被称为入侵区。[0068] 在一些实施方案中，入侵区的长度在1‑100碱基之间，优选在1‑30碱基之间，更优选在3‑20碱基之间。[0069] 在一些实施方案中，所述第二限制性缺刻酶是Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列位于双链部分，并且所述第二限制性缺刻酶识别序列紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，或者寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间具有1个、2个或更多个核苷酸。[0070] 在一些实施方案中，所述第二限制性缺刻酶是Nb.BsrDI或Nb.BtsI，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列位于双链部分的两条链中具有单链部分的那条链上，该识别序列的3′端的一个核苷酸位于单链部分上，识别序列的其它核苷酸位于双链部分上，识别序列的反链互补序列的部分序列位于双链部分并紧邻其5′末端，所述部分序列为除了该反链互补序列的的5′端的最后一个核苷酸之外的其它核苷酸。[0071] 在一些实施方案中，所述方法在固定温度下进行，所述温度在37‑75摄氏度之间，优选在45‑65摄氏度之间，更优选是55摄氏度。[0072] 在一些实施方案中，所述方法在温度循环下进行；循环的最高温在50‑75摄氏度之间，优选是55‑65度；循环的最低温在37‑55摄氏度之间，优选是45‑55度；每个循环的时间是30秒‑20分钟，优选是1分钟‑5分钟。[0073] 在一些实施方案中，所述方法在存在D‑海藻糖的条件下进行。[0074] 在一些实施方案中，所述第一限制性缺刻酶与所述第二限制性缺刻酶不同，且在所述双链目标DNA在产生单链区之前，使用所述第二限制性缺刻酶的甲基化酶对所述目标双链DNA进行甲基化。[0075] 在一些实施方案中，所述甲基化在体外进行，或在宿主细胞体内进行。[0076] 在一些实施方案中，所述甲基化在宿主细胞体内进行，所述目标双链DNA与编码所述甲基化酶的基因位于同一个DNA双链上，或者编码所述甲基化酶的基因位于宿主细胞染色体上，以使得宿主细胞表达所述甲基化酶。[0077] 在一些实施方案中，所述第二限制性缺刻酶是Nt.BstNBI或Nt.AlwI，所述甲基化酶是M.BstNBI和M.AlwI。[0078] 在一些实施方案中，所述第一限制性缺刻酶是Nt.BspQI或Nb.BbvCI或Nt.BbvCI。[0079] 发明详述[0080] 有一类限制性缺刻酶的识别序列和切割位置之间也不重叠，比如Nt.AlwI、Nt.BstNBI等，与FokI类似，本发明首次发现，这些酶也允许识别序列与被切割序列位于不同的DNA分子上。利用这类限制性缺刻酶可以实现对双链DNA末端的自由操纵，在大多数情况下，只需一个限制性缺刻酶即可完成DNA的重组拼接操作，因而无需购置多种限制性内切酶，而且由于双链DNA末端悬挂的长度可定制，在长粘端模式下，可实现大片段DNA的组装。这种操纵双链DNA末端的方法的原理是通过两步切割法产生预定末端，第一步是利用限制性缺刻酶在双链DNA的一条链上先产生一个或多个缺刻，以在另一条链上产生一段单链区，第二步是利用寡核苷酸适配体与单链区的杂交，再结合同一个限制性缺刻酶在DNA双链的另一条链上产生切割，切割的位置与寡核苷酸适配体的序列选择相关，最终切断目的双链DNA，并在切割处产生长度可定制、悬挂种类可定制的末端。[0081] 在本发明中，如果没有特别说明，”另一条链”均是指双链DNA中产生单链区并在第二步中被切割的链。[0082] 本发明的第一方面提供了一种产生预定的双链DNA末端的方法，所述方法包括：[0083] 使用限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个或更多个缺刻，以在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区；[0084] 使用具有所述限制性缺刻酶的识别位点的寡核苷酸适配体与所述单链区杂交，并结合使用同一个限制性缺刻酶在目标双链DNA的另一条链的预定位置产生切割，最终切断目标双链DNA，并在切割处产生预定的末端；[0085] 其中所述寡核苷酸适配体是具有双链部分和单链部分的DNA分子，所述寡核苷酸适配体在双链部分包含所述限制性缺刻酶的识别位点，但缺少可被该限制性缺刻酶切割的序列，所述寡核苷酸适配体的单链部分能够与目标双链DNA的单链区杂交形成双链结构，该双链结构可被所述限制性缺刻酶识别，并使得目标双链DNA的另一条链的预定位置处于可以介由所述限制性缺刻酶对寡核苷酸适配体上的识别位点的识别而被所述限制性缺刻酶切割的位置。[0086] 本领域技术人员能够理解，在上述产生预定的双链DNA末端的方法中，所述“该双链结构可被所述限制性缺刻酶识别”是指当所述寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的单链区杂交后，该杂交区域与所述寡核苷酸适配体的双链部分一起形成可以被所述限制性缺刻酶识别并切割的双链结构，所述限制性缺刻酶识别所述寡核苷酸适配体的双链部分上的识别位点，并切割目标双链DNA的另一条链的预定位置。[0087] 本领域技术人员能够理解，目标双链DNA的单链区与寡核苷酸适配体的单链部分杂交形成的杂交区紧邻寡核苷酸适配体的双链部分，由此使得所述限制性缺刻酶识别所述寡核苷酸适配体的双链部分上的识别位点，并切割目标双链DNA的另一条链的预定位置。[0088] 被切割的目标双链DNA的另一条链的预定位置可以位于目标双链DNA的另一条链上的单链区，也可以位于目标双链DNA的另一条链上的双链区，可以通过对寡核苷酸适配体的设计而实现。[0089] 本发明所述的“预定末端”包括不同长度的3’悬挂、平末端或不同长度的5’悬挂。本发明中，术语“悬挂”是指在双链DNA末端存在的无配对的单链核苷酸，悬挂的长度即为这种无配对单链核苷酸的数量。3’悬挂是指悬挂碱基远离双链的那一端是3’端，其也可以被称为3’突出粘端。5’悬挂是指悬挂碱基远离双链的那一端是5’端，其也可以被称为5’突出粘端。通过本发明方法获得的3’悬挂或5’悬挂的长度可定制，其长度在0‑50碱基之间，优选是0‑20碱基，更优选是2‑10碱基。悬挂碱基可用于与其它双链DNA末端或单链DNA进行杂交或连接、或作为探针。[0090] 本发明中，“缺刻”或“切刻”是指仅切割双链DNA中的一条链，因此，在本发明中，“缺刻”与双链DNA中的一条链的“切割”可以互换使用，“切割位点”与“酶切位点”可以互换使用。所述“一个或更多个缺刻”可以指一个、两个、三个、四个或更多个缺刻。限制性缺刻酶也可以被称为限制性切刻酶、缺刻内切酶或切刻内切酶，是指能够识别特定的序列，并在识别序列附近确定的位置只切割双链DNA中的一条链的DNA内切酶。优选的限制性缺刻酶是指识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶，例如识别序列与切割位置紧邻，或者识别序列与切割位置之间相隔1个、2个、3个、4个、5个或更多个核苷酸的限制性缺刻酶，包括但不限于：Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI，优选是Nt.BstNBI和Nt.AlwI，更优选是Nt.BstNBI。这些限制性缺刻酶的识别序列及其切割位点是本领域技术人员所熟知的，例如Nt.BstNBI识别5’‑GAGTC‑3’并切割GAGTC后面的第4个和第5个碱基之间的位置，Nt.AlwI识别5’‑GGATC‑3’并切割GGATC后面的第4个和第5个碱基之间的位置，Nt.BsmAI识别5’‑GTCTC‑3’并切割GTCTC后面的第1个和第2个碱基之间的位置，Nt.BspQI识别5’‑GCTCTTC‑3’并切割GCTCTTC后面的第1个和第2个碱基之间的位置，Nb.BsrDI识别3’‑CGTTAC‑5’并切割3’‑CGTTAC‑5’的5’端紧邻该识别序列的位置，Nb.BtsI识别3’‑CGTCAC‑5’并切割3’‑CGTCAC‑5’的5’端紧邻该识别序列的位置。如本领域技术人员所知，关于Nb.BtsI和Nb.BsrDI的识别序列，也可以被描述为Nb.BtsI识别5’‑GCAGTG‑3’并切割该识别序列的反链互补序列3’‑CGTTAC‑5’的5’端紧邻该互补序列的位置，Nb.BsrDI识别5’‑GCAATG‑5’并切割该识别序列的反链互补序列3’‑CGTCAC‑5’的5’端紧邻该互补序列的位置。本发明所使用的限制性缺刻酶，当其识别序列与切割位置不重合时，其识别序列与酶切位置不需要位于同一段连续的双链上，酶切位置可以位于另一个DNA分子的单链上，只要所述另一个DNA分子的单链可与酶切位置的互补链杂交。本发明中，“识别序列”或“限制性缺刻酶的识别序列”是指限制性缺刻酶能够识别，并在其附近确定的位置切割双链DNA中的一条链的的特定序列。在某些情况下，当提及某一条链上的识别序列时，该识别序列可以指与切割位点在同一条链上的可被限制性缺刻酶识别的序列。识别序列与切割位置之间的核苷酸数目在本发明中被称为该限制性缺刻酶的特征核苷酸数目。[0091] 本发明中，目标双链DNA可以指含有限制性缺刻酶的识别位点并可以被所述限制性缺刻酶在其一条链的预定位置产生一个或多个缺刻的双链DNA，或者这样的目标双链DNA被限制性缺刻酶切割后产生的具有单链区的双链DNA。当需要对一些双链DNA进行改造以使其具有预定末端时，这些双链DNA并不一定具有限制性缺刻酶的识别位点，不一定可以直接作为所述目标双链DNA使用。因此，在一些实施方案中，在待改造的双链DNA上添加含有限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA，由该识别序列确定的切割位点位于待改造的双链DNA上，所述双链DNA片段的添加位置使得所述限制性缺刻酶能够通过识别所添加的识别序列而在目标DNA双链的一条链的预定位置产生一个或多个缺刻，并由此在另一条链上产生单链区。[0092] 本发明中，待改造的双链DNA是指需要对其进行改造以获得预定末端的双链DNA。待改造的双链DNA可以是需要被拼接的双链DNA，由于进行拼接时，特别是进行无缝拼接时需要双链DNA具有特定的末端，因此需要在这些双链DNA上产生特定末端。待改造的双链DNA可以是通过任何方法获得的线性或环状双链DNA，例如通过PCR获得的线性双链DNA，或是载体双链DNA，如质粒。[0093] 如果待改造的双链DNA序列恰好在合适的位置上具有所述限制性缺刻酶的识别位点，可以直接以待改造的双链DNA作为目标双链DNA。但由于限制性缺刻酶识别位点在随机双链DNA上的出现概率很小，因此在大部分情况下，通过在待改造的双链DNA上添加含有限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA。通过添加含有限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，可以实现在待改造双链DNA的任何预定位置产生缺刻，而不受待改造双链DNA中原有识别序列的限制。[0094] 在一些实施方案中，可以通过一次切割产生单链区，即利用限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个缺刻，该缺刻接近目标双链DNA的一侧末端，使得该缺刻与该侧末端之间的一段DNA单链从双链上解离，从而在另一条链上产生单链区。解离是在适当温度下发生的，在该适当温度下，该缺刻与该末端之间的DNA双链发生变性分离。这种方式在本发明中被称为单切法，可以适用于待改造的双链DNA为线性的情况，例如PCR产物等。在一些特定的实施方案中，目标双链DNA在接近其一侧末端的位置上含有所述限制性缺刻酶的识别序列，目标双链DNA上的所述预定位置与根据该识别序列确定的切割位点重合，这种情况下，切割位点与该侧末端也是接近的，利用限制性缺刻酶在该预定位置上产生切割，使得切割位点与该侧末端之间的包含识别序列的一段DNA单链从双链上解离，产生包含识别序列的一段单链DNA片段，和具有双链区和单链区的双链DNA。具体而言，当限制性缺刻酶的切割位点在识别序列的3′侧时，所产生的具有双链区和单链区的双链DNA具有突出的3′端，即单链区的方向是从紧邻双链区的核苷酸向远离双链区的核苷酸为5′至3′；当限制性缺刻酶的切割位点在识别序列的5′侧时，所产生的具有双链区和单链区的双链DNA具有突出的5′端，即单链区的方向是从紧邻双链区的核苷酸向远离双链区的核苷酸为3′至5′。在一些优选的实施方案中，可以在待改造的双链DNA的一端添加含有限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据该识别序列确定的切割位点重合，利用限制性缺刻酶在该预定位置上产生切割，切割位点与所添加的双链DNA片段的游离末端之间的包含识别序列的一段DNA单链从双链上解离，产生包含识别序列的一段单链DNA片段，和具有双链区和单链区的双链DNA。本领域技术人员可以能够理解所述“接近”的含义，其是指缺刻与某个末端的距离相比于该缺刻与另一个末端之间的距离更近，且该距离的绝对长度也足够小，以使得该缺刻与该末端之间的DNA单链可以从双链上解离。所述的“接近”可以指缺刻与末端的距离为5‑50个碱基，优选是10‑30个碱基，更优选是12‑20个碱基，这个距离也是目标双链DNA的单链区的长度。在所述单切法中，虽然是通过一次切割在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个缺刻以产生单链区，但应当理解，可以在目标双链DNA的一条链上产生更多个缺刻，其中一个缺刻在预定位置上。这在希望产生较长单链区时可以促进酶切速度、提高切割效率。多个缺刻可以使得目标双链DNA的一侧末端与距离改侧末端最远的缺刻之间的DNA单链全部解离，这可以产生比单个缺刻更长的单链区。[0095] 在一些实施方案中，可以通过两次切割产生单链区，即利用限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链上分别产生两个缺刻，这两个缺刻之间的距离接近，使得这两个缺刻之间的一段DNA单链从双链上解离，从而在另一条链上产生单链区。解离是在适当温度下发生的，在该适当温度下，这两个缺刻之间的DNA双链发生变性分离。所述的两个缺刻可以是在同一条链上，或者分别位于双链DNA的两条链上。[0096] 在一些特定的实施方案中，目标双链DNA中可以在同一条链上含有两个序列相同的识别序列，这两个识别序列方向相同且它们之间的距离接近，目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述限制性缺刻酶在这两个识别序列的切割位点上分别切割一次，共切割两次，使得两个切割位点之间的包含识别序列的一段DNA单链从双链上解离，产生包含一个识别序列的一段单链DNA片段，和具有双链区和单链区的双链DNA，这称为同向双切法。在一些优选的实施方案中，可以在待改造的双链DNA上添加含有这样两个序列相同、方向相同、且距离接近的识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述限制性缺刻酶在这两个识别序列的切割位点上分别切割一次，共切割两次，使得两个切割位点之间的包含识别序列的一段DNA单链从双链上解离，产生包含一个识别序列的一段单链DNA片段，和具有双链区和单链区的双链DNA。[0097] 在另一些特定的实施方案中，目标双链DNA中可以分别在两条链上含有两个序列相同的识别序列的双链DNA片段，这两个识别序列方向相反且它们之间的距离接近，目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述限制性缺刻酶在这两个识别序列的切割位点上分别切割一次，共切割两次，使得两个切割位点之间的双链解离，产生两个单链区，这称为背向双切法。在一些优选的实施方案中，可以在待改造的双链DNA上添加含有这样两个序列相同、方向相反、且距离比较近的识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述限制性缺刻酶在这两个识别序列的切割位点上分别切割一次，共切割两次，使得两个切割位点之间的双链上解离，产生两个单链区。[0098] 上述通过两次切割产生单链区的方式，如同向双切法和背向双切法可以适用于环状双链DNA，例如双链DNA载体，如质粒等。其中所述的“接近”是指两个缺刻的距离为5‑50个碱基，优选是10‑30个碱基，更优选是12‑20个碱基，这个距离也是目标双链DNA的单链区的长度。[0099] 应当理解，上述通过两次切割产生单链区的方式，如同向双切法和背向双切法，虽然是通过两次切割产生单链区，但应当理解，可以在目标双链DNA的一条链上产生更多个缺刻或切割，其中一个缺刻在预定位置上(同向双切法)或其中两个缺刻在预定位置上(背向双切法)。这在希望产生较长单链区时可以促进酶切速度、提高切割效率。多个缺刻可以使得相距最远的两个缺刻之间的DNA单链全部解离，这可以产生比单个缺刻更长的单链区。[0100] 上述方法中，“适当的温度”是指能产生所述的单链区，又能保证所述限制性缺刻酶活性的温度，通常指37‑75摄氏度，优选是45‑65摄氏度，更优选是53‑63摄氏度。[0101] 在一些实施方案中，在添加到待改造的双链DNA上的双链DNA片段中，至少一个限制性缺刻酶识别序列(在背向双切法中可以是两个限制性缺刻酶识别序列)紧邻其切割位点一侧的末端，使得在添加所述双链DNA片段之后，所述限制性缺刻酶识别序列在其切割位点一侧紧邻待改造的双链DNA。在另一些实施方案中，在添加到待改造的双链DNA上的双链DNA片段中，至少一个限制性缺刻酶识别序列(在背向双切法中可以是两个限制性缺刻酶识别序列)与其切割位点一侧的末端之间可以具有一个或更多个核苷酸，从而使得在添加所述双链DNA片段之后，所述限制性缺刻酶识别序列在其切割位点一侧与待改造的双链DNA之间具有所述的一个或更多个核苷酸，这种方式可以使最终产生的预定末端含有待改造的双链DNA中原本没有的核苷酸，即在形成预定末端的同时向待改造的双链DNA中添加一个或更多个末端核苷酸，例如可以通过这种方式给目标双链DNA加上额外的核苷酸悬挂。[0102] 本发明中所述的限制性缺刻酶识别序列的切割位点一侧是指当限制性缺刻酶识别该识别序列并在附近确定的位置进行切割时，该确定的位置相对于所述识别序列而言的这一侧。[0103] 本发明的寡核苷酸适配体用于提供限制性缺刻酶的识别序列，和能与目标双链DNA的单链区杂交的序列，通过杂交将目标双链DNA的另一条链的部分核苷酸定位在寡核苷酸适配体上的识别位序列的切割位点附近，通过寡核苷酸适配体和限制性缺刻酶在目标双链DNA的另一条链的预定位置处进行切割。寡核苷酸适配体在双链部分包含限制性缺刻酶识别序列，但在限制性缺刻酶识别序列的切割位点一侧缺少可被限制性缺刻酶切割的序列，而仅有其互补序列，该互补序列构成所述寡核苷酸适配体的单链部分，限制性缺刻酶识别序列切割位点一侧的双链部分的末端即为双链部分和单链部分的分界点。寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链的单链区杂交后形成双链结构，使得目标双链DNA的另一条链上的核苷酸靠近所述识别序列，并使得该另一条链上的预定位置恰好位于所述识别序列一侧的切割位点的位置，由此能够使得所述限制性缺刻酶通过识别寡核苷酸适配体上的识别序列而在所述目标双链DNA的另一条链的预定位置上进行切割。基于相同的原理，本发明的寡核苷酸适配体还可以用于切割单链DNA，此时，寡核苷酸适配体用于提供限制性缺刻酶的识别序列，和能与单链DNA的预定区域杂交的序列，通过杂交将单链DNA的预定区域定位在寡核苷酸适配体上的识别位序列的切割位点附近，通过寡核苷酸适配体和限制性缺刻酶在单链DNA的预定区域上的预定位置处进行切割。寡核苷酸适配体在双链部分包含限制性缺刻酶识别序列，但在限制性缺刻酶识别序列的切割位点一侧缺少可被限制性缺刻酶切割的序列，而仅有其互补序列，该互补序列构成所述寡核苷酸适配体的单链部分，限制性缺刻酶识别序列切割位点一侧的双链末端即为双链部分和单链部分的分界点。寡核苷酸适配体的单链部分与单链DNA的预定区域杂交后形成双链结构，使得单链DNA的预定区域靠近所述识别序列，并使得该预定区域上的预定位置恰好位于所述识别序列一侧的切割位点的位置，由此能够使得所述限制性缺刻酶通过识别寡核苷酸适配体上的识别序列而在所述单链DNA的预定位置上进行切割。这种利用寡核苷酸适配体配合限制性缺刻酶对目标双链DNA或单链DNA的酶切被称为辅助酶切。[0104] 当寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的单链区杂交或与单链DNA的预定区域杂交时，杂交区域从寡核苷酸适配体中紧邻双链部分的第一个单链核苷酸开始向远离双链部分的方向延伸。寡核苷酸适配体的双链部分的长度可以在6‑30个碱基之间，优选是10‑15个碱基，其单链部分的长度可以是5‑50个碱基，优选是10‑30个碱基，更优选是15‑20个碱基。寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的另一条链或与单链DNA的杂交区域的长度可以大于、等于或小于其单链部分的长度，例如可以是5‑100个碱基，优选是10‑80个碱基，更优选是15‑70个碱基。[0105] 在本发明的辅助酶切方法中，寡核苷酸适配体中单链部分和目标双链DNA的单链区可以具有不同的方向。寡核苷酸适配体中单链部分的方向与目标双链DNA的单链区的方向取决于所使用的限制性缺刻酶。如果所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的3’一侧，相应的寡核苷酸适配体的单链部分的方向是从紧邻双链部分的核苷酸向远离双链部分的核苷酸为3’至5’，相应的目标双链DNA的单链区的方向是从紧邻双链区的核苷酸向远离双链区的核苷酸为5’至3’。如果所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的5’一侧，相应的寡核苷酸适配体的单链部分的方向是从紧邻双链部分的核苷酸向远离双链部分的核苷酸为5’至3’，相应的目标双链DNA的单链区的方向是从紧邻双链区的核苷酸向远离双链区的核苷酸为3’至5’。换言之，当寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的单链区杂交时，寡核苷酸适配体的单链部分中靠近寡核苷酸适配体的双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中靠近目标双链DNA的双链区的部分杂交，寡核苷酸适配体的单链部分中远离寡核苷酸适配体的双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中远离目标双链DNA的双链区的部分杂交。[0106] 根据上述描述，本领域技术人员可以清楚理解，当利用限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链上进行两次或更多次切割，使得两个切割位点之间的包含识别序列的一段DNA单链从双链上解离，产生包含一个识别序列的一段单链DNA片段，和具有双链区和单链区的双链DNA时，例如当通过同向双切法产生具有双链区和单链区的双链DNA时，该具有双链区和单链区的双链DNA具有一个单链区和分别位于单链区两端的两个双链区。这两个双链区中有且只有一个双链区符合“当寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的单链区杂交时，寡核苷酸适配体的单链部分中靠近寡核苷酸适配体的双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中靠近目标双链DNA的双链区的部分杂交，寡核苷酸适配体的单链部分中远离寡核苷酸适配体的双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中远离目标双链DNA的双链区的部分杂交”中所说的“目标双链DNA的双链区”，符合该描述的双链区紧邻的末端即为下一步骤希望操纵的末端，换言之，最终产生的预定的末端是从符合该描述的双链区延伸出的末端。具体而言，当所使用的限制性缺刻酶的切割位置在识别序列的3′侧时，符合该描述的双链区是紧邻单链区的5′侧的双链区，或者说与解离下来的DNA单链的3′侧紧邻的双链区；当所使用的限制性缺刻酶的切割位置在识别序列的5′侧时，符合该描述的双链区是紧邻单链区的3′侧的双链区，或者说与解离下来的DNA单链的5′侧紧邻的双链区。因此，下文中，当提及目标双链DNA的双链区时，除非另外说明，对于通过限制性缺刻酶对目标目标双链DNA的两次或更多次切割产生的具有一个单链区和分别位于单链区两端的两个双链区的双链DNA而言，均是指本段落中所述的符合“当寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的单链区杂交时，寡核苷酸适配体的单链部分中靠近寡核苷酸适配体的双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中靠近目标双链DNA的双链区的部分杂交，寡核苷酸适配体的单链部分中远离寡核苷酸适配体的双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中远离目标双链DNA的双链区的部分杂交”描述的双链区。[0107] 在一些实施方案中，寡核苷酸适配体可以由两条寡核苷酸杂交形成，双链部分是两条寡核苷酸发生杂交的部分，单链部分是两条寡核苷酸中未参与杂交的部分，限制性缺刻酶识别位点位于双链部分。在另一些实施方案中，寡核苷酸适配体还可以由一条可形成发夹结构的寡核苷酸组成，发夹的茎部包括相互杂交的双链部分和单链部分(或者也可以说发夹的茎部是双链部分，开环部是单链部分)，限制性缺刻酶识别位点位于茎部的双链部分。[0108] 在一些实施方案中，所述寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列可以紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，利用这种寡核苷酸适配体进行的辅助酶切在本发明中被称为紧邻模式。在另一些实施方案中，寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间可以具有1个核苷酸，利用这种寡核苷酸适配体进行的辅助酶切在本发明中被称为间1模式。在另一些实施方案中，寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间可以具有2个核苷酸，利用这种寡核苷酸适配体进行的辅助酶切在本发明中被称为间2模式。在另一些实施方案中，寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间可以具有3个核苷酸，利用这种寡核苷酸适配体进行的辅助酶切在本发明中被称为间3模式。本发明中，寡核苷酸适配体与限制性缺刻酶配套使用，寡核苷酸适配体上包括所述限制性缺刻酶的识别位点，同时，该限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间的核苷酸数量应当少于所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目。因此，在另一些实施方案中，如果所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目大于4，寡核苷酸寡核苷酸适配体中的限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间也可以具有多于3个核苷酸。[0109] 可以通过寡核苷酸适配体的设计使得限制性缺刻酶在预定位置切割目标双链DNA的另一条链或单链DNA。当切割目标双链DNA时，目标双链DNA的另一条链上被切割的位置由多个因素共同确定，其中一个因素是所使用的特定限制性缺刻酶的特征核苷酸数目，另一个因素是寡核苷酸适配体中识别序列与切割位点一侧的双链部分的末端之间的核苷酸数量，再一个因素是目标双链DNA的另一条链的杂交开始碱基在该另一条链中的位置。所述杂交开始碱基是指目标双链DNA的另一条链的杂交区(即与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的序列)中，紧邻寡核苷酸适配体双链部分的核苷酸。限制性缺刻酶切割的位置是从目标双链DNA的杂交开始碱基起沿着识别序列至切割位点方向的特定数量的核苷酸之后，该特定数量为所使用的特定限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间的碱基数量。当切割目标单链DNA时，决定目标单链DNA上被切割位置的因素包括：(1)所使用的特定限制性缺刻酶的特征核苷酸数目；(2)寡核苷酸适配体中识别序列与切割位点一侧的双链部分的末端之间的核苷酸数量；目标单链DNA的杂交开始碱基在该单链DNA中的位置。这里所说的目标单链DNA的杂交开始碱基是指目标单链DNA的杂交区(即与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的序列)中，紧邻寡核苷酸适配体双链部分的核苷酸。限制性缺刻酶切割的位置是从目标单链DNA的杂交开始碱基起沿着识别序列至切割位点方向的特定数量的核苷酸之后，该特定数量为所使用的特定限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间的碱基数量。[0110] 通过辅助酶切模式，可以在目标双链DNA的另一条链上的不同预定位置进行切割，以产生所需末端，切割位置可以位于目标双链DNA的单链区上，也可以位于目标双链DNA的双链区上。[0111] 在一些实施方案中，目标双链DNA的另一条链的杂交区(即目标双链DNA上与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域)位于单链区上且与其双链区紧邻。在另一些实施方案中，目标双链DNA的杂交区位于单链区上且与双链区之间相隔1个或更多个核苷酸，例如1个、2个或3个核苷酸，此时利用寡核苷酸适配体进行辅助酶切可以获得不同长度的5’悬挂或3’悬挂，悬挂的碱基数为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧末端之间的核苷酸数量，再加上目标双链DNA的杂交区与双链区之间的核苷酸数量。产生5’悬挂还是3’悬挂取决于所使用的限制性缺刻酶以及相应的寡核苷酸适配体，如果所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的3’一侧，产生3’悬挂；如果所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的5’一侧，则产生5’悬挂。由上述原理可知，通过该原理所产生的3′悬挂或5′悬挂的长度最长不能超过在目标双链DNA上产生的单链区的长度，因此，如果希望产生较长的悬挂，则应在目标双链DNA上产生较长的单链区。[0112] 在一些特定的实施方案中，所使用的限制性缺刻酶为Nt.AlwI或Nt.BstNBI，这两种酶的特征核苷酸数目都是4，且切割位点都在其识别序列的3’一侧。如果寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量是m，目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量为n，则产生的3’悬挂的碱基数是4‑m+n，前提是m小于4。例如，当m＝2时，如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生2个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1，则产生3个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为2，则产生4个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为3或更多，则产生5个碱基或更多个碱基的3’悬挂，但在这种情况下，3’悬挂的序列从5’至3’的第5个碱基开始为所述限制性缺刻酶的识别序列，这是由目标双链DNA的单链区产生办法决定的。再例如，当m＝0时，如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生4个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1或更多，则产生5个碱基或更多个碱基的3’悬挂，同样地，在这种情况下，3’悬挂的序列从5’至3’的第5个碱基开始为所述限制性缺刻酶的识别序列。再例如，当m＝1时，如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生3个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1，则产生4个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为2或更多，则产生5个碱基或更多个碱基的3’悬挂，同样地，在这种情况下，3’悬挂的序列从5’至3’的第5个碱基开始为所述限制性缺刻酶的识别序列。例如，当m＝3时，如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生1个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1，则产生2个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为2，则产生3个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为3，则产生4个碱基的3’悬挂如；果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为4或更多，则产生5个碱基或更多个碱基的3’悬挂，同样，在这种情况下，3’悬挂的序列从5’至3’的第5个碱基开始为所述限制性缺刻酶的识别序列。[0113] 在所使用的限制性缺刻酶为Nt.AlwI或Nt.BstNBI的情况下，当m＝2，n＝2时，寡核苷酸适配体中需要与最终产生的3’悬挂中的核苷酸杂交的核苷酸仅有2个，即从寡核苷酸适配体紧邻双链部分的第一个单链核苷酸开始的2个核苷酸，因此，除了这几个寡核苷酸之外，寡核苷酸适配体上的其他核酸都是可人为选定的，只要其能实现寡核苷酸适配体的功能即可。例如，寡核苷酸适配体的双链部分只要包括限制性缺刻酶识别位点即可，其他序列可任选，而寡核苷酸适配体的单链部分中，除了所述的2个核苷酸之外，其他核苷酸需要能与目标双链DNA的单链区的相应部分杂交，而目标双链DNA的单链区的这一部分可以是人为添加在待改造双链DNA上的，因而其序列也可以任选(除了其中所包含的限制性缺刻酶识别序列的互补序列之外)。因此，在所使用的限制性缺刻酶相同的情况下，可以将寡核苷酸适配体中除了所述2个核苷酸之外的其他核苷酸固定(这意味着目标双链DNA上添加的含有限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段的序列也是固定的)，根据所述2个核苷酸的所有排列组合，制备16种寡核苷酸适配体，其中每种寡核苷酸适配体包含所述2个核苷酸的一种排列组合，16种寡核苷酸适配体包含所述2个核苷酸的全部16种排列组合。这些寡核苷酸适配体的混合物可以作为通用寡核苷酸适配体，适用于n＝2的各种不同的目标双链DNA的辅助酶切。[0114] 在另一些特定的实施方案中，目标双链DNA上与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域不仅包括该目标双链DNA的单链区，还包括与该单链区相邻的部分双链区序列，换言之，目标双链DNA的杂交起始碱基位于目标双链DNA的双链上。在这种情况下，寡核苷酸适配体的单链部分不仅包括能与目标双链DNA的单链区杂交的序列，在该序列与寡核苷酸适配体的双链部分之间还包括能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列。这种辅助酶切方式在本发明中被称为入侵式辅助酶切，在寡核苷酸适配体的单链部分中，能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列被称为“入侵区”，这段与单链区相邻的双链区序列被称为“被入侵区”，被入侵区原本是双链，在寡核苷酸适配体与目标双链DNA杂交的过程中，被入侵区的序列有可能发生双链解离，并与入侵区杂交。入侵区一端与寡核苷酸适配体的双链部分紧邻，一端与寡核苷酸适配体的单链部分中能与目标双链DNA的单链区杂交的序列紧邻。入侵区和被入侵区的长度可以在1‑100碱基之间，优选是1‑30碱基之间，更优选是3‑20碱基之间。[0115] 利用寡核苷酸适配体进行入侵式辅助酶切可以获得不同长度的3’悬挂、平末端或不同长度的5’悬挂。当所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，大于入侵区的核苷酸数量时，产生5’或3’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，再减去入侵区的核苷酸数量。在这种情况下，产生5’悬挂还是3’悬挂取决于所使用的限制性缺刻酶以及相应的寡核苷酸适配体，如果所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的3’一侧，产生3’悬挂；如果所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的5’一侧，则产生5’悬挂。[0116] 当所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，等于入侵区的核苷酸数量时，产生平末端。在这种情况下，无论所使用的限制性缺刻酶的切割位点是在其识别序列的3’一侧，还是在其识别序列的5’一侧，都产生平末端。[0117] 当所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，小于入侵区的核苷酸数量时，产生5’悬挂或3’悬挂，悬挂的长度为所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量得到的数量，被入侵区核苷酸数量减去后的差值。在这种情况下，产生5’悬挂还是3’悬挂取决于所使用的限制性缺刻酶以及相应的寡核苷酸适配体，如果所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的3’一侧，产生5’悬挂；如果所使用的限制性缺刻酶的切割位点在其识别序列的5’一侧，则产生3’悬挂。[0118] 在一些特定的实施方案中，所使用的限制性缺刻酶为Nt.AlwI或Nt.BstNBI，这两种酶的特征核苷酸数目都是4，且其切割位点均在识别序列的3’一侧。如果寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量是m，入侵区核苷酸数量为i，则当4‑m＞i时，产生3’悬挂，3’悬挂的长度为4‑m‑i；当4‑m＝i时，产生平末端；当4‑m＜i时，产生5’悬挂，3’悬挂的长度为i‑(4‑m)。例如，在m＝2的情况下，如果i＝0，产生2个碱基的3’悬挂；如果i＝1，产生1个碱基的3’悬挂；如果i＝2，产生平末端；如果i＞2，产生长度为i‑2的5’悬挂。[0119] 本发明人进一步发现，各种限制性切割酶都允许识别序列与被切割序列位于不同的DNA分子上，因此，利用各类限制性缺刻酶和相应寡核苷酸适配体都可以实现对双链DNA末端的操纵。第一步是利用限制性缺刻酶在双链DNA的一条链上先产生一个或多个缺刻，以在另一条链上产生一段单链区，第二步是利用寡核苷酸适配体与单链区的杂交，再结合同一个或不同的限制性缺刻酶在DNA双链的另一条链上产生切割，切割的位置与寡核苷酸适配体的序列选择相关，最终切断目的双链DNA，并在切割处产生长度可定制、悬挂种类可定制的末端。用于产生单链区的限制性缺刻酶在本发明中可被称为第一限制性缺刻酶，用于切割另一条链的限制性缺刻酶在本发明中可被称为第二限制性缺刻酶，第一限制性缺刻酶和第二限制性缺刻酶可以是相同的或不同的。[0120] 因此，本发明的第二方面提供一种产生预定的双链DNA末端的方法，所述方法使用不同的限制性缺刻酶，一种限制性缺刻酶用于在目标双链DNA上产生单链区，另一种限制性缺刻酶用于在寡核苷酸适配体存在的条件下切割目标双链DNA的另一条链，以产生预定的末端。[0121] 所述产生预定的双链DNA末端的方法包括：[0122] 使用第一限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个或更多个缺刻，以在目标双链DNA的另一条链上产生一段单链区；[0123] 使用具有第二限制性缺刻酶的识别位点的寡核苷酸适配体与所述单链区杂交，并结合使用第二限制性缺刻酶在目标双链DNA的另一条链的预定位置产生切割，最终切断目标双链DNA，并在切割处产生预定的末端；[0124] 其中所述寡核苷酸适配体是具有双链部分和单链部分的DNA分子，所述寡核苷酸适配体包含所述第二限制性缺刻酶的识别位点，还包含所述第二限制性缺刻酶的切割位点的互补序列，但缺少可被第二限制性缺刻酶切割的序列，所述寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的单链区杂交并与所述寡核苷酸适配体的双链部分一起形成可被所述第二限制性缺刻酶识别并切割的双链结构，并使得目标双链DNA的另一条链的预定位置处于可以介由所述第二限制性缺刻酶对寡核苷酸适配体上的识别位点的识别而被所述限制性缺刻酶切割的位置；[0125] 所述第一限制性缺刻酶与所述第二限制性缺刻酶相同或不同。[0126] 所述“切割位点的互补序列”是指该序列与包含完整切割位点的序列互补。[0127] 本领域技术人员能够理解，目标双链DNA的单链区与寡核苷酸适配体的单链部分杂交形成的杂交区紧邻寡核苷酸适配体的双链部分，由此使得所述限制性缺刻酶识别所述寡核苷酸适配体的双链部分上的识别位点，并切割目标双链DNA的另一条链的预定位置。[0128] 被切割的目标双链DNA的另一条链的预定位置可以位于目标双链DNA的另一条链上的单链区，也可以位于目标双链DNA的另一条链上的双链区，可以通过对寡核苷酸适配体的设计而实现。[0129] 本发明的第二方面所提供的方法中，除非另有说明，各术语的定义和说明与前述第一方面所提供的方法中的相同术语是相同的。[0130] 在本发明的第二方面所提供的方法中，所述的“预定末端”包括不同长度的3’悬挂、平末端或不同长度的5’悬挂。本发明中，术语“悬挂”是指在双链DNA末端存在的无配对的单链核苷酸，悬挂的长度即为这种无配对单链核苷酸的数量。3’悬挂是指悬挂碱基远离双链的那一端是3’端，其也可以被称为3’突出粘端。5’悬挂是指悬挂碱基远离双链的那一端是5’端，其也可以被称为5’突出粘端。通过本发明方法获得的3’悬挂或5’悬挂的长度可定制，其长度在0‑50碱基之间，优选是0‑20碱基，更优选是2‑10碱基。悬挂碱基可用于与其它双链DNA末端或单链DNA进行杂交或连接、或作为探针。[0131] 在本发明的第二方面所提供的方法中，“缺刻”或“切刻”是指仅切割双链DNA中的一条链，因此，在本发明中，“缺刻”与双链DNA中的一条链的“切割”可以互换使用，“切割位点”、“切割位置”、“酶切位点”和“酶切位置”可以互换使用。所述“一个或更多个缺刻”可以指一个、两个、三个、四个或更多个缺刻。限制性缺刻酶也可以被称为限制性切刻酶、缺刻内切酶或切刻内切酶，是指能够识别特定的序列，并在识别序列附近确定的位置只切割双链DNA中的一条链的DNA内切酶。[0132] 关于限制性缺刻酶[0133] 第一限制性缺刻酶可以是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶，也可以是识别序列与切割位置重合的限制性缺刻酶；第二限制性缺刻酶优选是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶。[0134] 第一限制性缺刻酶和第二限制性缺刻酶可以相同，也可以不同，例如，在一些实施方案中，第一限制性缺刻酶与第二限制性缺刻酶是同一种识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶；在另一些实施方案中，第一限制性缺刻酶与第二限制性缺刻酶都是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶，但不相同；在另一些实施方案中，第一限制性缺刻酶是识别序列与切割位置重合的限制性缺刻酶中的任何一种，第二限制性缺刻酶是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶中的任何一种。[0135] 所述识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶，可以是识别序列本身与切割位置不重合的限制性缺刻酶，例如识别序列本身与切割位置紧邻，或者识别序列本身与切割位置之间相隔1个、2个、3个、4个、5个或更多个核苷酸的限制性缺刻酶，也包括识别序列与切割位置紧邻，还可以是识别序列的反链互补序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶，例如识别序列的反链互补序列与切割位置紧邻，或者识别序列的反链互补序列与切割位置之间相隔1个、2个、3个、4个、5个或更多个核苷酸的限制性缺刻酶；这样的限制性缺刻酶，包括但不限于：Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nb.BsrDI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI，优选是Nt.BstNBI和Nt.AlwI，更优选是Nt.BstNBI。这些限制性缺刻酶的识别序列及其切割位点是本领域技术人员所熟知的，例如Nt.BstNBI识别5’‑GAGTC‑3’并切割GAGTC后面的第4个和第5个碱基之间的位置，Nt.AlwI识别5’‑GGATC‑3’并切割GGATC后面的第4个和第5个碱基之间的位置，Nt.BsmAI识别5’‑GTCTC‑3’并切割GTCTC后面的第1个和第2个碱基之间的位置，Nt.BspQI识别5’‑GCTCTTC‑3’并切割GCTCTTC后面的第1个和第2个碱基之间的位置，Nb.BtsI识别5’‑GCAGTG‑3’并切割该识别序列的反链互补序列3’‑CGTTAC‑5’的5’端紧邻该互补序列的位置，Nb.BsrDI识别5’‑GCAATG‑5’并切割该识别序列的反链互补序列3’‑CGTCAC‑5’的5’端紧邻该互补序列的位置。[0136] 识别序列与切割位置重合的限制性缺刻酶可以是切割位置处于识别序列内部的限制性缺刻酶，或者可以是切割位置处于识别序列的反链互补序列内部的限制性缺刻酶，这样的限制性缺刻酶例如可以是Nt.BbvCI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI或Nb.BssSI，这些限制性缺刻酶的识别序列及其切割位点也是本领域技术人员所熟知的，例如Nt.BbvCI识别5′‑CCTCAGC‑3′并切割该识别序列中CC和TCAGC之间的位置，Nb.BbvCI识别5′‑CCTCAGC‑3′并切割该识别序列的反链互补序列3′‑GGAGTCG‑5′中GGAGT和CG之间的位置，Nb.BsmI识别5′‑GAATGC‑3′并切割该识别序列的反链互补序列3′‑CTTACG‑5′中CTTAC和G之间的位置，Nb.BssSI识别5′‑CACGAG‑3′并切割该识别序列的反链互补序列3′‑GTGCTC‑5′中GTGCT和C之间的位置。[0137] “识别序列”或“限制性缺刻酶的识别序列”是指限制性缺刻酶能够识别，并在其附近确定的位置切割双链DNA中的一条链的的特定序列。对于特定的限制性缺刻酶，其识别序列是确定的，本领域技术人员可以容易地获知已知的限制性缺刻酶的识别序列，例如通过https：//international.neb.com/products/restriction‑endonucleases/hf‑nicking‑master‑mix‑time‑saver‑other/nicking‑endonucleases/nicking‑endonucleases查询获得。[0138] 本发明中，根据现有已知的限制性缺刻酶，限制性缺刻酶至少包括三类，第一类是切割位置与识别序列与在同一条链上并且位于识别序列3′一侧，并且识别序列本身与切割位置之间相隔1个、2个、3个、4个、5个或更多个核苷酸的限制性缺刻酶，其在本发明中可以被称为第一类限制性缺刻酶，包括Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI和Nt.BspQI；第二类是切割位置与识别序列不在同一条链上且位于识别序列的反链互补序列的5′一侧紧邻该互补序列的位置，其在本发明中可以被称为第二类限制性缺刻酶，包括Nb.BtsI和Nb.BsrDI；第三类是切割位置处于识别序列内部的限制性缺刻酶，或者切割位置处于识别序列的反链互补序列内部的限制性缺刻酶，其在本发明中可以被称为第三类限制性缺刻酶，包括Nt.BbvCI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI或Nb.BssSI。因此，第一限制性缺刻酶可以是第一类至第三类限制性缺刻酶中的任何一类，第二限制性缺刻酶可以是第一类或第二类限制性缺刻酶中的任何一类。本发明的方法包括任何一种第一限制性缺刻酶和任何一种第二限制性缺刻酶的组合使用。[0139] 第一限制性缺刻酶和第二限制性缺刻酶不同时，第一限制性缺刻酶可以有更多选择，例如可以选择识别序列更长的限制性缺刻酶，使其识别序列在目标DNA上出现的几率更低，降低缺刻酶对目标DNA双链的完整性的破坏，例如Nt.BspQI或Nb.BbvCI，其识别序列的长度超过6个碱基；而第二限制性缺刻酶则可以是识别序列稍短的限制性缺刻酶。在一些特定的实施方案中，用于切割另一条链的第二限制性缺刻酶为Nt.AlwI或Nt.BstNBI，而用于产生单链区的第一限制性缺刻酶为Nt.BspQI、Nb.BbvCI或Nt.BbvCI。后者具有比Nt.BstNBI更长的识别序列，从而具有在目标双链中更低的发生概率，继而更好地保证目标DNA双链的完整性。[0140] 上述限制性缺刻酶中，其名称中含有“Nt”或“Nb”，名称中含有“Nt”的限制性缺刻酶为Nt系列的限制性缺刻酶，名称中含有“Nb”的限制性缺刻酶为Nb系列的限制性缺刻酶，Nt系列的限制性缺刻酶的识别序列与其切割位点在双链DNA的同一条链上，Nb系列的限制性缺刻酶的识别序列与其切割位点在双链DNA的不同链上。本发明所说识别序列与其切割位点在双链DNA的同一条链上是指识别序列与切割位点均位于双链DNA的正链上，或者均位于双链DNA的反链上，并不要求识别序列与切割位点位于同一条连续的链上，它们之间可以断开。本发明中所说的“断开”是指断点两侧的两个核苷酸紧邻但不共价连接。[0141] 本发明人发现，在使用限制性缺刻酶切割双链DNA时，在识别序列和切割位点以外的位置断开并不会影响切割；例如，当切割位点与识别序列位于双链DNA的同一条链上但互不重合时，在切割位点和识别序列之间的位置上可以断开，当切割位点与识别序列分别位于双链DNA的不同链上时，在切割位点和与其相邻的序列之间可以断开，只要该双链DNA包含完整识别序列和完整切割位点的部分保持双链的完全互补杂交状态，这样的断开就不会影响切割。基于此发现，发明人提出可以使用寡核苷酸适配体提供识别序列，用目标双链DNA上的单链区提供切割位点，将限制性缺刻酶的识别序列置于寡核苷酸适配体的适合位置上，通过寡核苷酸适配体的单链部分和目标双链DNA的单链区杂交使得目标双链DNA上的预定位置恰好位于限制性缺刻酶能通过识别寡核苷酸适配体上的识别序列而切割的位置，由此实现在目标双链DNA上的预定位置进行切割，从而获得不同类型、不同长度的预定末端。即使切割位点被包含在另一段序列中，而该序列中有部分序列无法与寡合氨酸适配体的单链部分杂交，只要其中包含完整切割位点的部分序列可以与寡核苷酸适配体杂交形成完全互补的双链，即可以实现在所述切割位点上的切割。所述“完全互补”是指杂交双链中没有缺口，每一个核苷酸都有与之杂交的核苷酸。本领域技术人员应当理解，如果要实现用限制性缺刻酶进行的切割，在包含识别序列和切割位点的互补杂交双链中，识别序列和切割位点都应当是完整的，完整识别序列是指识别序列的核苷酸彼此之间共价连接，完整切割位点是指切割位点两侧的核苷酸共价连接。[0142] 对于识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶，识别序列与切割位置之间的核苷酸数目在本发明中被称为该限制性缺刻酶的特征核苷酸数目。[0143] 关于目标双链DNA[0144] 在本发明的第二方面所提供的方法中，目标双链DNA可以指含有第一限制性缺刻酶的识别位点并可以被所述第一限制性缺刻酶在其一条链的预定位置产生一个或多个缺刻的双链DNA，或者这样的目标双链DNA被第一限制性缺刻酶切割后产生的具有单链区的双链DNA。当需要对一些双链DNA进行改造以使其具有预定末端时，这些双链DNA并不一定具有第一限制性缺刻酶的识别位点，不一定可以直接作为所述目标双链DNA使用。因此，在一些实施方案中，在待改造的双链DNA上添加含有第一限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA，由该识别序列确定的切割位点位于待改造的双链DNA上，所述双链DNA片段的添加位置使得所述第一限制性缺刻酶能够通过识别所添加的识别序列而在目标DNA双链的一条链的预定位置产生一个或多个缺刻，并由此在另一条链上产生单链区。[0145] 在本发明的第二方面所提供的方法中，待改造的双链DNA是指需要对其进行改造以获得预定末端的双链DNA。待改造的双链DNA可以是需要被拼接的双链DNA，由于进行拼接时，特别是进行无缝拼接时需要双链DNA具有特定的末端，因此需要在这些双链DNA上产生特定末端。待改造的双链DNA可以是通过任何方法获得的线性或环状双链DNA，例如通过PCR获得的线性双链DNA，或是载体双链DNA，如质粒。[0146] 如果待改造的双链DNA序列恰好在合适的位置上具有所述第一限制性缺刻酶的识别位点，可以直接以待改造的双链DNA作为目标双链DNA。但由于第一限制性缺刻酶识别位点在随机双链DNA上的出现概率很小，因此在大部分情况下，通过在待改造的双链DNA上添加含有第一限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA。通过添加含有第一限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，可以实现在待改造双链DNA的任何预定位置产生缺刻，而不受待改造双链DNA中原有识别序列的限制。[0147] 在一些实施方案中，对于线性目标双链DNA，可以通过一次切割产生单链区，即利用第一限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个缺刻，该缺刻接近目标双链DNA的一侧末端，使得该缺刻与该侧末端之间的一段DNA单链从双链上解离，从而在另一条链上产生单链区。解离是在适当温度下发生的，在该适当温度下，该缺刻与该末端之间的DNA双链发生变性分离。这种方式在本发明中被称为单切法，可以适用于待改造的双链DNA为线性的情况，例如PCR产物等。[0148] 在单切法中，目标双链DNA在接近其一侧末端的位置上含有所述第一限制性缺刻酶的识别序列，目标双链DNA上的所述预定位置与根据该识别序列确定的切割位点重合，这种情况下，切割位点与该侧末端也是接近的，利用第一限制性缺刻酶在该预定位置上产生切割，使得切割位点与该侧末端之间的一段DNA单链从双链上解离，产生一段单链DNA片段，和具有双链区和单链区的双链DNA。所产生的具有双链区和单链区的双链DNA的结构应与所使用的第二限制性缺刻酶相适应。具体而言，当第二限制性缺刻酶为第一类限制性缺刻酶时(例如Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI)，为了与第二限制性缺刻酶以及相应的寡核苷酸适配体配合使用，由第一限制性缺刻酶切割目标双链DNA所产生的具有双链区和单链区的双链DNA优选具有突出的3′端，即单链区的方向是从紧邻双链区的核苷酸向远离双链区的核苷酸为5′至3′；当第二限制性缺刻酶为第二类限制性缺刻酶时(例如Nt.BstNBI或Nt.AlwI)，为了与第二限制性缺刻酶以及相应的寡核苷酸适配体配合使用，由第一限制性缺刻酶切割目标双链DNA所产生的具有双链区和单链区的双链DNA优选具有突出的5′端，即单链区的方向是从紧邻双链区的核苷酸向远离双链区的核苷酸为3′至5′。本领域技术人员应当理解，这可以通过第一限制性缺刻酶的识别序列的选择和设计来实现。[0149] 在一些优选的实施方案中，可以在待改造的双链DNA的一端添加含有第一限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据该识别序列确定的切割位点重合，利用第一限制性缺刻酶在该预定位置上产生切割，切割位点与所添加的双链DNA片段的游离末端之间的一段DNA单链从双链上解离，产生一段单链DNA片段，和具有双链区和单链区的双链DNA。[0150] 本领域技术人员能够理解所述“接近”的含义，其是指缺刻与某个末端的距离相比于该缺刻与另一个末端之间的距离更近，且该距离的绝对长度也足够小，以使得该缺刻与该末端之间的DNA单链可以从双链上解离。所述的“接近”可以指缺刻与末端的距离为5‑50个碱基，优选是10‑30个碱基，更优选是12‑20个碱基，这个距离也是目标双链DNA的单链区的长度。[0151] 在所述单切法中，虽然是通过一次切割在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个缺刻以产生单链区，但应当理解，可以在目标双链DNA的一条链上产生更多个缺刻，其中一个缺刻在预定位置上，这种方式也被称为单切法。多个缺刻可以使得目标双链DNA的一侧末端与距离改侧末端最远的缺刻之间的DNA单链全部解离，这可以产生比单个缺刻更长的单链区。这在希望产生较长单链区时可以促进酶切速度、提高切割效率。[0152] 在一些实施方案中，可以通过两次切割产生单链区，即利用第一限制性缺刻酶在目标双链DNA的一条链上分别产生两个缺刻，这两个缺刻之间的距离接近，使得这两个缺刻之间的一段DNA单链从双链上解离，从而在另一条链上产生单链区。解离是在适当温度下发生的，在该适当温度下，这两个缺刻之间的DNA双链发生变性分离。所述的两个缺刻可以是在同一条链上，或者分别位于双链DNA的两条链上。[0153] 在一些特定的实施方案中，目标双链DNA中可以在同一条链上含有两个序列相同的第一限制性缺刻酶识别序列，这两个识别序列方向相同且它们之间的距离接近，目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述第一限制性缺刻酶在这两个识别序列的切割位点上分别切割一次，共切割两次，使得两个切割位点之间的一段DNA单链从双链上解离，产生一段单链DNA片段，和具有双链区和单链区的双链DNA，这称为同向双切法。在一些优选的实施方案中，可以在待改造的双链DNA上添加含有这样两个序列相同、方向相同、且距离接近的第一限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述第一限制性缺刻酶在这两个识别序列的切割位点上分别切割一次，共切割两次，使得两个切割位点之间的一段DNA单链从双链上解离，产生一段单链DNA片段，和具有双链区和单链区的双链DNA。[0154] 在另一些特定的实施方案中，目标双链DNA中可以相互互补的两条链上分别含有两个序列相同的第一限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，这两个识别序列方向相反且它们之间的距离接近，目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述第一限制性缺刻酶在这两个识别序列的切割位点上分别切割一次，共切割两次，使得两个切割位点之间的双链解离，产生两个单链区，这称为背向双切法。在一些优选的实施方案中，可以在待改造的双链DNA上添加含有这样两个序列相同、方向相反、且距离比较近的第一限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段，获得目标双链DNA，所述双链DNA片段的添加位置使得目标双链DNA上的所述预定位置与根据其中一个识别序列确定的切割位点重合，利用所述第一限制性缺刻酶在这两个识别序列的切割位点上分别切割一次，共切割两次，使得两个切割位点之间的双链上解离，产生两个单链区。[0155] 上述通过两次切割产生单链区的方式，如同向双切法和背向双切法可以适用于环状双链DNA，例如双链DNA载体，如质粒等。其中所述的“接近”是指两个缺刻的距离为5‑50个碱基，优选是10‑30个碱基，更优选是12‑20个碱基，这个距离也是目标双链DNA的单链区的长度。[0156] 应当理解，上述通过两次切割产生单链区的方式，如同向双切法和背向双切法，虽然是通过两次切割产生单链区，但应当理解，可以在目标双链DNA的一条链上产生更多个缺刻或切割，其中一个缺刻在预定位置上(同向双切法)或其中两个缺刻在预定位置上(背向双切法)。多个缺刻可以使得相距最远的两个缺刻之间的DNA单链全部解离，这可以产生比两个缺刻更长的单链区，这种切割方式也分别包含在本发明所说的同向双切法和背向双切法中。这在希望产生较长单链区时可以促进酶切速度、提高切割效率。[0157] 上述方法中，“适当的温度”是指能产生所述的单链区，又能保证所述限制性缺刻酶活性的温度，通常指37‑75摄氏度，优选是45‑65摄氏度，更优选是53‑63摄氏度。[0158] 在一些实施方案中，当第一限制性缺刻酶是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶时，在添加到待改造的双链DNA上的双链DNA片段中，至少一个第一限制性缺刻酶识别序列(在背向双切法中可以是两个第一限制性缺刻酶识别序列)紧邻其切割位点一侧的末端，使得在添加所述双链DNA片段之后，所述第一限制性缺刻酶识别序列在其切割位点一侧紧邻待改造的双链DNA。在另一些实施方案中，在添加到待改造的双链DNA上的双链DNA片段中，至少一个第一限制性缺刻酶识别序列(在背向双切法中可以是两个第一限制性缺刻酶识别序列)与其切割位点一侧的末端之间可以具有一个或更多个核苷酸，从而使得在添加所述双链DNA片段之后，所述第一限制性缺刻酶识别序列在其切割位点一侧与待改造的双链DNA之间具有所述的一个或更多个核苷酸，这种方式可以使最终产生的预定末端含有待改造的双链DNA中原本没有的核苷酸，即在形成预定末端的同时向待改造的双链DNA中添加一个或更多个末端核苷酸，例如可以通过这种方式给目标双链DNA加上额外的核苷酸悬挂。[0159] 本发明的第二方面提供的方法中，所述的第一限制性缺刻酶识别序列的切割位点一侧是指在第一限制性缺刻酶是识别序列与切割位置不重合的限制性缺刻酶的情况下，当第一限制性缺刻酶识别该识别序列并在附近确定的位置进行切割时，该确定的位置相对于所述识别序列而言的这一侧。[0160] 寡核苷酸适配体[0161] 本发明第二方面提供的方法中，寡核苷酸适配体用于提供第二限制性缺刻酶的识别序列，和能与目标双链DNA的单链区杂交的序列，通过杂交将目标双链DNA的另一条链的部分核苷酸定位在寡核苷酸适配体上的识别位序列的切割位点附近，通过寡核苷酸适配体和第二限制性缺刻酶在目标双链DNA的另一条链的预定位置处进行切割。[0162] 寡核苷酸适配体包括双链部分和单链部分。在一些实施方案中，寡核苷酸适配体可以由两条寡核苷酸链杂交形成，双链部分是两条寡核苷酸发生杂交的部分，单链部分是两条寡核苷酸中未参与杂交的部分。在另一些实施方案中，杂交形成寡核苷酸适配体的两条链的一端相连，形成发夹结构，这也可被视为寡核苷酸适配体是由一条可形成发夹结构的寡核苷酸链组成，发夹的茎部包括相互杂交的双链部分和单链部分，或者说发夹的茎部包括双链部分，单链部分为发夹的开环部分。在发夹结构的情况下，也可认为寡核苷酸适配体是由一条可形成发夹结构的寡核苷酸链组成。寡核苷酸适配体包含第二限制性缺刻酶识别序列，但缺少第二限制性缺刻酶的切割位点，即缺少可被第二限制性缺刻酶切割的序列，而仅有其互补序列，该互补序列构成所述寡核苷酸适配体的单链部分。寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链的单链区可以杂交，寡核苷酸适配体与目标双链的单链区杂交后形成的双链结构能够被第二限制性缺刻酶识别并在该单链区附近的预定位置发生切割，具体而言，寡核苷酸适配体与目标双链的单链区的杂交使得目标双链DNA的另一条链上的核苷酸靠近所述识别序列，并使得该另一条链上的预定位置恰好位于所述第二限制性缺刻酶的切割位点的位置，由此能够使得所述第二限制性缺刻酶通过识别寡核苷酸适配体上的识别序列而在所述目标双链DNA的另一条链的预定位置上进行切割。[0163] 本发明第二方面提供的方法中所述的利用寡核苷酸适配体配合第二限制性缺刻酶对目标双链DNA的酶切也可被称为辅助酶切。[0164] 当寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的单链区杂交或与单链DNA的预定区域杂交时，杂交区域从寡核苷酸适配体中紧邻双链部分的第一个单链核苷酸开始向远离双链部分的方向延伸。寡核苷酸适配体的双链部分的长度可以在6‑30个碱基之间，优选是10‑15个碱基，其单链部分的长度可以是5‑50个碱基，优选是10‑30个碱基，更优选是15‑20个碱基。寡核苷酸适配体的单链部分与目标双链DNA的另一条链或与单链DNA的杂交区域的长度可以大于、等于或小于其单链部分的长度，例如可以是5‑100个碱基，优选是10‑80个碱基，更优选是15‑70个碱基。[0165] 在本发明的辅助酶切方法中，当目标双链DNA的单链区位于其一端，在单链区的另一端具有双链区时，例如对于通过单切法和背向双切法获得的目标双链DNA，寡核苷酸适配体中单链部分和目标双链DNA的单链区的方向优选使得，当二者杂交时，寡核苷酸适配体的单链部分中靠近寡核苷酸适配体的双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中靠近目标双链DNA的双链区的部分杂交，寡核苷酸适配体的单链部分中远离寡核苷酸适配体的双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中远离目标双链DNA的双链区的部分杂交。寡核苷酸适配体中单链部分的方向与目标双链DNA的单链区的方向取决于所使用的第二限制性缺刻酶。具体而言，当第二限制性缺刻酶为第一类限制性缺刻酶时(例如Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI)，寡核苷酸适配体的单链部分的方向是从紧邻双链部分的核苷酸向远离双链部分的核苷酸为3’至5’，相应的目标双链DNA的单链区的方向是从紧邻双链区的核苷酸向远离双链区的核苷酸为5′至3′；当第二限制性缺刻酶为第二类限制性缺刻酶时(例如Nb.BtsI或Nb.BsrDI)，寡核苷酸适配体的单链部分的方向是从紧邻双链部分的核苷酸向远离双链部分的核苷酸为5’至3’，相应的目标双链DNA的单链区的方向是从紧邻双链区的核苷酸向远离双链区的核苷酸为3’至5’。[0166] 当通过同向双切法产生具有双链区和单链区的目标双链DNA时，该目标双链DNA具有一个单链区和分别位于单链区两端的两个双链区。这样的目标双链DNA的单链区与寡核苷酸适配体中单链部分杂交时，有且只有一个双链区符合以下描述：“寡核苷酸适配体的单链部分中靠近双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中靠近该双链区的部分杂交，寡核苷酸适配体的单链部分中远离双链部分的核苷酸与目标双链DNA的单链区中远离该双链区的部分杂交”。符合该描述的双链区紧邻的末端即为下一步骤希望操纵的末端，换言之，最终产生的预定的末端是从符合该描述的双链区延伸出的末端。下文中，对于由同向双切法产生的目标双链DNA，符合该描述的双链区也可以被称为感兴趣双链区。[0167] 以哪个双链区为感兴趣双链区取决于所使用的第二限制性缺刻酶。具体而言，当第二限制性缺刻酶为第一类限制性缺刻酶时(例如Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI)，感兴趣双链区是紧邻单链区的5′侧的双链区，或者说与解离下来的DNA单链的3′侧紧邻的双链区；当第二限制性缺刻酶为第二类限制性缺刻酶时(例如Nb.BtsI或Nb.BsrDI)，感兴趣双链区是紧邻单链区的3′侧的双链区，或者说与解离下来的DNA单链的5′侧紧邻的双链区。[0168] 寡核苷酸适配体的结构与所使用的第二限制性缺刻酶相关。当第二限制性缺刻酶为第一类限制性缺刻酶时(Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI)，在寡核苷酸适配体上，第二限制性缺刻酶的识别序列位于双链部分的两条链中不具有单链部分的那条链上，且该识别序列全部位于双链部分，该识别序列的3′侧缺少切割位点，寡核苷酸适配体的单链部分的方向是从紧邻双链部分的核苷酸向远离双链部分的核苷酸为3’至5’。在这种情况下，在一些实施方案中，当所使用的第二限制性缺刻酶的识别序列与其切割位点之间有1个或更多个核苷酸的间隔(例如所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI)时，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列可以紧邻其切割位点一侧的双链部分的末端，利用这种寡核苷酸适配体进行的辅助酶切在本发明中被称为紧邻模式。在一些实施方案中，当所使用的第二限制性缺刻酶的识别序列与其切割位点之间有2个或更多个核苷酸的间隔(例如所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.BstNBI或Nt.AlwI)时，寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间可以具有1个核苷酸，利用这种寡核苷酸适配体进行的辅助酶切在本发明中被称为间1模式。在另一些实施方案中，当所使用的第二限制性缺刻酶的识别序列与其切割位点之间有3个或更多个核苷酸的间隔(例如所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.BstNBI或Nt.AlwI)时，寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间可以具有2个核苷酸，利用这种寡核苷酸适配体进行的辅助酶切在本发明中被称为间2模式。在另一些实施方案中，当所使用的第二限制性缺刻酶的识别序列与其切割位点之间有4个或更多个核苷酸的间隔(例如所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.BstNBI或Nt.AlwI)时，寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间可以具有3个核苷酸，利用这种寡核苷酸适配体进行的辅助酶切在本发明中被称为间3模式。在上述情况中，第二限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间的核苷酸数量应当少于所使用的限制性缺刻酶的特征核苷酸数目。因此，能够采用哪种模式取决于第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目，寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间的核苷酸数目应当小于所述第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目。如果第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目为1，则采用紧邻模式，如果第二限制性缺刻酶的特征核苷酸属木为4，则可以采用紧邻模式、间1模式、间2模式或间3模式。而在另一些实施方案中，如果所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目大于4，寡核苷酸寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间也可以具有多于3个核苷酸。[0169] 在一些实施方案中，当所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.BstNBI时，寡核苷酸适配体的双链部分的两条链中不具有单链部分的那条链的3′末端可以是‑GAGTC、‑‑GAGTCN、‑GAGTCNN或‑GAGTCNNN。当所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.AlwI时，寡核苷酸适配体的双链部分的两条链中不具有单链部分的那条链的3′末端可以是‑GGATC、‑‑GGATCN、‑GGATCNN或‑GGATCNNN。当所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.BspQI时，寡核苷酸适配体的双链部分的两条链中不具有单链部分的那条链的3′末端可以是‑GCTCTTC。当所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.BsmAI时，寡核苷酸适配体的双链部分的两条链中不具有单链部分的那条链的3′末端可以是‑GTCTC。其中“‑”表示还可以共价连接其它核苷酸，N表示可以是任意核苷酸，例如A、T、C或G。[0170] 当第二限制性缺刻酶选用第二类限制性缺刻酶时(例如Nb.BtsI或Nb.BsrDI)，在寡核苷酸适配体上，第二限制性缺刻酶的识别序列位于双链部分的两条链中具有单链部分的那条链上，该识别序列的互补杂交序列的5′侧缺少切割位点，寡核苷酸适配体的单链部分的方向是从紧邻双链部分的核苷酸向远离双链部分的核苷酸为5’至3’。目前已知的第二类限制性缺刻酶，其切割位点紧邻其识别序列的反链互补序列的5′端，因此若要实现切割，则需要由目标双链DNA的单链提供反链互补序列5′端的至少最后一个核苷酸，以提供完整切割位点。在这种情况下，寡核苷酸适配体中第二限制性缺刻酶的识别序列并不完全位于其双链部分，而是识别序列的3′端的一个核苷酸位于单链部分上，识别序列的其它核苷酸位于双链部分上，相应地，识别序列的反链互补序列的5′端的至少最后一个核苷酸不被包含在寡核苷酸适配体中。利用这样的第二限制性缺刻酶与寡核苷酸适配体配合切割获得的5′末端的至少最后一个核苷酸无法定制，必然与识别序列的反链互补序列的5′端的最后一个核苷酸相同。[0171] 在一些实施方案中，当所使用的第二限制性缺刻酶为Nb.BsrDI时，寡核苷酸适配体的双链部分的两条链中不具有单链部分的那条链的5′末端可以是ATTGC‑，而在寡核苷酸适配体的双链部分的两条链中具有单链部分的那条链上，位于双链部分和单链部分分界点5′侧的序列是‑GCAAT，位于双链部分和单链部分分界点3′侧的序列是G‑。当所使用的第二限制性缺刻酶为Nb.BtsI时，寡核苷酸适配体的双链部分的两条链中不具有单链部分的那条链的5′末端可以是ACTGC‑，而在寡核苷酸适配体的双链部分的两条链中具有单链部分的那条链上，位于双链部分和单链部分分界点5′侧的序列是‑GCAGT，位于双链部分和单链部分分界点3′侧的序列是G‑。利用Nb.BsrDI或Nb.BtsI作为第二限制性缺刻酶时，其与寡核苷酸适配体配合切割获得的5′末端的至少最后一个核苷酸必然为C。[0172] 限制性缺刻酶的种类还在持续增加中，以后如果出现切割位置与识别序列不在同一条链上，且切割位点与识别序列的反链互补序列之间存在非定制碱基，例如识别序列的反链互补序列本身与切割位置之间相隔1个、2个、3个、4个、5个或更多个核苷酸的限制性缺刻酶，也可以使用这种限制性缺刻酶作为第二限制性缺刻酶获得完全定制的末端。对于这样的限制性缺刻酶，识别序列的反链互补序列与切割位置之间的核苷酸数目被称为特征核苷酸数目。在这种情况下，在寡核苷酸适配体上，第二限制性缺刻酶的识别序列位于双链部分的两条链中具有单链部分的那条链上，且该识别序列全部位于双链部分，该识别序列反链互补序列的5′侧缺少切割位点，寡核苷酸适配体的单链部分的方向是从紧邻双链部分的核苷酸向远离双链部分的核苷酸为5’至3’。在这种情况下，在一些实施方案中，当所使用的第二限制性缺刻酶的识别序列的反链互补序列与其切割位点之间有1个或更多个核苷酸的间隔时，所述寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列的反链互补序列可以与其切割位点一侧的双链部分的末端紧邻，或者具有1个、2个、3个或更多个核苷酸的间隔。类似地，如果使用这样的限制性缺刻酶作为第二限制性缺刻酶，寡核苷酸适配体中的第二限制性缺刻酶识别序列的反链互补序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间的核苷酸数目应当小于所述第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目。[0173] 关于切割产生预定末端[0174] 可以通过寡核苷酸适配体的设计使得第二限制性缺刻酶在预定位置切割目标双链DNA的另一条链或单链DNA。[0175] 当第二限制性缺刻酶选用第一类限制性缺刻酶时(例如Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI)时，目标双链DNA的另一条链上被切割的位置由多个因素共同确定，其中一个因素是所使用的特定第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目，另一个因素是寡核苷酸适配体中识别序列与切割位点一侧的双链部分末端之间的核苷酸数量，再一个因素是目标双链DNA的另一条链的杂交开始碱基在该另一条链中的位置。所述杂交开始碱基是指目标双链DNA的另一条链的杂交区(即与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的序列)中，紧邻寡核苷酸适配体双链部分的核苷酸。第二限制性缺刻酶切割的位置是从目标双链DNA的杂交开始碱基起沿着5′至3′方向的特定数量的核苷酸之后，该特定数量为所使用的特定第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间的碱基数量。当切割目标单链DNA时，决定目标单链DNA上被切割位置的因素包括：(1)所使用的特定第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目；(2)寡核苷酸适配体中识别序列与切割位点一侧的双链部分的末端之间的核苷酸数量；(3)目标单链DNA的杂交开始碱基在该单链DNA中的位置。这里所说的目标单链DNA的杂交开始碱基是指目标单链DNA的杂交区(即与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的序列)中，紧邻寡核苷酸适配体双链部分的核苷酸。第二限制性缺刻酶切割的位置是从目标单链DNA的杂交开始碱基起沿着5′至3′方向的特定数量的核苷酸之后，该特定数量为所使用的特定第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的双链部分的末端之间的碱基数量。[0176] 当第二限制性缺刻酶选用第二类限制性缺刻酶，例如Nb.BsrDI或Nb.BtsI时，由于相应的寡核苷酸适配体的单链部分和双链部分交界处的部分序列已确定，决定目标单链DNA上被切割位置的因素仅包括目标单链DNA的杂交开始碱基在该单链DNA中的位置。第二限制性缺刻酶切割的位置是从目标单链DNA的杂交开始碱基起沿着3′至5′方向的1个核苷酸之后。[0177] 通过辅助酶切模式，可以在目标双链DNA的另一条链上的不同预定位置进行切割，以产生所需末端，切割位置可以位于目标双链DNA的单链区上，也可以位于目标双链DNA的双链区上。[0178] (1)辅助双链酶切[0179] 在一些实施方案中，目标双链DNA的另一条链的杂交区(即目标双链DNA上与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域)位于单链区上且与其双链区紧邻，或者与双链区之间相隔1个或更多个核苷酸，例如1个、2个或3个或更多个核苷酸。此时当第二限制性缺刻酶选用不同酶时会具有不同的切割结果。[0180] 如果所使用的第二限制性缺刻酶为第一类限制性缺刻酶，例如Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI，此时利用寡核苷酸适配体进行辅助酶切可以获得不同长度的3’悬挂，悬挂的碱基数为所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧末端之间的核苷酸数量，再加上目标双链DNA的杂交区与双链区之间的核苷酸数量。这种情况下，寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧末端之间的核苷酸数量应当小于所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目。[0181] 当使用Nt.BstNBI或Nt.AlwI作为第二限制性缺刻酶时，它们的特征核苷酸数目都是4，如果寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量是m，目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量为n，则产生的3’悬挂的碱基数是4‑m+n，前提是m小于4。例如，当m＝2时，如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生2个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1，则产生3个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为2，则产生4个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为3或更多，则产生5个碱基或更多个碱基的3’悬挂。但在这种情况下，如果第一限制性缺刻酶与第二限制性缺刻酶相同的话，3’悬挂的序列从5’至3’的第5个核苷酸开始为所述第一限制性缺刻酶的识别序列的核苷酸，这是由第一限制性缺刻酶对目标双链DNA的切割方式决定的。再例如，当m＝0时，如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生4个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1或更多，则产生5个碱基或更多个碱基的3’悬挂，同样地，在这种情况下，如果第一限制性缺刻酶与第二限制性缺刻酶相同的话，3’悬挂的序列从5’至3’的第5个碱基开始为所述第一限制性缺刻酶的识别序列。再例如，当m＝1时，如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生3个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1，则产生4个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为2或更多，则产生5个碱基或更多个碱基的3’悬挂，同样地，在这种情况下，如果第一限制性缺刻酶与第二限制性缺刻酶相同的话，3’悬挂的序列从5’至3’的第5个碱基开始为所述第一限制性缺刻酶的识别序列。再例如，当m＝3时，如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生1个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1，则产生2个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为2，则产生3个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为3，则产生4个碱基的3’悬挂如；果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为4或更多，则产生5个碱基或更多个碱基的3’悬挂，同样，在这种情况下，如果第一限制性缺刻酶与第二限制性缺刻酶相同的话，3’悬挂的序列从5’至3’的第5个碱基开始为所述第一限制性缺刻酶的识别序列。本段落中，当提及目标双链DNA的双链区时，对于由同向双切法获得的目标双链DNA而言，是指其感兴趣双链区，感兴趣双链区的定义如前所述。[0182] 当使用Nt.BspQI或Nt.BsmAI作为第二限制性缺刻酶时，它们的特征核苷酸数目均为1，寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量m为0，此时利用寡核苷酸适配体进行辅助酶切可以获得不同长度的3’悬挂，悬挂的碱基数为目标双链DNA的杂交区与双链区之间的核苷酸数量n+1。如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生1个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1，则产生2个碱基的3’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为2或更多，则产生3个碱基或更多个碱基的3’悬挂。本段落中，当提及目标双链DNA的双链区时，对于由同向双切法获得的目标双链DNA而言，是指其感兴趣双链区，感兴趣双链区的定义如前所述。[0183] 在一些实施方案中，m＝2且n＝2(例如所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目为3或更多时，例如Nt.AlwI或Nt.BstNBI)，寡核苷酸适配体中需要与最终产生的3’悬挂中的核苷酸杂交的核苷酸仅有2个，即从寡核苷酸适配体紧邻双链部分的第一个单链核苷酸开始的2个核苷酸，因此，除了这几个寡核苷酸之外，寡核苷酸适配体上的其他核酸都是可人为选定的，只要其能实现寡核苷酸适配体的功能即可。例如，寡核苷酸适配体的双链部分只要包括第二限制性缺刻酶识别位点即可，其他序列可任选，而寡核苷酸适配体的单链部分中，除了所述的2个核苷酸之外，其他核苷酸需要能与目标双链DNA的单链区的相应部分杂交，而目标双链DNA的单链区的这一部分可以是人为添加在待改造双链DNA上的，因而其序列也可以任选(除了其中所包含的第一限制性缺刻酶识别序列的互补序列之外)。因此，在所使用的第二限制性缺刻酶相同的情况下，可以将寡核苷酸适配体中除了所述2个核苷酸之外的其他核苷酸固定(这意味着目标双链DNA上添加的含有第一限制性缺刻酶识别序列的双链DNA片段的序列也是固定的)，根据所述2个核苷酸的所有排列组合，制备16种寡核苷酸适配体，其中每种寡核苷酸适配体包含所述2个核苷酸的一种排列组合，16种寡核苷酸适配体包含所述2个核苷酸的全部16种排列组合。这些寡核苷酸适配体的混合物可以作为通用寡核苷酸适配体，适用于n＝2的各种不同的目标双链DNA的辅助酶切。[0184] 如果所使用的第二限制性缺刻酶为第二类限制性缺刻酶，例如Nb.BsrDI或Nb.BtsI，此时利用寡核苷酸适配体进行辅助酶切可以获得不同长度的5’悬挂，悬挂的碱基数为目标双链DNA的杂交区与双链区之间的核苷酸数量n+1。如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为0，则产生1个碱基的5’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为1，则产生产生2个碱基的5’悬挂；如果目标双链DNA的单链区的杂交区与双链区之间相隔的核苷酸数量n为2或更多，则产生3个碱基或更多个碱基的5’悬挂。本段落中，当提及目标双链DNA的双链区时，对于由同向双切法获得的目标双链DNA而言，是指其感兴趣双链区，感兴趣双链区的定义如前所述。[0185] (2)入侵式辅助双链酶切[0186] 在另一些特定的实施方案中，目标双链DNA上与寡核苷酸适配体的单链部分杂交的区域不仅包括该目标双链DNA的单链区，还包括与该单链区相邻的部分双链区序列，换言之，目标双链DNA的杂交起始碱基位于目标双链DNA的双链上。在这种情况下，寡核苷酸适配体的单链部分不仅包括能与目标双链DNA的单链区杂交的序列，在该序列与寡核苷酸适配体的双链部分之间还包括能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列。这种辅助酶切方式在本发明中被称为入侵式辅助酶切，在寡核苷酸适配体的单链部分中，能与目标双链DNA中与单链区相邻的一段双链区序列杂交的序列被称为“入侵区”，这段与单链区相邻的双链区序列被称为“被入侵区”，被入侵区原本与其互补序列杂交形成双链，在寡核苷酸适配体与目标双链DNA杂交的过程中，被入侵区的序列有可能发生双链解离，并与入侵区杂交。入侵区一端与寡核苷酸适配体的双链部分紧邻，一端与寡核苷酸适配体的单链部分中能与目标双链DNA的单链区杂交的序列紧邻。入侵区和被入侵区的长度可以在1‑100碱基之间，优选是1‑30碱基之间，更优选是3‑20碱基之间。本段落中，当提及目标双链DNA的双链区时，对于由同向双切法获得的目标双链DNA而言，是指其感兴趣双链区，感兴趣双链区的定义如前所述。[0187] 如果所使用的第二限制性缺刻酶为第一类限制性缺刻酶，例如Nt.BstNBI、Nt.AlwI、Nt.BspQI或Nt.BsmAI，利用寡核苷酸适配体进行入侵式辅助酶切可以获得不同长度的3’悬挂、平末端或不同长度的5’悬挂。当所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，大于入侵区的核苷酸数量时，产生3’悬挂，悬挂的长度为所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，再减去入侵区的核苷酸数量。当所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，等于入侵区的核苷酸数量时，产生平末端。当所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量，小于入侵区的核苷酸数量时，产生5’悬挂，悬挂的长度为所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目减去所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量得到的数量，被入侵区核苷酸数量减去后的差值。在这些情况中，所使用的第二限制性缺刻酶的特征核苷酸数目应大于所使用的寡核苷酸适配体中识别序列与其切割位点一侧的末端之间相隔的核苷酸数量。[0188] 在一些特定的实施方案中，所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.AlwI或Nt.BstNBI，这两种酶的特征核苷酸数目都是4，且其切割位点均在识别序列的3’一侧。如果寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量是m，入侵区核苷酸数量为i，则当4‑m＞i时，产生3’悬挂，3’悬挂的长度为4‑m‑i；当4‑m＝i时，产生平末端；当4‑m＜i时，产生5’悬挂，5’悬挂的长度为i‑(4‑m)。例如，在m＝2的情况下，如果i＝0，产生2个碱基的3’悬挂；如果i＝1，产生1个碱基的3’悬挂；如果i＝2，产生平末端；如果i＞2，产生长度为i‑2的5’悬挂。[0189] 在一些特定的实施方案中，所使用的第二限制性缺刻酶为Nt.BspQI或Nt.BsmAI，这两种酶的特征核苷酸数目都是1，且其切割位点均在识别序列的3’一侧。寡核苷酸适配体中识别序列与其所在链的3’末端之间的核苷酸数量m为0，入侵区核苷酸数量为i，则当i为0时，产生3’悬挂，3’悬挂的长度为1；当i＝1时，产生平末端；当i＞1时，产生5’悬挂，5’悬挂的长度为i‑1。[0190] 如果所使用的第二限制性缺刻酶为第二类限制性缺刻酶，例如Nb.BsrDI或Nb.BtsI，此时，如果入侵区核苷酸数量为i为0，则产生5’悬挂，5’悬挂的长度为1；当i＝1时，产生平末端；当i＞1时，产生3’悬挂，3’悬挂的长度为i‑1。[0191] 关于目标双链DNA的甲基化[0192] 当第一限制性缺刻酶和第二限制性缺刻酶不同时，还可以使用第二限制性缺刻酶的甲基化酶使目标双链DNA甲基化，使目标双链DNA无法被第二限制性缺刻酶切割。[0193] 这里所使用的缺刻酶的甲基化酶是指识别序列与该缺刻酶的识别序列一致或包含该缺刻酶的识别序列的甲基化酶。当目标双链DNA被第二限制性缺刻酶的甲基化酶甲基化后，目标双链DNA将无法被相应的第二限制性缺刻酶切割，但后续的另一条链的切割不受目标双链DNA甲基化的影响，因为另一条链的切割由寡核苷酸适配体介导，而寡核苷酸适配体并没有被甲基化。[0194] 例如，如果第二限制性缺刻酶是Nt.BstNBI，其对应的甲基化酶是M.BstNBI(或可称为bstNBIM)，该甲基化酶的识别序列是GASTC，其中S可以是G或C，GASTC序列包含GAGTC的，此时当目标双链DNA被M.BstNBI甲基化后，将不会再被第二限制性缺刻酶Nt.BstNBI所切割。[0195] 如本领域技术人员所知，限制酶和修饰酶(即甲基化酶)属于细菌的限制‑修饰系统(R‑M，Restriction‑modificationsystem)，其中限制酶用于降解外源DNA，从而阻止其复制和整合到宿主细胞中，修饰酶对细菌自身碱基进行甲基化，从而保护自身DNA不被降解。限制酶通常都有与其对应的甲基化酶，其识别序列与相应的限制酶的识别序列一致或包含相应的限制酶的识别序列。限制性缺刻酶属于限制酶，其也具有对应的甲基化酶，其识别序列与相应的缺刻酶的识别序列一致或包含相应的缺刻酶的识别序列。[0196] 不同限制性缺刻酶的甲基化酶是本领域技术人员熟知的，例如M.BstNBI识别GASTC，并甲基化N4‑胞嘧啶或N6‑腺嘌呤；M.MlyI识别GASTC，并甲基化N6‑腺嘌呤；M.BstNBI和M.MlyI都适合作为Nt.BstNBI的甲基化酶。例如M.AlwI识别GGATC，并甲基化N6‑腺嘌呤，M.AlwI是Nt.AlwI的甲基化酶。再例如M.BsmAI识别GTCTC，并甲基化胞嘧啶，M.BsmAI是Nt.BsmAI的甲基化酶。这些甲基化酶的信息可以在http：//rebase.neb.com/rebase/index.html获得，从该网站上还可以获取本发明所使用的第二限制性缺刻酶的其它甲基化酶。[0197] 目标双链DNA的甲基化，可以在体外进行，也可以在体内进行。在体外，目标双链DNA可以被分离的甲基化酶甲基化；而在体内，可以使目标双链DNA与甲基化酶的表达基因一同存在于宿主细胞中，宿主细胞表达该甲基化酶，此时，如果目标双链DNA中存在该甲基化酶的识别序列，则会被甲基化，当目标双链DNA被提取之后，本身已经是甲基化的状态。编码该甲基化酶的基因可以与目标双链DNA存在于同一DNA双链(例如质粒)上，也可以存在于其它DNA分子上(比如存在于同一宿主中的另一个质粒上，或者整合到宿主的基因组中)，以使所述宿主表达该甲基化酶。[0198] 在一些特定的实施方案中，用于切割另一条链的第二限制性缺刻酶为Nt.BstNBI或Nt.AlwI，目标双链DNA与M.BstNBI基因或M.AlwI基因共同存在于同一个宿主中，从这个宿主中得到的DNA天然具有在Nt.BstNBI或Nt.AlwI位点上被甲基化的特点，当从该宿主中得到的目标双链DNA用于辅助酶切时，目标双链DNA将不被Nt.BstNBI或Nt.AlwI切割，但会被其它缺刻酶切割，比如Nt.BspQI、Nb.BbvCI或Nt.BbvCI，在其它限制性缺刻酶的作用下，在目标双链DNA上产生单链区，后续的另一条链的切割不受目标双链DNA甲基化的影响，因为另一条链的切割由寡核苷酸适配体介导，而寡核苷酸适配体并没有被甲基化。[0199] 如前所述，本发明的方法还可以应用于切割单链DNA。因此，本发明的第三方面提供一种在目标单链DNA上任意预定位置产生切割的方法，所述方法包括：[0200] 使目标单链DNA的预定区域与寡核苷酸适配体的单链部分杂交，所述寡核苷酸适配体是具有双链部分和单链部分的DNA分子，其在双链部分包含限制性缺刻酶的识别位点，但缺少可被该限制性缺刻酶切割的序列，所述寡核苷酸适配体的单链部分能够与目标单链DNA的预定区域杂交形成双链结构，该双链结构可被所述限制性缺刻酶识别，并使得目标单链DNA的预定位置处于可以介由所述限制性缺刻酶对寡核苷酸适配体上的识别位点的识别而被所述限制性缺刻酶切割的位置；[0201] 使用所述限制性缺刻酶在所述目标单链的预定位置产生切割。[0202] 本领域技术人员能够理解，在上述目标单链DNA上任意预定位置产生切割的方法中，所述“该双链结构可被所述限制性缺刻酶识别”是指当所述寡核苷酸适配体的单链部分与目标单链DNA的预定区域杂交后，该杂交区域与所述寡核苷酸适配体的双链部分一起形成可以被所述限制性缺刻酶识别并切割的双链结构，所述限制性缺刻酶识别所述寡核苷酸适配体的双链部分上的识别位点，并切割目标单链DNA的预定位置。本领域技术人员能够理解，目标单链DNA的预定区域与寡核苷酸适配体的单链部分杂交形成的杂交区紧邻寡核苷酸适配体的双链部分，由此使得所述限制性缺刻酶识别所述寡核苷酸适配体的双链部分上的识别位点，并切割目标单链DNA的预定位置。[0203] 这种针对目标单链DNA的酶切等效于一个定制的单链DNA限制性内切酶。所述预定位置指人为选定的需要被切割的目标单链DNA上的位置，这个位置可以是目标单链DNA上的任意两个相邻碱基之间。[0204] 在对目标单链DNA的切割中，所使用的限制性缺刻酶和寡核苷酸适配体的种类和结构与前述第一方面的方法相同。[0205] 目标单链DNA的序列没有限制，其来源也没有限制，包括但不限于：DNA合成仪合成的寡核苷酸、带有f1复制子的质粒在phagemidrescue操作下获得的单链DNA、滚环复制中产生的单链DNA、双链DNA在变性条件下获得的单链DNA等。[0206] 本发明的辅助酶切，其切割过程的温度可以是固定的(被称为等温辅助酶切)或者可以是变化的(被称为不等温辅助酶切)。等温辅助酶切的温度可以是在37‑75摄氏度之间，优选是45‑65摄氏度，更优选是55摄氏度。[0207] 不等温辅助酶切是指在切割过程中对于不同的步骤采用不同的温度，按照温度循环的方式进行酶切。例如在目标双链DNA的一条链的预定位置产生一个或多个缺刻时，可以采用较高温度，在使用寡核苷酸适配体结合使用相应限制性缺刻酶在目标双链DNA的另一条链的预定位置产生切割时，可以采用较低温度。因此，在不等温辅助酶切中，整个反应过程中，可以进行温度循环，循环的最高温在50‑75摄氏度之间，优选是55‑65度，循环的最低温在37‑55摄氏度之间，优选是45‑55度，每个循环的时间在30秒‑20分钟，优选是1分钟‑5分钟。[0208] 本发明的整个反应体系中，还可以添加D‑海藻糖以提高酶切速度，D‑海藻糖的浓度为0.1M‑2M，优选是0.2M‑0.6M。[0209] 本发明中，“碱基”和“核苷酸”可以互换使用，均是指组成双链DNA或单链DNA的单个脱氧核糖核苷酸。[0210] 如果没有特别指出，本发明中所提及的序列的方向均是从5’至3’。附图说明[0211] 通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本发明，其中：[0212] 图1显示了FokI的酶切方式，其中箭头所指是切割位置。[0213] 图2显示了Nt.BstNBI的酶切方式，其中″...″表示长度不定的DNA序列，这个符号适合本发明的所有图。[0214] 图3显示了3种辅助单链酶切模式。[0215] 图4显示了单链区产生方法。[0216] 图5显示了寡核苷酸适配体组成。[0217] 图6显示了辅助双链酶切产生4碱基3’悬挂。[0218] 图7显示了辅助双链酶切产生长度大于等于2碱基的3’悬挂。[0219] 图8显示了入侵式辅助双链酶切。[0220] 图9显示了用限制性缺刻酶Nt.BstNBI作辅助单链酶切的过程。[0221] 图10是用限制性缺刻酶Nt.BstNBI作辅助单链酶切的电泳图。[0222] 图11显示了用限制性缺刻酶Nt.BstNBI作辅助双链酶切产生4个碱基的3’悬挂的过程。[0223] 图12是用限制性缺刻酶Nt.BstNBI作辅助双链酶切产生4个碱基的3’悬挂的电泳图。[0224] 图13显示产生4个碱基的3’悬挂的片段用于DNA的拼接。[0225] 图14是入侵式辅助双链酶切产生不同长度悬挂的示例。[0226] 图15是入侵式辅助双链酶切产生平末端及5’悬挂末端的电泳图。[0227] 图16是Nt+Nt酶切模式示例，其中第一限制性缺刻酶是Nt系列的限制性缺刻酶，第二限制性缺刻酶是Nt系列的限制性缺刻酶。[0228] 图17是Nb+Nb酶切模式示例，第一限制性缺刻酶是Nb系列的限制性缺刻酶，第二限制性缺刻酶是Nb系列的限制性缺刻酶。[0229] 图18是Nb+Nt酶切模式示例，第一限制性缺刻酶是Nb系列的限制性缺刻酶，第二限制性缺刻酶是Nt系列的限制性缺刻酶。[0230] 图19是Nt+Nb酶切模式示例，第一限制性缺刻酶是Nt系列的限制性缺刻酶，第二限制性缺刻酶是Nb系列的限制性缺刻酶。[0231] 图20是两种缺刻酶+第二限制性缺刻酶甲基化酶用于辅助酶切的电泳图。具体实施方式[0232] 本发明涉及一种操纵双链DNA末端的方法，其原理是利用限制性缺刻酶在双链上先产生一个或多个缺刻，产生一段单链区，然后利用寡核苷酸适配体与单链区的杂交，再结合同一个限制性缺刻酶在DNA双链的另一条链上产生切割。这个切割的位置与寡核苷酸适配体的序列选择相关，最终切断目的双链DNA，并在切割处产生长度可控、悬挂种类可控的末端。[0233] 在一些实施方案中，所述的限制性缺刻酶是Nt.BstNBI。这个酶的酶切方式如图2(图示中″...″表示长度不定的DNA序列，这个符号适合本发明的所有图)，其切割位置在正链识别序列后面第四与第五个碱基之间，对反链上的序列不会产生切割。与FokI类似，当正链上GAGTC之后的碱基被替换成另一个DNA分子上的碱基时，其仍然能在箭头指定的位置发生切割(图3)，在图3中，被切割的目标单链DNA已被黑线圈出，黑圈之外的结构被称为寡核苷酸适配体，图3中共显示了3种杂交方式，其中图3a是紧邻模式，即被切割的目标单链DNA的杂交开始碱基与GAGTC序列之间没有其它碱基，切割发生在目标单链DNA参与杂交的第四和第五个碱基之间。图3b是间1模式，即目标单链DNA的杂交开始碱基与GAGTC序列之间间隔了1个碱基，切割发生在目标单链DNA参与杂交的第三和第四碱基之间；图3c是间2模式，即目标单链DNA的杂交开始碱基与GAGTC序列之间间隔了2个碱基，切割发生在目标单链DNA参与杂交的第二和第三碱基之间。这3种模式都能非常高效地将目标单链在指定位置进行切割，目标单链中并不需要含有完整识别序列或识别序列的一部分。这种在寡核苷酸适配体参与下，对任意单链进行酶切的方法被称为辅助单链酶切。[0234] 在一些实施方案中，所述的限制性缺刻酶是Nt.BstNBI，所述的产生一段单链区，只需一次切割。参见图4a，在目标双链DNA的靠近5’端处，安排了一个Nt.BstNBI识别序列，该识别序列和其左侧的序列以及它们的互补序列是额外添加在目标双链DNA5’端的，通过这种添加，可以在任意位置进行切割，而不受原有序列的限制。切割发生后，在一定温度下，包括识别序列在内的小片段单链会从双链DNA上分离，在DNA的双链末端产生一段单链区(单链区位置在图4a中已用符号标出)，这个单链区可作为所述的辅助单链酶切的底物。这种所述的单链区产生方式被称为单切法。[0235] 在一些实施方案中，所述的限制性缺刻酶是Nt.BstNBI，所述的产生一段单链区，其产生方法需要两次切割，这两次切割可以发生在同一条链上(图4b)，也可以发生在不同链上(图4c)。图4b中两个相同方向的Nt.BstNBI识别序列都位于正链上，这两个Nt.BstNBI识别序列和其之间的序列以及它们的互补序列是额外添加在目标双链DNA上的。当两次切割都完成时，两次切割之间的单链DNA会在一定温度的作用下从双链上分离，留下的一段单链区可作为所述的辅助单链酶切的底物，这种方式被称为同向双切法。图4c中有两个位于不同链上的Nt.BstNBI识别序列，这两个Nt.BstNBI识别序列和其之间的序列以及它们的互补序列是额外添加在目标双链DNA上的。当两次切割完成时，两次切割之间的双链在一定温度的所用下，发生变性分离，在左右两侧各留下一段单链区，这个单链区同样可以作为所述的辅助单链酶切的底物，这种方式被称为背向双切法。[0236] 在所有实施方案中，所述的一定温度，是指能产生所述的单链区，而又能保证所述的限制性缺刻酶活性的温度。一般是指37‑75摄氏度，优选是45‑65摄氏度，更优选是53‑63摄氏度。[0237] 在所有实施方案中，所述的限制性缺刻酶，除了Nt.BstNBI，还可以是Nt.AlwI，只需将相应识别序列替换即可。[0238] 在一些实施方案中，所述的限制性缺刻酶是Nt.BstNBI，所述的寡核苷酸适配体，由两条寡核苷酸杂交形成(图5a)，图5a中，寡核苷酸2的5’端能够与所述的单链区杂交，被称为辅单链区(在本发明中也可被称为寡核苷酸适配体的单链部分)。图5a只显示了所述的间2模式，其它模式可由调整寡核苷酸1的3’端碱基N的个数获得。所述的辅单链区之外的双链区(被称为辅双链区，在本发明中也可被称为寡核苷酸适配体的双链部分)的长度为10‑50碱基，优选是12‑30碱基，最优选是15‑20碱基。[0239] 在一些实施方案中，所述的限制性缺刻酶是Nt.BstNBI，所述的寡核苷酸适配体，由一条寡核苷酸形成发夹结构组成(图5b)，在图5b中，弯曲的黑色粗线代表发夹的闭环部，这个画图方式在本发明所有图示中成立。在图5b中，5’端单链部分可与所述的目标单链区杂交，即所述的辅单链区。图5b只显示了所述的间2模式，其它模式可调整寡核苷酸的3’端碱基N的个数获得。所述的发夹结构，其茎部双链区(被称为辅双链区)长度在6‑30碱基之间，优选是10‑15碱基。[0240] 在所有实施方案中，所述的由两条寡核苷酸杂交形成的所述的寡核苷酸适配体，与所述的由一条寡核苷酸形成发夹结构组成的寡核苷酸适配体，其功能是可以互相替代的。[0241] 在所有实施方案中，所述的单链区与所述的辅单链区之间的杂交，只需满足在所述的一定温度下，溶液中所述的单链区与所述的辅单链区之间有一定比例发生杂交。并不需要所述的单链区与所述的辅单链区长度相同，也不需要所述的单链区与所述的辅单链区之间的杂交严格符合碱基配对原则。[0242] 在所有实施方案中，所述的单链区，可以是所述的单切法产生的，也可以是所述的同向双切法产生的，也可以是所述的背向双切法产生的。[0243] 在一些实施方案中，所述的限制性缺刻酶是Nt.BstNBI，当所述的单链区已经存在，在所述的寡核苷酸适配体和所述的限制性缺刻酶共同作用下在所述的单链区的指定位置切割单链，在所述的目标双链DNA末端产生4个碱基的3’悬挂(图6)。图示中两个碱基之间的连线代表的是这两个碱基是相邻并共价连续的，只是为了画图方便才使这两个碱基之间的距离稍远，而没有连线的两个距离稍远的碱基之间是共价不连续的，这种画图方式在本发明所有图示中适用。图6中辅单链区和单链区中产生杂交的碱基已被灰色阴影突出显示，所述的辅助单链酶切的切割位置已被箭头指出(图6c)，切割完成后，所述的寡核苷酸适配体与切割产生的一部分所述的单链区仍能保持杂交状态(图6d)，而目标双链DNA的末端已被修改成4个碱基的3’悬挂(图6e)。结合所述的产生一段单链区和所述的辅助单链酶切，可以在双链DNA末端产生双链切割的效果，这种双链切割的过程被称为辅助双链酶切。[0244] 在一些实施方案中，所述的限制性缺刻酶是Nt.BstNBI，当所述的单链区已经存在，在所述的寡核苷酸适配体和所述的限制性缺刻酶共同作用下在所述的单链区的指定位置切割单链，在所述的目标双链DNA末端产生3个碱基的3’悬挂或2个碱基的3’悬挂或任意大于3个碱基的3’悬挂(图7)。图7b中，所述的单链区中，杂交区(灰色阴影部分)与双链区之间的碱基数n是可变量。其对应的所述的辅助双链酶切结果是n+2个碱基的3’悬挂。所述的辅助双链酶切包括如下几种情况：[0245] 1)当n＝1时，所述的辅助双链酶切产生3个碱基的3’悬挂；[0246] 2)当n＝0时，所述的辅助双链酶切产生2个碱基的3’悬挂；[0247] 3)当n＝2时，所述的辅助双链酶切产生4个碱基的3’悬挂，就是图6中显示的4个碱基的3’悬挂；[0248] 4)当n大于2时，可产生n+2长度的3’悬挂。值得注意的是，本发明中所述的单链区中，与所述的双链区间隔4个碱基处存在确定的5个碱基(当所述的限制性缺刻酶是Nt.BstNBI时，为GACTC，见图4)，这是由所述的单链区产生办法决定的。因此，当n大于2时，所述的辅助双链酶切产生的末端将受到一定的序列限制。比如当n＝3时，在目标双链DNA末端产生的悬挂部分是“NNNNG”，前面4个碱基“N”可定制，但碱基“G”无法定制。[0249] 5)在所述的辅单链区中，当除了3’端两个碱基之外的其它碱基都一致时，只需要16种所述的寡核苷酸适配体就能用于所有n＝2时的切割。这16种寡核苷酸适配体的混合物被称为通用适配体。在图7中，所述的辅助双链酶切结果包括两种DNA分子，分别具有图7d和图7e所示的两种结构，只有图7e的结构是用于下游操作的，因此在目标双链DNA的单链区中，除了悬挂部分的碱基“N”，其它的单链区碱基“N”都可以在选定后固定不变(选定后额外添加到目标双链DNA上)，相应地，辅单链区上除3’端两个碱基之外的其它碱基也可以固定不变。[0250] 在一些实施方案中，所述的限制性缺刻酶是Nt.BstNBI，当所述的单链区已经存在，在所述的寡核苷酸适配体和所述的限制性缺刻酶共同作用下在所述的单链区的指定位置切割单链，在所述的目标双链DNA末端产生1个碱基的3’悬挂、平末端或大于0个碱基的5’悬挂末端(图8)。所述的寡核苷酸适配体在所述的辅单链区和所述的辅双链区之间多了一段单链的入侵区，在图示中以(N)i表示，i代表碱基数且大于等于0，所述的入侵区与目标DNA末端的双链区的一段序列互补，这段目标DNA双链区序列被标记为被入侵区(图8b)。当所述的辅单链区与所述的单链区杂交时，所述的入侵区有机会入侵所述的被入侵区，并形成能被所述的限制性缺刻酶识别的底物(图8c)，此时目标双链DNA的5’端的i个碱基是单链状态。切割发生后，目标双链的末端的状态由i的数量决定，当i＝0时，产生的是2个碱基的3’悬挂，此时没有碱基被入侵，状态与图7中n＝0时一致；当i＝1时，产生的是1个碱基的3’悬挂；当i＝2时，产生的是平末端；当i大于2时，产生的是5’悬挂末端，悬挂的长度是i‑2。这种存在双链被入侵的酶切方式被称为入侵式辅助双链酶切，其特点是：[0251] 1)与产生长度大于4碱基的3’悬挂不同，所有产生的5’悬挂碱基都可以任意定制，不管长度如何；[0252] 2)所述的入侵区，其长度在1‑100碱基之间，优选是1‑30碱基之间，更优选是3‑20碱基之间；[0253] 3)由于双链的入侵需要跨过一定的能势，所以其反应速度会慢于所述的辅助双链酶切。[0254] 在所有实施方案中，所述的辅助双链酶切和入侵式辅助双链酶切具有以下特点：[0255] 1)当所述的目标双链DNA被双链切割后，来自所述的单链区的碱基，其大部分仍会与所述的寡核苷酸适配体杂交在一起(图7d和图8d)，这个结构被称为“失活体”；[0256] 2)当所述的目标双链DNA被双链切割后，切割产生的可定制的末端(图7e和图8e中的结构)，被称为“定制末端”。[0257] 3)所述的失活体与所述的定制末端，无法用连接酶重新连接回去，也很难被聚合酶再拼接回去，因此这种酶切是不对称、不可逆的，这使得所述的定制末端在参与下游操作时，大部分情况下可以不用去除所述的”失活体“，这对很多下游操作来说意义明显。[0258] 用本发明的方法处理过的目标双链DNA，其在下游操作中通常不会再次被限制性缺刻酶切断双链，因而能保持其序列完整性。所述的限制性缺刻酶，其识别序列在随机双链DNA序列上的出现频率与其识别序列的长度有关。比如Nt.BstNBI，其识别序列是GAGTC这5个碱基。这段序列在随机双链DNA的其中一条链上的出现概率是1/1024，在另一条链上的概率也是1/1024。在Nt.BstNBI对双链DNA进行切割产生缺刻时，一般来说很难直接把双链切断，因为这些缺刻之间的平均距离是512个碱基，只要不是两个缺刻分别出现在两条链上，并且距离很近，那么双链DNA的双螺旋结构的完整性是被持续的。用本发明的方法处理过的目标双链DNA，即使其序列中间存在限制性缺刻酶识别位点，如果下游的操作中存在连接酶，这些缺刻会迅速被修复，因此，用本发明的方法处理过的目标双链DNA，其在后续操作过程中的序列完整性在大部分情况下是可以保证的。[0259] 如果下游操作中存在的连接酶只能连接长度超过12个悬挂碱基的末端(比如Taq连接酶)，那么所有能产生12个及以下悬挂碱基的末端的切割方式都属于严重的对序列完整性的破坏。这种情况的发生概率约为0.00002，即约平均每5万个碱基发生一次。这与识别序列长度为8碱基的限制性内切酶的出现频率相当，识别序列为回文的8碱基限制性内切酶，出现频率为每6.5万碱基平均出现一次，识别序列非回文的8碱基限制性内切酶，出现频率为每3.3万碱基平均出现一次。[0260] 如果下游操作中存在的连接酶能够快速连接长度超过4个悬挂碱基的末端(比如T4DNA连接酶)，那么所有能产生4个及以下悬挂碱基的末端的切割方式都属于严重的对序列完整性的破坏。这种情况的发生概率约为0.0000086，即约平均每11.6万个碱基发生一次。[0261] 基于以上计算，可见这种对序列完整性产生严重破坏的切割方式的出现频率是很低的，绝大部分基因的长度在几百碱基到几千碱基之间。在这个长度上，用本发明酶切后获得的序列在进行下游操作时，大部分序列的完整性都能保持。[0262] 有多种不同识别序列的限制性缺刻酶可以选择，比如Nt.BspQI的识别序列是GCTCTTC，对T4DNA连接酶来说，序列完整性破坏发生概率为，近3000万个碱基才平均发生一次。这个数字比一个大肠杆菌(约470万碱基对)和一个酿酒酵母(约1200万碱基对)的基因组还要大很多。可以说基于Nt.BspQI限制性缺刻酶的所述的辅助双链酶切和所述的入侵式辅助双链酶切，几乎不用考虑双链内部的序列完整性是否会遭到破坏，尤其是其作为第一限制性缺刻酶用于第二种模式(即第一限制性缺刻酶和第二限制性缺刻酶不同)的切割时，可适用于兆级别长度的DNA的操纵(比如拼接和酶切)，在目前对于超长DNA序列的操纵缺少工具的情况下，意义尤其明显。[0263] 所述的辅助单链酶切、所述的辅助双链酶切和所述的入侵式辅助双链酶切，被统称为辅助酶切。[0264] 所述的辅助酶切具有以下特点：[0265] 其最佳作用温度受所述的限制性缺刻酶的活性曲线影响，目前已知的大部分缺刻酶，其活性曲线的最高点在37摄氏度‑70摄氏度之间，尤其是50摄氏度。[0266] 其最佳作用温度还受反应缓冲液中的pH值、金属阳离子的种类和浓度以及一些添加剂的影响；[0267] 其最佳作用温度还受所述的辅单链区与所述的单链区的杂交稳定性有关，温度太高，杂交稳定性下降，会导致作为底物的结构比例下降，从而导致切割速度下降；温度太低，会使切割完成后，所述的限制性缺刻酶仍然结合在已切割底物上，导致所述的限制性缺刻酶的翻转数(turnovernumber)下降，也会降低切割的速度。因此这个最佳作用温度区间比所述的限制性缺刻酶本身的最佳作用温度区间要窄一些，有时甚至只变化3摄氏度，都能导致切割速度的成倍变化。[0268] 所述的最佳作用温度，还与所述的单链区的产生有关。温度高，所述的单链区更容易产生，因而也更有利于随后的所述的辅助单链酶切。[0269] 在一些实施方案中，所述的辅助酶切，其切割过程的温度是固定的，被称为等温辅助酶切。[0270] 在另一些实施方案中，所述的辅助酶切，其切割过程的温度是变化的，被称为不等温辅助酶切。[0271] 所述的不等温辅助酶切，是指在切割过程中充分考虑每个步骤的最佳温度，按照温度循环的方法进行酶切。所述的单链区的产生一般需要较高的温度，所述的辅助单链酶切的温度一般稍低。而且所述的限制性缺刻酶也有最佳的工作温度。让反应温度在较高和较低之间循环可以有效促进切割效率。循环的最高温在50‑75摄氏度之间，优选是55‑65度。循环的最低温在37‑55摄氏度之间，优选是45‑55度。每个循环的时间在30秒‑20分钟，优选是1分钟‑5分钟。[0272] 在一些实施方案中，在所述的辅助酶切反应体系中，添加D‑海藻糖可以提高酶切速度，D‑海藻糖的浓度为0.1M‑2M，优选是0.2M‑0.6M。[0273] 本发明的操纵双链DNA末端的方法中，用于在目标双链DNA上产生单链区的限制性缺刻酶(即第一限制性缺刻酶)和用于切割另一条链的限制性缺刻酶(即第二限制性缺刻酶)也可以是不同的。图16‑图19分别显示了用使用两种不同的限制性缺刻酶进行入侵式辅助双链酶切的酶切模式示例。[0274] 图16显示的酶切模式中，第一限制性缺刻酶是Nt系列的限制性缺刻酶，第二限制性缺刻酶是Nt系列的限制性缺刻酶。[0275] 图17显示的酶切模式中，第一限制性缺刻酶是Nb系列的限制性缺刻酶，第二限制性缺刻酶是Nb系列的限制性缺刻酶。[0276] 图18显示的酶切模式中，第一限制性缺刻酶是Nb系列的限制性缺刻酶，第二限制性缺刻酶是Nt系列的限制性缺刻酶。[0277] 图19显示的酶切模式中，第一限制性缺刻酶是Nt系列的限制性缺刻酶，第二限制性缺刻酶是Nb系列的限制性缺刻酶。[0278] 在这些图中，箭头所值为切割位置，下划线为生成单链区的缺刻酶的识别序列，粗体字为切割另一条链的缺刻酶的识别序列，背景突出的为非定制碱基(即该碱基是确定的，无法更换)。[0279] 下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。[0280] 实施例1：用限制性缺刻酶Nt.BstNBI作辅助单链酶切[0281] 1、合成一段目标寡核苷酸S(图9b，S的碱基都带下划线，包括其被切割后的碱基)，其序列为：[0282] 5’‑AACTCGTCTGCCTCGAGTAGTCTCCAGGATGTGGCACAGTAGCCCGTTGAATTTGGCA‑3’(SEQIDNO：1)[0283] 2、按照所述的间1模式，设计一个基于限制性缺刻酶Nt.BstNBI的寡核苷酸适配体G(图9a，限制性缺刻酶的识别序列已被阴影突出显示)，由一条寡核苷酸形成发夹结构组成，其序列为：[0284] 5’‑CGAGGCAGACGAGGGACTCGCAAGTGCAGTTTTCTGCACTTGCGAGTCC‑3’(SEQIDNO：2)[0285] 3、按照设计，S和G杂交后会在S的第五和第六个碱基处(图9c箭头处)发生切割，并产生一个5碱基的小片段(图9e)和仍与G杂交在一起的S的3‘端序列(图9f)。图9f的结构很快就会分开成G和缺5个碱基的S两个部分，G还可以参与下一个S的切割。而缺5个碱基的S，由于其与G的杂交稳定性不如完整的S与G的杂交，所以对反应的抑制不会很明显。[0286] 4、按照上述设计，实验步骤如下：[0287] (1)设立反应体系V，体系中存在的成分为：[0288] ①1XCutsmart(NEB公司产品)[0289] ②0.6摩尔/升的D‑海藻糖(生工)[0290] ③2微摩尔/升的寡核苷酸S[0291] ④0.2微摩尔/升的寡核苷酸适配体G[0292] ⑤2U限制性缺刻酶Nt.BstNBI[0293] ⑥补加水到10微升。[0294] (2)将反应体系V置于55摄氏度1小时。[0295] (3)取2.5微升V，作15％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶中含有4摩尔/升的尿素。电泳结果用EB染色，电泳图见图10。图中泳道1为单链寡核苷酸marker，从上到下的3条带长度分别为58碱基、48碱基和41碱基。泳道2为寡核苷酸S，其长度为58碱基。泳道3为反应产物V，是S被切断成形成的，如果切断的位置与预期一致，则会产生53碱基和5碱基的两条寡核苷酸，5碱基的寡核苷酸由于片段太小，无法被检测到，不过53碱基的片段能被检测到，其位置比泳道2中的条带稍低。泳道4是长53碱基的一条寡核苷酸，作为对照。从结果来看，这个切割位置与预期是符合的。[0296] 5、酶切速度非常快，2个单位的Nt.BstNBI的能在1小时之内将20pmol的底物完全切断。[0297] 实施例2：用限制性缺刻酶Nt.BstNBI作辅助双链酶切产生4个碱基的3’悬挂[0298] 1、基因合成一段长度为1104碱基的双链DNA序列DS，其序列为：[0299][0300] 2、这DS的第716碱基处，有一段长度为24bp的序列DB，其序列为：GAGTCTATACCACCGGAGTCGCAT，序列DB上有两个同向的Nt.BstNBI识别序列，用于产生所述的单链区。[0301] 3、按照所述的间2模式，设计一个基于限制性缺刻酶Nt.BstNBI的寡核苷酸适配体H(图11d)，限制性缺刻酶的识别序列已被阴影突出显示)，由一条寡核苷酸形成发夹结构组成，其序列为：[0302][0303] 4、按照设计，所述的辅助双链酶切会产生730bp和370bp两条双链DNA产物，其酶切过程如图11所示。图11a为目标双链DS，这里只显示与所述的辅助酶切相关的碱基，其它部分用″...″代替。图11b为已产生所述的单链区的DS，与所述的单链区互补的小片段(图11c)已从DS上离开。寡核苷酸适配体H与图11b的结构杂交，产生结构为图11e。图中箭头指示了切割的位置。切割完成后，会产生长度为730bp的所述的灭活体(图11g)和长度为370bp的带有所述的定制末端的双链DNA(图11f)，该定制末端有“ATGC”3’悬挂。图12为酶切电泳图，泳道1为未酶切的目标DNA，泳道2‑8为酶切在48、51、54、57、60、63、66摄氏度下进行1个小时的结果，泳道9为NEB公司的2‑logDNAladder。[0304] 实施例3：用限制性缺刻酶Nt.BstNBI作辅助双链酶切产生4个碱基的3’悬挂作基因拼接[0305] 1、这个实施例的目的是将一段序列连接到pET28a(+)载体上，首先是改造pET28a(+)的多克隆位点。[0306] (1)pET28a(+)的多克隆位点附近序列为：[0307] ＞MCS[0308] ...GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGGCTGCCGCGCGGCAC(SEQIDNO：5)...，其中下划线部分是多克隆位点上从XhoI‑NdeI之间的序列。[0309] (2)把下划线部分序列用以下序列代替，其中Nt.BstNBI的识别序列已通过加粗方式标出[0310][0311] (3)改造后的pET28a(+)载体被称为pET28aMoD，其多克隆位点附近的序列是：[0312] ＞newMCS[0313][0314] 2、需要克隆到pET28aMoD载体上的序列是以下序列中没有下划线的部分，下划线部分是为了与pET28aMoD的粘端GCTC/ATGG连接，所以在目标序列的5’端添加了GCTC，在3’端添加ATGG。[0315] ＞Insert[0316][0317][0318] 3、把Insert序列分成4段，在每段的两端分别添加：[0319] (1)在5’端添加[0320] (2)在3’端添加[0321] 这样得到的序列为：[0322] ＞Insert_1[0323][0324] ＞Insert_2[0325][0326] ＞Insert_3[0327][0328] ＞Insert_4[0329][0330] 4、分别用基因合成的方法合成Insert_1，Insert_2，Insert_3，Insert_4这四段序列，并用相同的一对引物PF/PR将这4段DNA用PCR的方法扩增出来，PCR产物记为P1，P2，P3和P4，这些PCR产物的序列与Insert_1，Insert_2，Insert_3，Insert_4分别一致。引物序列为：[0331] (1)PFGCAAGCTTGAGTCATTGACC(SEQIDNO：15)[0332] (2)PRTTTGAAGAGTCAACCACCAG(SEQIDNO：16)。[0333] 5、合成16种寡核苷酸适配体，每种寡核苷酸适配体都有一条寡核苷酸形成发夹结构组成，这些寡核苷酸适配体只在第十和第十一个碱基有所区别，其序列见下表1，[0334] 表1：通用适配体的16种寡核苷酸[0335][0336] 6、将表1中的寡核苷酸以等摩尔的方式混合，得到所述的通用适配体。这个通用适配体可对P1/P2/P3/P4以及pET28aMoD进行所述的辅助双链酶切，并产生4个碱基的3’悬挂。具体见附图13，图中只显示了所述的定制末端，而没有显示所述的失活体。图中相邻两种悬挂之间是互补的，因此在连接酶的作用下，可以产生环状的可用于直接转化的质粒。[0337] 7、按照上述方法，设立反应体系X如下：[0338] (1)1XCutsmart(NEB公司)[0339] (2)0.2摩尔/升的D‑海藻糖(生工)[0340] (3)总浓度为0.5微摩尔/升的通用适配体[0341] (4)2U的Nt.BstNBI(NEB公司)[0342] (5)17纳克的pET28aMoD质粒[0343] (6)各1.5纳克的PCR产物P1、P2、P3和P4[0344] (7)用水将体积补充到5微升。[0345] 8、将体系X进行1小时的所述的不等温辅助酶切，循环是在3个温度进行，分别是：64摄氏度1秒，45摄氏度1分钟，49摄氏度1分钟。[0346] 9、等循环结束后，可以进行一步70摄氏度10分钟操作，使Nt.BstNBI灭活，也可以不用。因为这个酶在10摄氏度时几乎没有活性。[0347] 10、在体系X中再加入1U的T4DNA连接酶(赛默飞)，并补充DTT到5mM，ATP到0.5mM，PEG4000到5％。在10摄氏度连接1小时。[0348] 11、取2微升体系X直接转化DH5alpha大肠杆菌，用卡那霉素抗性培养皿培养菌落。[0349] 12、第二天观察到100个左右的菌落，挑取16个菌落进行测序验证，其中14个菌落的序列与Insert序列一致，说明这个方法产生的末端与预期相符，而且不会在末端残留其它碱基，整个拼接过程是无缝的。[0350] 13、大部分序列都可以用这个方法直接克隆到pET28a(+)载体上，无需从多克隆位点上众多的限制性内切酶中寻找合适的组合。这个载体的改造方法还适用于其它载体。[0351] 实施例4：入侵式辅助双链酶切产生平末端及5‘悬挂末端[0352] 1、构建一个目标质粒P作为酶切底物，其序列如下：[0353][0354][0355] 2、在这个质粒序列中，有两处所述的同向双切法位点，可以用于所述的单链区的产生，分别位于质粒的正链和负链上。图14展示了正链上的所述的切割位点附近的序列，示意图顶部的那两个箭头已经指出了所述的同向双切法的缺刻位置，切割后，两个箭头之间的序列会脱离双链，在反链上留下所述的单链区。表2中一共有10条寡核苷酸适配体，前5条寡核苷酸适配体在反链上的切割位置已被5个向上的箭头所指示。后5条是反链上那处同向双切法位点对应的寡核苷酸适配体，其作用方式与图14相同，所以此处略过。[0356] 表2：入侵式寡核苷酸适配体[0357][0358][0359] 3、按照上述方法，设立如下反应体系(Y)：[0360] (1)1XCutsmart(NEB公司)[0361] (2)0.2摩尔/升的D‑海藻糖(生工)[0362] (3)400纳克的质粒P[0363] (4)用水将体积补充到60微升。[0364] 4、将反应体系Y作12等分，每份5微升，记为：[0365] (1)P[0366] (2)PN，补充2UNt.BstNBI[0367] (3)H4，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体H，终浓度为0.1微摩尔/升[0368] (4)G0，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体G0，终浓度为0.1微摩尔/升[0369] (5)G4，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体G4，终浓度为0.1微摩尔/升[0370] (6)G8，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体G8，终浓度为0.1微摩尔/升[0371] (7)G12，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体G12，终浓度为0.1微摩尔/升[0372] (8)K4，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体K4，终浓度为0.1微摩尔/升[0373] (9)J0，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体J0，终浓度为0.1微摩尔/升[0374] (10)J4，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体J4，终浓度为0.1微摩尔/升[0375] (11)J8，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体J8，终浓度为0.1微摩尔/升[0376] (12)J12，补充2UNt.BstNBI，再加入寡核苷酸适配体J12，终浓度为0.1微摩尔/升。[0377] 5、将上述12份样品在55摄氏度温育1小时，作1.5％琼脂糖电泳(图15)。[0378] 6、从电泳图来看，都能产生相应的线性质粒，不过酶切速度有所差别。[0379] 7、这些酶切产生的末端在测序后得到验证。[0380] 实施例5：使用不同限制性缺刻酶进行入侵式辅助双链酶切[0381] 1、在这个实施例中，用于产生单链区的酶(即第一限制性缺刻酶)是Nt.BspQI，而用于另一条链的切割的酶(即第二限制性缺刻酶)是Nt.BstNBI，甲基化酶是M.MlyI(这个甲基化酶的识别序列与Nt.BstNBI一致，所以其实现的效果与M.BstBNI是一样的)。[0382] 2、构建一个以Nt.BspQI来产生单链区的质粒，其核心区序列为(其中Nt.BstQI的识别序列已经通过加粗方式显示)：[0383][0384] 3、在同一个质粒中添加M.MlyI基因序列，其序列为：TTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAACCTATTTTAAAATATCGTGGTGGAAAAAAAGCAGAAATTCCTTTCTTTATTGACCATATACCCAATGATATCGAAACCTACTTTGAACCCTTTGTCGGGGGTGGTGCTGTATTCTTCCATTTAGAACATGAAAAATCAGTTATCAATGATATTAATTCTAAGCTTTATAAGTTCTATCTTCAATTAAAGCACAATTTTGATGAGGTAACTAAACAATTAAACGAACTACAGGAAATATATGAAAAAAACCAAAAGGAATATGAGGAAAAAAAAGCTCTTGCTCCTGCTGGTGTCAGAGTGGAAAATAAAAATGAAGAACTATATTATGAGCTAAGGAACGAATTTAACTATCCATCAGGAAAATGGCTAGACGCAGTAATTTATTATTTTATAAATAAAACTGCTTATAGTGGGATGATAAGGTATAACAGTAAAGGAGAATATAACGTTCCTTTTGGAAGATACAAAAACTTTAATACAAAAATCATTACTAAACAACACCATAACCTGCTTCAAAAAACAGAAATATATAATAAAGATTTTTCTGAAATTTTTAAGATGGCAAAACCAAATGACTTCATGTTTCTTGATCCTCCATATGATTGTATTTTTAGTGATTATGGAAATATGGAGTTTACAGGTGATTTCGACGAGAGGGAACATCGTAGGCTTGCTGAAGAGTTTAAAAACTTAAAGTGCCGTGCACTAATGATCATTAGTAAAACGGAATTAACTACCGAACTATATAAAGATTATATCGTTGATGAATATCATAAAAGCTATTCTGTAAACATTAGAAATAGATTTAAGAATGAAGCAAAGCATTATATAATCAAGAACTATGATTATGTACGAAAAAATAAAGAAGAAAAATATGAGCAACTTGAACTTATTCATTAG(SEQIDNO：45)，用于这个质粒的甲基化。[0385] 4、构建完整的质粒序列为：[0386][0387][0388][0389] 5、合成一条用于辅助酶切的寡核苷酸适配体：GEFZ69RCGCGCTTCTTATACAGCGCTTCTGTTCAAATATGTCGGACTCGCAAGTGCTTTTGCACTTGCGAGTCCG(SEQIDNO：47)，这个适配体用于产生10碱基5’突出的悬挂。[0390] 6、配制反应体系如下：[0391] (1)1Xcutsmart(NEB)[0392] (2)50mMNaCl[0393] (3)30ng目标质粒[0394] (4)2UNt.BstNBI[0395] (5)2UNt.BspQI[0396] (6)0.4μM寡核苷酸适配体[0397] 7、反应温度为55度1小时。[0398] 8、电泳检测显示全部质粒都被线性化了(见图20)。在图20中，从左至右，泳道1为上述反应体系减去Nt.BstNBI和Nt.BspQI，泳道2为上述反应体系减去Nt.BspQI，泳道3为上述反应体系，泳道4为NEB公司的DNAladder2‑log，只添加Nt.BstNBI的质粒只有极少量质粒被消化，说明质粒被甲基化后并不会被Nt.BstNBI所酶切，痕量的消化可能是Nt.BstNBI的星号活性导致。[0399] 9、通过上述方法，获得另一个线性质粒，其两侧末端的悬挂碱基刚好与这个线性质粒两侧的悬挂碱基互补，混合这两个线性质粒，不用连接，直接转化大肠杆菌可以得到大量菌落，挑取10个菌落测序验证，结果显示序列与预期相符，说明这种方法产生的末端悬挂是与预期一致的。[0400] 本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

专利地区：江苏

专利申请日期：2020-07-13

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114127284B