水稻OsRDR6蛋白质及其编码基因在调控植物雄性育性中的应用

专利名称：水稻OsRDR6蛋白质及其编码基因在调控植物雄性育性中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202010600108.X

专利申请（专利权）人：中国科学院遗传与发育生物学研究所
权利人地址：北京市朝阳区北辰西路1号院2号

专利发明（设计）人：程祝宽,刘长振,覃宝祥,李亚非,唐丁,沈懿,杜桂杰

专利摘要：本发明公开了水稻OsRDR6蛋白质及其编码基因在调控植物雄性育性中的应用。本发明克隆了水稻OsRDR6基因并详细研究了该基因在减数分裂过程中的作用，为植物育性的控制提供了新的理论依据和途径。该基因的克隆有助于了解水稻的减数分裂过程，并为人工控制水稻花粉育性提供理论基础。结合组织特异性启动子的应用，该基因有可能作为不育基因用于水稻杂交种子生产和育性控制，因此在水稻育种上具有重要意义，可以为增加水稻产量，提高水稻品质提供重要生物资源。

主权利要求：
1.突变OsRDR6蛋白质编码基因的物质在培育雄性不育水稻中的应用；
所述OsRDR6蛋白质编码基因的核苷酸序列如序列2或序列4所示；
所述雄性不育水稻为Osrdr6‑bi突变体；
所述Osrdr6‑bi突变体与盐稻8号的基因组序列的差异仅在于在编码OsRDR6蛋白的基因序列中，一条染色体上发生了一个碱基A的插入，该碱基的插入位置位于序列2第1629和
1630位之间，另一条染色体上发生了一个碱基的突变，该突变的形式为由碱基G突变为碱基T，该突变的位置位于序列2第1727位；
所述雄性不育体现为所有花粉完全败育；
所述突变OsRDR6蛋白质编码基因的物质为CRISPR‑Cas9系统，所述CRISPR‑Cas9系统包括Cas9蛋白质和sgRNA，所述sgRNA的靶序列如序列6所示。
2.一种培育雄性不育水稻的方法，包括如下步骤：通过CRISPR‑Cas9系统突变目的水稻中OsRDR6蛋白质编码基因，得到Osrdr6‑edi突变体；将Osrdr6‑edi突变体与Osrdr6‑mei突变体杂交，得到雄性不育水稻Osrdr6‑bi突变体；
所述OsRDR6蛋白质编码基因的核苷酸序列如序列2或序列4所示；
所述CRISPR‑Cas9系统包括Cas9蛋白质和sgRNA，所述sgRNA的靶序列如序列6所示；
所述Osrdr6‑bi突变体与盐稻8号的基因组序列的差异仅在于在编码OsRDR6蛋白的基因序列中，一条染色体上发生了一个碱基A的插入，该碱基的插入位置位于序列2第1629和
1630位之间，另一条染色体上发生了一个碱基的突变，该突变的形式为由碱基G突变为碱基T，该突变的位置位于序列2第1727位；
所述Osrdr6‑mei突变体与中籼3037的基因组序列的差异仅在于在编码OsRDR6蛋白的基因序列中，一条染色体上发生了一个碱基的突变，该突变的形式为由碱基G突变为碱基T，该突变的位置位于序列2第1727位，另一条染色体未发生突变；
所述雄性不育体现为所有花粉完全败育。 说明书 : 水稻OsRDR6蛋白质及其编码基因在调控植物雄性育性中的
应用技术领域[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及水稻OsRDR6蛋白质及其编码基因在调控植物雄性育性中的应用。背景技术[0002] 水稻是三大粮食作物之一，世界约1/3人口以水稻作为主粮。在我国，也约有8亿人口会以水稻作为口粮。因此，如何解决水稻长久稳定增收，仍将是未来水稻研究的主要方向。[0003] 经过20世纪60年代的矮化育种使我国水稻单产首次实现飞跃。20世纪70年代，我国开创了水稻杂种优势利用研究，以发掘不育细胞质源为突破口、以回交转育质核互作不育系为主要方法使籼型杂交稻率先在中国获得成功。杂交水稻的研制成功是当代世界农业发展史上的重大事件，使水稻单产获得了大幅度提高，创造了巨大的社会效益和经济效益。雄性不育系的利用在杂交水稻的制备和选育过程中起到了至关重要的作用，但是自然界里的自然雄性不育植株极少，鉴定困难，需耗费大量人力物力。因此，通过人工的基因工程途径获得雄性不育水稻成为一个上好的选择。[0004] 雄性不育主要是通过花粉败育而表现的。花粉的发育是一个复杂生物学的过程，由胞原细胞发育到花粉这一过程中涉及到减数分裂、有丝分裂等过程，以及绒毡层和花粉外壁等的正常发育，在这一过程中有大量的基因参与作用。CRISPR‑Cas9基因组编辑技术通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑，该技术以其简便、高效的特点，目前已经成为动植物中广泛使用的基因组编辑工具。因此可以通过CRISPR‑Cas9定点编辑的方法来完全阻断或者降低相关基因的表达，从而使花粉败育。发明内容[0005] 本发明的目的是提供水稻OsRDR6蛋白质及其编码基因在调控植物雄性育性中的应用。[0006] 为了实现上述目的，本发明首先提供了OsRDR6蛋白质的新用途。[0007] 本发明提供了OsRDR6蛋白质在调控植物雄性育性中的应用；[0008] 所述OsRDR6蛋白质是如下A1)或A2)或A3)或A4)任一所示蛋白质：[0009] A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0010] A2)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；[0011] A3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；[0012] A4)与A1)‑A3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。[0013] 为了实现上述目的，本发明还提供了与OsRDR6蛋白质相关的生物材料的新用途。[0014] 本发明提供了与OsRDR6蛋白质相关的生物材料在如下B1)‑B4)任一种中的应用：[0015] B1)调控植物雄性育性；[0016] B2)培育雄性不育植物；[0017] B3)培育雄性可育植物；[0018] B4)植物育种；[0019] 所述与OsRDR6蛋白质相关的生物材料为下述C1)至C8)中的任一种：[0020] C1)编码OsRDR6蛋白质的核酸分子；[0021] C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；[0022] C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；[0023] C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；[0024] C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；[0025] C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；[0026] C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；[0027] C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。[0028] 上述应用中，C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：[0029] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；[0030] 2)序列表中序列4所示的DNA分子；[0031] 3)来源于水稻的与1)或2)限定的DNA序列具有98％以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；[0032] 4)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；[0033] 5)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子。[0034] 上述应用中，所述调控植物雄性育性为使植物雄性可育或使植物雄性不育，具体体现在：当植物中含有OsRDR6蛋白质时，所述植物为雄性可育，当植物中不含有OsRDR6蛋白质时，所述植物为雄性不育。[0035] 为了实现上述目的，本发明还提供了抑制OsRDR6蛋白质活性的物质或抑制OsRDR6蛋白质编码基因表达的物质或敲除OsRDR6蛋白质编码基因的物质的新用途。[0036] 本发明提供了抑制OsRDR6蛋白质活性的物质或抑制OsRDR6蛋白质编码基因表达的物质或敲除OsRDR6蛋白质编码基因的物质在培育雄性不育植物中的应用。[0037] 进一步的，所述物质为CRISPR‑Cas9系统，所述CRISPR‑Cas9系统包括Cas9蛋白质和sgRNA，所述sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。[0038] 更进一步的，所述CRISPR‑Cas9系统为重组载体pCAMBIA1300‑cas9‑gRNA；所述重组载体pCAMBIA1300‑cas9‑gRNA为在pCAMBIA1300‑cas9载体的BamHI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的DNA分子后得到的载体。[0039] 为了实现上述目的，本发明还提供了一种培育雄性不育植物的方法。[0040] 本发明提供的培育雄性不育植物的方法为如下D1)或D2)：[0041] D1)包括如下步骤：抑制目的植物中OsRDR6蛋白质的活性，得到雄性不育植物；[0042] D2)包括如下步骤：抑制目的植物中OsRDR6蛋白质编码基因的表达或敲除目的植物中OsRDR6蛋白质编码基因，得到雄性不育植物。[0043] 进一步的，所述OsRDR6蛋白质编码基因为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：[0044] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；[0045] 2)序列表中序列4所示的DNA分子；[0046] 3)来源于水稻的与1)或2)限定的DNA序列具有98％以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；[0047] 4)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；[0048] 5)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子。[0049] 为了实现上述目的，本发明最后提供了一种培育雄性可育植物的方法。[0050] 本发明提供的培育雄性可育植物的方法为提高目的植物中OsRDR6蛋白质的活性和/或含量，得到雄性可育植物。[0051] 进一步的，所述提高目的植物中OsRDR6蛋白质的活性和/或含量为在目的植物中过表达OsRDR6蛋白质。[0052] 更进一步的，所述过表达的方法为将OsRDR6蛋白质编码基因导入目的植物。[0053] 在本发明的具体实施例中，所述OsRDR6蛋白质编码基因通过pCAMBIA1300‑OsRAD6导入目的植物。所述pCAMBIA1300‑OsRAD6为将序列4所示的DNA分子插入pCAMBIA1300互补载体的Sac1酶切位点间后得到的载体。[0054] 上述sgRNA或CRISPR‑Cas9系统及其在培育雄性不育植物或植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。[0055] 以上任一所述雄性可育体现为所有花粉完全可育。[0056] 以上任一所述雄性不育体现为所有花粉完全败育。[0057] 以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物为禾本科植物。所述禾本科植物为稻属植物。所述稻属植物为水稻。所述水稻具体可为盐稻8号或OsRDR6基因突变体。所述OsRDR6基因突变体具体为Osrdr6‑mei突变体。[0058] 本发明克隆了水稻OsRDR6基因并详细研究了该基因在减数分裂过程中的作用，为植物育性的控制提供了新的理论依据和途径。该基因的克隆有助于了解水稻的减数分裂过程，并为人工控制水稻花粉育性提供理论基础。结合组织特异性启动子的应用，该基因有可能作为不育基因用于水稻杂交种子生产和育性控制，因此在水稻育种上具有重要意义，可以为增加水稻产量，提高水稻品质提供重要生物资源。附图说明[0059] 图1为突变体基本表型的观察。上排为野生型的植株、去掉颖壳的小花、花粉和雌配子胚囊；下排为突变体的植株、去掉颖壳的小花、花粉和雌配子胚囊。从图中可以看出，Osrdr6‑mei突变体不能产生花粉，且胚囊未正常发育。[0060] 图2为野生型及Osrdr6‑mei突变体花粉母细胞的染色体压片观察(A)以及花药的半薄切片观察(B)。[0061] 图3为OsRDR6基因的图位克隆。[0062] 图4为Osrdr6‑mei突变体的遗传互补结果。[0063] 图5为Osrdr6‑bi突变体的染色体行为。具体实施方式[0064] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。[0065] 籼稻品种中籼3037：记载于“Wang,K.,Tang,D.,Hong,L.,Xu,W.,Huang,J.,Li,M.,Gu,M.,Xue,Y.andCheng,Z.(2010)DEPandAFORegulateReproductiveHabitinRice.PlosGenetics,6”一文中的“Zhongxian3037”，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。[0066] 粳稻品种盐稻8号：常规的水稻栽培品种，可以从江苏省盐城市明天种业科技有限公司购买。[0067] pCAMBIA1300是北京鼎国昌盛生物技术有限公司的产品，货号为MCV033。[0068] SK‑gRNA载体和pC1300‑Cas9载体(又称为pCAMBIA1300‑cas9)均记载于“Wang,C.,Shen,L.,Fu,Y.,Yan,C.,Wang,K.(2015)ASimpleCRISPR/Cas9SystemforMultiplexGenomeEditinginRice.JournalofGeneticsandGenomics42(2015)703‑706”。[0069] 根癌农杆菌EHA105：北京天恩泽生物技术有限公司，产品目录号：140383。[0070] AAM液体培养基：CaCl2·2H2O440mg，MgSO4·7H2O370mg，KH2PO4170mg，KCl2940mg，KI0.83mg，H3BO36.2mg，MnSO4·4H2O22.3mg，ZnSO4·7H2O8.6mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，CuSO4·5H2O0.03mg，CoCl2·6H2O0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB11mg，VB60.5mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2‑EDTA·2H2O37.3mg，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，谷氨酰胺0.877g，水解酪蛋白0.5g，天冬氨酸0.266g，精氨酸0.228g，甘氨酸0.075g,去离子水加至1L，pH为5.2。[0071] NB培养基：(NH4)2SO4463mg，KNO32830mg，CaCl2·2H2O166mg，MgSO4·7H2O185mg，KH2PO4400mg，KI0.8mg，H3BO31.6mg，MnSO4·4H2O4.4mg，ZnSO4·7H2O1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB11mg，VB60.5mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2‑EDTA·2H2O37.3mg，蔗糖30g，植物胶2.5g，2,4‑D2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。[0072] NBC培养基：(NH4)2SO4463mg，KNO32830mg，CaCl2·2H2O166mg，MgSO4·7H2O185mg，KH2PO4400mg，KI0.8mg，H3BO31.6mg，MnSO4·4H2O4.4mg，ZnSO4·7H2O1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB11mg，VB60.5mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2‑EDTA·2H2O37.3mg，蔗糖30g，葡萄糖10g，植物胶2.5g，2,4‑D2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.2。倒平板之前加入乙酰丁香酮(AS)并使其浓度为100μM。[0073] NBCS1培养基：NH4NO3640mg，KNO31212mg，CaCl2·2H2O588mg，MgSO4·7H2O247mg，KH2PO4136mg，KI0.83mg，H3BO33.1mg，MnSO4·4H2O11.2mg，ZnSO4·7H2O5.76mg，Na2MoO4·2H2O0.24mg，CuSO4·5H2O0.03mg，CoCl2·6H2O0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB18.5mg，VB61mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2‑EDTA·2H2O37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2,4‑D2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为100mg/l。[0074] NBCS2培养基：NH4NO3640mg，KNO31212mg，CaCl2·2H2O588mg，MgSO4·7H2O247mg，KH2PO4136mg，KI0.83mg，H3BO33.1mg，MnSO4·4H2O11.2mg，ZnSO4·7H2O5.76mg，Na2MoO4·2H2O0.24mg，CuSO4·5H2O0.03mg，CoCl2·6H2O0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB18.5mg，VB61mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2‑EDTA·2H2O37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2,4‑D2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。[0075] NBA分化培养基：NH4NO3640mg，KNO31212mg，CaCl2·2H2O588mg，MgSO4·7H2O247mg，KH2PO4136mg，KI0.83mg，H3BO33.1mg，MnSO4·4H2O11.2mg，ZnSO4·7H2O5.76mg，Na2MoO4·2H2O0.24mg，CuSO4·5H2O0.03mg，CoCl2·6H2O0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB18.5mg，VB61mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2‑EDTA·2H2O37.3mg，麦芽糖20g，脱落酸(ABA)5mg，植物胶3g，2,4‑D2mg，6‑BA2mg，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。[0076] 1/2MS培养基：NH4NO3825mg，KNO3950mg，CaCl2·2H2O220mg，MgSO4·7H2O185mg，KH2PO485mg，KI0.83mg，H3BO36.2mg，MnSO4·4H2O22.3mg，ZnSO4·7H2O8.6mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，CuSO4·5H2O0.03mg，CoCl2·6H2O0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB10.1mg，VB60.5mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2‑EDTA·2H2O37.3mg，蔗糖30g，多效唑(MET)6mg，植物胶2g，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。[0077] 实施例1、Osrdr6‑mei突变体的获取及OsRDR6基因的图位克隆[0078] 一、Osrdr6‑mei突变体的获取及表型分析[0079] 1、Osrdr6‑mei突变体的获取[0080] 以籼稻品种中籼3037种子为出发材料，经过Co60辐射诱导，获得一个水稻减数分裂异常并导致不育的突变体，将其记作Osrdr6‑mei突变体。[0081] 2、Osrdr6‑mei突变体的表型分析及细胞学表型观察[0082] 1)Osrdr6‑mei突变体的表型分析[0083] 分别在营养生长阶段和生殖生长阶段观察野生型籼稻品种中籼3037和Osrdr6‑mei突变体。[0084] 结果表明：在营养生长阶段，Osrdr6‑mei突变体与野生型籼稻品种中籼3037相比未发现明显异常，株高及分蘖数量均与野生型籼稻品种中籼3037类似。在生殖生长阶段，Osrdr6‑mei突变体表现出完全败育的表型，花药颜色偏淡且不能正常产生花粉，同时突变体中无法产生正常的雌配子胚囊(图1)。[0085] 2)Osrdr6‑mei突变体的细胞学表型观察[0086] 观察野生型籼稻品种中籼3037和Osrdr6‑mei突变体花粉母细胞减数分裂细胞学表型，具体方法如下：[0087] 2‑1)取待测样本，用卡诺氏固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3：1；体积比)固定24h。[0088] 2‑2)用解剖针将花药拨出至载玻片上，加少许醋酸洋红，用解剖针迅速将花药敲碎，使花粉母细胞游离出来，盖上盖玻片。[0089] 2‑3)取载玻片，在盖玻片一侧加适量45％醋酸水溶液，在另一侧放置一张大小合适的滤纸条，反复重复此步骤，直到将载玻片上的醋酸洋红清除干净，然后将载玻片放入液氮中浸泡20sec，迅速取出，用刀片揭去盖玻片。[0090] 2‑4)取载玻片，依次放入70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液和100％乙醇中浸泡各5min，进行梯度脱水，干燥后滴加4’,6‑Diamidino‑2‑phenylindole(DAPI)，然后用荧光显微镜观察染色体表型。[0091] 结果表明：Osrdr6‑mei突变体花粉母细胞粗线期存在不能配对的同源染色体，终变期时存在单价体。在粗线期，Osrdr6‑mei突变体的花药各层细胞与野生型相比无明显差异，花粉母细胞的外观也正常。随着花药的发育，野生型产生小孢子时，突变体内没有小孢子的产生(图2)。[0092] 二、Osrdr6‑mei突变体的图位克隆[0093] 将杂合的Osrdr6‑mei突变体植株(后代存在育性分离的单株)与粳稻品种盐稻8号进行杂交，构建得到相应的图位克隆群体，利用对F2以及F3代所有不育植株的图位克隆分析，发现Osrdr6‑mei突变体中编码水稻RDR6蛋白的LOC_Os01g34350基因编码区发生了一个G‑T的突变，并造成蛋白质序列的改变(图3)。[0094] 三、OsRDR6蛋白及其编码基因的获得[0095] 提取籼稻品种中籼3037的总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，分别进行ORF扩增、5’RACE和3’RACE，拼接后得到全长序列。全长序列编码序列表的序列1所示的蛋白质。[0096] 将序列表的序列1所示的蛋白质命名为OsRAD6蛋白，由1218个氨基酸残基组成。将编码OsRAD6蛋白的基因命名为OsRAD6基因，OsRAD6基因的开放阅读框如序列表的序列2所示。Osrdr6‑mei突变体中的OsRAD6基因的开放阅读框如序列表的序列3所示。[0097] 实施例2、转OsRDR6水稻的获得及花粉育性分析[0098] 为了确认OsRDR6基因的突变是造成突变体不育的原因，将野生型OsRDR6基因通过转基因技术导入Osrdr6‑mei突变体植株(OsRAD6基因纯合突变体)，并进一步观察突变体的育性是否可以完全恢复。具体步骤如下：[0099] 一、重组表达载体的构建[0100] 将序列4所示的DNA分子插入pCAMBIA1300互补载体的Sac1酶切位点间，得到重组表达载体pCAMBIA1300‑OsRAD6。序列4所示的DNA分子包含OsRDR6基因的编码序列，同时包含OsRDR6基因ATG上游约2.1kb的DNA序列，以及终止密码子下游约3.8kb的DNA序列。[0101] 二、农杆菌介导的遗传转化[0102] 1、取步骤一得到的重组表达载体pCAMBIA1300‑OsRAD6，将其导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。[0103] 2、将步骤1得到的重组农组菌的单菌落接种于3mL含50mg/L卡那霉素和10mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养直至OD600nm为0.6‑0.8，用含有200μM乙酰丁香酮的AAM液体培养基重悬菌体，将OD600nm值调为0.8‑1.0，得到菌悬液。[0104] 3、选取饱满的Osrdr6‑mei突变体植株(OsRAD6基因杂合突变体)上结的成熟种子，小心去除颖壳(避免胚受到损伤)。用70％酒精浸泡消毒2min后，使用0.1％HgCl2水溶液浸泡12min，无菌水冲洗5次，每次5min。[0105] 4、将经过步骤3处理后的种子在NB培养基中26℃避光培养14天以诱导愈伤组织。[0106] 5、将步骤4挑选的愈伤组织浸泡于步骤2制备的菌悬液中，侵染20min，侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后转入NBC培养基，26℃避光培养3天。[0107] 6、将步骤5培养的愈伤组织转入NBCS1培养基，26℃避光培养14天。[0108] 7、将步骤6培养的愈伤组织转入NBCS2培养基，26℃避光培养14天。[0109] 8、将步骤7生长状态较好的愈伤组织转入NBA分化培养基，26℃光照培养20天。[0110] 9、将步骤8分化出的幼苗转入1/2MS培养基，26℃光照培养至生根。[0111] 10、完成步骤9后，取出幼苗，洗净培养基，将幼苗用清水浸泡，26℃光照培养2天，然后移入大田，常规栽培管理。[0112] 11、采用pCAMBIA1300空载体替代重组表达载体pCAMBIA1300‑OsRAD6按照步骤1‑10进行操作。[0113] 三、转基因植株的PCR鉴定[0114] 1、取步骤二的10获得的植株，提取具有潮霉素抗性的植株的基因组DNA，用引物P1300F和P1300‑R进行PCR鉴定。可以扩出约629bp大小条带的植株为转基因植株，命名为转OsRDR6植株。[0115] P1300‑F：CCTTATCTGGGAACTACTCA；[0116] P1300‑R：GTGTATCACTGGCAAACTGT。[0117] 所有阳性植株中，Osrdr6‑mei突变体植株(OsRAD6基因纯合突变体)的鉴定采用Osrdr6‑mei‑F和Osrdr6‑mei‑R引物扩增后测序确定。对该对引物扩增的约3990bp片段进行检测，序列2第1727位为碱基T时，则该互补阳性植株为OsRAD6基因纯合突变体。[0118] Osrdr6‑mei‑F：AAGCAGGGAACTAACTTGTGC；[0119] Osrdr6‑mei‑R：GTACTCATTATGCACAACATC。[0120] 2、取步骤二的11获得的植株，提取具有潮霉素抗性的植株的DNA，用引物P1300F和P1300‑R进行PCR鉴定。可以扩出约629bp大小条带的植株为转空载体植株。[0121] 四、转基因植株的性状分析[0122] 按照实施例1中的方法对籼稻品种中籼3037、转OsRDR6植株、转空载体植株、Osrdr6‑mei突变体进行表型分析及细胞学表型观察。[0123] 结果表明：通过在Osrdr6‑mei纯合突变体中导入OsRAD6基因成功恢复了Osrdr6‑mei突变体的花粉育性(图4，其中，WT为籼稻品种中籼3037，Osrdr6‑mei为OsRAD6基因纯合突变体，Com为转OsRDR6植株)，而转空载体植株花粉育性没有恢复。[0124] 实施例3、Osrdr6‑bi突变体的获得及花粉育性分析[0125] 为了进一步确认OsRDR6基因的突变是造成突变体不育的原因，对OsRDR6进行了CRISPR‑Cas9定点突变，并进一步观察定点突变植株的表型是否影响植株的育性。具体步骤如下：[0126] 一、重组载体的构建[0127] 1、分别合成单链DNA分子Cas9‑Osrdr6‑edi‑F和单链DNA分子Cas9‑Osrdr6‑edi‑R，然后将它们一起退火，得到两端具有粘末端的双链DNA分子。[0128] Cas9‑Osrdr6‑edi‑F：GGCAAGTTAAGGGACAAGTCAGCT；[0129] Cas9‑Osrdr6‑edi‑R：AAACAGCTGACTTGTCCCTTAACT。[0130] 2、用限制性内切酶AarI酶切SK‑gRNA载体，回收线性化载体骨架。[0131] 3、将步骤1得到的双链DNA分子与步骤2得到的线性化载体骨架连接，得到重组载体。[0132] 4、取步骤3得到的重组载体，用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切，回收小片段。[0133] 5、取pCAMBIA1300‑cas9载体，用制性内切酶BamHI和KpnI双酶切，回收大片段。[0134] 6、将步骤4得到的小片段和步骤5得到的大片段连接，得到重组载体pCAMBIA1300‑cas9‑gRNA。对重组载体pCAMBIA1300‑cas9‑gRNA进行测序鉴定，根据测序结果，对重组载体pCAMBIA1300‑cas9‑gRNA进行结构描述如下：在pCAMBIA1300‑cas9载体的BamHI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的DNA分子，表达sgRNA。sgRNA的靶序列如下：AGTTAAGGGACAAGTCAGCT(序列6)。[0135] 二、突变株的获得[0136] 1、采用电击法将步骤一获得的重组载体pCAMBIA1300‑cas9‑gRNA导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，然后用重组农杆菌侵染野生型粳稻品种盐稻8号的胚性愈伤组织，再将其培育，获得植株，即为T0代植株。[0137] 2、提取T0代植株的基因组DNA，采用P1300F和P1300R引物对转基因株系进行鉴定。PCR扩增获得大小为629bp的植株为阳性植株。[0138] P1300F：GAGGCTGAAGAAGGCACT；[0139] P1300FR：AGAATCCTGGCTGGAACT。[0140] 3、测序[0141] 对PCR鉴定为阳性的T0代转基因株系进行全基因组测序。通过全基因组测序，鉴定结果显示，从15株T0代植株中获得3株在OsRDR6基因中发生突变且为杂合型突变的植株。与对作为遗传转化受体的盐稻8号植株相比，该突变植株的基因组序列均在编码OsRDR6蛋白质的基因序列中存在一个碱基A的插入(即发生了一个插入突变且为杂合型，该插入的碱基位于开放阅读框的1629位和1630位之间)(即序列2的第1629‑1630位之间)，并将该突变体命名为Osrdr6‑edi突变体。[0142] 4、杂交[0143] 将步骤3获得的Osrdr6‑edi突变体植株与Osrdr6‑mei突变体植株(OsRAD6基因杂合突变体)进行杂交(以Osrdr6‑edi为母本，以Osrdr6‑mei为父本)，获得杂交子代，并对杂交子代进行全基因组测序，获得Osrdr6‑bi突变体。[0144] 与盐稻8号相比，Osrdr6‑bi突变体的基因组序列的差异仅在于在编码OsRDR6蛋白的基因序列中，一条染色体上发生了一个碱基A的插入，该碱基的插入位置位于序列2第1629和1630位之间，另一条染色体上发生了一个碱基的突变，该突变的形式为由碱基G突变为碱基T，该突变的位置位于序列2第1727位。[0145] 三、育性分析[0146] 按照实施例1中的方法对野生型盐稻8号、Osrdr6‑bi突变体进行表型分析及细胞学表型观察。[0147] 结果表明：Osrdr6‑bi突变体植株营养生长正常，但植株成熟时不结种子。进一步染色体分析表明，Osrdr6‑bi突变体花粉母细胞的染色体表型和Osrdr6‑mei基本一致(图5)，主要表现为终变期存在大量单价体，单价体的存在最终导致植株败育。[0148] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：北京

专利申请日期：2020-06-28

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN113930444B