专利名称:一种基于适配体的组胺电化学传感器及其制法和在河蟹检测中的应用
专利类型:发明专利
专利申请号:CN202110365801.8
专利申请(专利权)人:南京师范大学
权利人地址:江苏省南京市栖霞区文苑路1号
专利发明(设计)人:黄和,江凌,徐生盼,张幸,李昺之
专利摘要:本发明公开了一种基于适配体的组胺电化学传感器及其制法和在河蟹检测中的应用,所述传感器首先基于电沉积的方法,在导电玻璃表面修饰花状纳米金,同时基于Au‑S键合作用,在AuNFs/ITO表面连接上巯基化修饰的组胺适配体,构建组胺电化学传感界面;水热合成制备钒酸铋纳米花球;基于硼氢化钠还原法,在钒酸铋纳米花球表面引入纳米金颗粒,自组装与组胺适配体互配的配体DNA,得到电化学探针DNA/Au@BiVO4,即所述的基于适配体的组胺电化学传感器。
主权利要求:
1.一种基于适配体的组胺电化学传感器,其特征在于,所述传感器首先基于电沉积的方法,在导电玻璃表面修饰花状纳米金,同时基于Au‑S键合作用,在AuNFs/ITO表面连接上巯基化修饰的组胺适配体,构建组胺电化学传感界面;水热合成制备钒酸铋纳米花球;基于硼氢化钠还原法,在钒酸铋纳米花球表面引入纳米金颗粒,自组装与组胺适配体互配的配体DNA,得到电化学探针DNA/Au@BiVO4,即所述的基于适配体的组胺电化学传感器;所述的组胺适配体为:
5’‑SH‑(CH2)6‑GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACATTTCTATGCTGCAGCCAACTTTTCCATACTTCCAGCTTACCATTTATCCATGCTTATTCTTGTCTCCC‑3’;
所述的配体DNA为:
5’‑SH‑(CH2)6‑GGGAGACAAGAATAAGCATGGATAAATGGTAAGCTGGAAGTATGGAAAAGTTGGCTGCAGCATAGAAATGTTAGGAGGCTCACAACAGGC‑3’。
2.一种权利要求1所述的基于适配体的组胺电化学传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)恒电位电沉积制备花状纳米金修饰电极AuNFs/ITO;
(2)制备适配体/AuNFs/ITO;
(3)制备钒酸铋BiVO4纳米花球;
(4)制备DNA/Au@BiVO4电化学探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)具体是将导电玻璃ITO清洗以除去表面污染物,然后在HAuCl4的水溶液中进行电沉积,沉积之前通N2除去溶解氧,制得花状纳米金修饰电极AuNFs/ITO。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)具体是将AuNFs/ITO超纯水洗净后,N2吹干,置于含有适配体的Tris‑acetate缓冲液中室温下避光孵育,巯基修饰的适配体通过Au‑S键合作用自组装到AuNFs/ITO表面,然后置于MCH溶液中浸泡以除去非特异性吸附活性位点;制备的适配体/AuNFs/ITO分别用PB缓冲液和超纯水润洗后,置于PB缓冲液中保存待用。
5.根据权利要求2所述的的制备方法,其特征在于,步骤(3)具体是通过水热合成制备钒酸铋纳米花球:首先将Bi(NO3)3·5H2O和Na3VO4·12H2O超声分散于水中,密封于水热反应釜,140‑180℃反应6‑10个小时,自然冷却后,将获得的产品分别用乙醇和超纯水清洗,离心分离后,真空干燥过夜制得钒酸铋纳米花球。
6.根据权利要求2所述的的制备方法,其特征在于,步骤(4)采用硼氢化钠还原法在钒酸铋表面修饰纳米金:冰水浴条件下,搅拌含有的钒酸铋、氯金酸混合液,加入冰水浴制备的硼氢化钠溶液,保持冰水浴接着搅拌,离心,取沉淀真空干燥,制得Au@BiVO4;然后,在含有Au@BiVO4的缓冲液中加入含有DNA、TCEP的混合液,避光孵育,制得DNA/Au@BiVO4的电化学探针。
7.如权利要求1所述的基于适配体的组胺电化学传感器在水产品组胺检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述水产品为河蟹。 说明书 : 一种基于适配体的组胺电化学传感器及其制法和在河蟹检测
中的应用技术领域[0001] 本发明涉及电化学传感器及其制法和应用,具体为一种基于适配体的组胺电化学传感器及其制法和在河蟹检测中的应用。背景技术[0002] 组胺(Histamine)是一种生物胺,自体活性物质之一。水产品如鱼、虾、蟹类储存的时间越长,其蛋白质中的组氨酸在微生物的作用下脱羧形成的组胺含量越高,所以组胺的含量是评价水产品新鲜度的标志之一。当人体摄入过量的组胺时,能引起过敏反应,严重时能危及生命,因此组胺的快速高灵敏实时检测具有重要的实际意义。[0003] 目前,检测组胺的主要方法有高效液相色谱法,分光光度法,毛细管电泳法以及酶联免疫吸附法等。由于组胺自身没有特异的紫外吸收基团和荧光特性,高效液相色谱法一般需要衍生以及复杂的前处理,过程繁琐,并且仪器昂贵,只适合在实验室操作;偶氮试剂显色分光光度法的样品前处理也相对比较复杂,并且检测限比较高,灵敏度较低;毛细管电泳法虽仪器简单、分离速度快、灵敏度高等优点,但其操作复杂,而且只有其中的毛细管区带电泳可直接对生物胺进行测定而不需要衍生化过程;酶联免疫吸附法为了提高检测灵敏度,常用双抗夹心的方法,导致检测的成本比较高。发明内容[0004] 发明目的:本发明的目的在于提供一种基于适配体的组胺电化学传感器,检测速度快且具有很高的灵敏度。本发明另一个目的是提供该传感器的制法。本发明还有一个目的是公开了该传感器在河蟹检测中的应用,能够很好的用于河蟹中的组胺的检测。[0005] 技术方案:本发明所述的基于适配体的组胺电化学传感器,所述传感器首先基于电沉积的方法,在导电玻璃表面修饰花状纳米金,同时基于Au‑S键合作用,在AuNFs/ITO表面连接上巯基化修饰的组胺适配体,构建组胺电化学传感界面;水热合成制备钒酸铋纳米花球;基于硼氢化钠还原法,在钒酸铋纳米花球表面引入纳米金颗粒,自组装与组胺适配体互配的配体DNA,得到电化学探针DNA/Au@BiVO4,即所述的基于适配体的组胺电化学传感器。[0006] 所述的基于适配体的组胺电化学传感器,所述的组胺适配体为:[0007] 5’‑SH‑(CH2)6‑GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACATTTCTATGCTGCAGCCAACTTTTCCATACTTCCAGCTTACCATTTATCCATGCTTATTCTTGTCTCCC‑3’。[0008] 所述的基于适配体的组胺电化学传感器,所述的配体DNA为:[0009] 5’‑SH‑(CH2)6‑GGGAGACAAGAATAAGCATGGATAAATGGTAAGCTGGAAGTATGGAAAAGTTGGCTGCAGCATAGAAATGTTAGGAGGCTCACAACAGGC‑3’[0010] 所述的基于适配体的组胺电化学传感器的制备方法,包括如下步骤:[0011] (1)恒电位电沉积制备花状纳米金修饰电极AuNFs/ITO;[0012] (2)制备适配体/AuNFs/ITO;[0013] (3)制备钒酸铋BiVO4纳米花球;[0014] (4)制备DNA/Au@BiVO4电化学探针。[0015] 所述的制备方法,步骤(1)具体是将导电玻璃ITO清洗以除去表面污染物,然后在HAuCl4的水溶液中进行电沉积,沉积之前通N2除去溶解氧,制得花状纳米金修饰电极AuNFs/ITO。[0016] 所述的制备方法,步骤(2)具体是将AuNFs/ITO超纯水洗净后,N2吹干,置于含有适配体的Tris‑acetate缓冲液中室温下避光孵育,巯基修饰的适配体通过Au‑S键合作用自组装到AuNFs/ITO表面,然后置于MCH溶液中浸泡以除去非特异性吸附活性位点;制备的适配体/AuNFs/ITO分别用PB缓冲液和超纯水润洗后,置于PB缓冲液中保存待用。[0017] 所述的的制备方法,步骤(3)具体是通过水热合成制备钒酸铋纳米花球:首先将Bi(NO3)3·5H2O和Na3VO4·12H2O超声分散于水中,密封于水热反应釜,140‑180℃反应6‑10个小时,自然冷却后,将获得的产品分别用乙醇和超纯水清洗,离心分离后,真空干燥过夜制得钒酸铋纳米花球。[0018] 所述的的制备方法,步骤(4)采用硼氢化钠还原法在钒酸铋表面修饰纳米金:冰水浴条件下,搅拌含有的钒酸铋、氯金酸混合液,加入冰水浴制备的硼氢化钠溶液,保持冰水浴接着搅拌,离心,取沉淀真空干燥,制得Au@BiVO4;然后,在含有Au@BiVO4的缓冲液中加入含有DNA、TCEP的混合液,避光孵育,制得DNA/Au@BiVO4的电化学探针。[0019] 所述的基于适配体的组胺电化学传感器在水产品组胺检测中的应用。[0020] 所述的应用,所述水产品为河蟹。[0021] 本发明涉及一种基于适配体的组胺电化学传感器,可用于河蟹等水产品中组胺的检测。当组胺存在时,适配体特异性结合组胺引起构型的变化,未结合的适配体与互配DNA杂交,将电化学探针DNA/Au@BiVO4捕获到传感器表面。钒酸铋纳米花球具有良好的过氧化物模拟酶的活性,通过检测过氧化氢的还原电流,实现对组胺的电化学检测。组胺的浓度越高,传感表面捕获的电化学探针越少,电化学信号将越低。由于组胺适配体对组胺的特异性识别,使得该传感器具有良好的选择性;花状纳米金以及钒酸铋纳米花球能够双重放大电化学信号,使得该传感器具有很高的灵敏度,图1为示意图。该传感器用于河蟹中的组胺的检测,结果与高效液相色谱法(GB5009.208—2016)一致。[0022] 有益效果:与现有技术相比,本发明具有以下显著优点:(1)采用组胺适配体作为识别基团,使得该传感器抗干扰能力强,选择性高。(2)花状纳米金作为载体连接电化学探针的同时,可增加电子转移速率,放大电化学信号;具有过氧化物模拟酶活性的钒酸铋纳米花球做电化学探针,也可起到信号放大的作用,使得该传感器具有很高的灵敏度,检测限为‑108.4×10 mol/L。(3)不需要昂贵的仪器设备,可实现便携化和微型化。(4)电化学检测操作简单,成本低廉。附图说明[0023] 图1是检测示意图;[0024] 图2中(A)是DPV检测曲线,组胺浓度分别为0、1、2、5、20、50、100、200nM;(B)是组胺检测的标准化曲线。具体实施方式[0025] 实施例1[0026] 材料:ITO,适配体,TCEP(三(2‑羧乙基)膦),MCH(6‑巯基‑1‑己醇),配体DNA[0027] 组胺适配体:[0028] 5’‑SH‑(CH2)6‑GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACATTTCTATGCTGCAGCCAACTTTTCCATACTTCCAGCTTACCATTTATCCATGCTTATTCTTGTCTCCC‑3’[0029] 配体DNA:[0030] 5’‑SH‑(CH2)6‑GGGAGACAAGAATAAGCATGGATAAATGGTAAGCTGGAAGTATGGAAAAGTTGGCTGCAGCATAGAAATGTTAGGAGGCTCACAACAGGC‑3’[0031] A、适配体/AuNFs/ITO的制备[0032] ①恒电位电沉积制备AuNFs/ITO:将导电玻璃ITO(5×10mm)用丙酮、乙醇和超纯水依次超声清洗20分钟,以除去ITO表面可能存在的污染物;然后在浓度为0.5mMHAuCl4的水溶液中进行电沉积,沉积之前通N2至少30分钟除去溶解氧,沉积电位为0.3V,沉积时间为1200s,制得花状纳米金修饰电极(AuNFs/ITO)。②适配体/AuNFs/ITO的制备:AuNFs/ITO超纯水洗净后,N2吹干,置于含有10μM适配体的25mMTris‑acetate缓冲液(pH8.0,添加0.5mMTCEP减少二硫键的形成)中室温下避光孵育过夜,巯基修饰的适配体通过Au‑S键合作用自组装到AuNFs/ITO表面,然后置于1mMMCH溶液中浸泡2小时以除去非特异性吸附活性位点。制备的适配体/AuNFs/ITO分别用pH8.0PB和超纯水润洗后,置于10mMPB缓冲液(pH8.0)中保存在4℃冰箱待用。[0033] B、DNA/Au@BiVO4电化学探针的制备[0034] ①钒酸铋(BiVO4)纳米花球的制备。水热合成制备钒酸铋纳米花球,首先将0.1mmolBi(NO3)3·5H2O和0.2mmolNa3VO4·12H2O超声分散于40mL水中,密封于80mL水热反应釜,160℃反应8个小时。自然冷却至室温后,将获得的产品分别用乙醇和超纯水清洗两次,离心分离后(10000rpm,5分钟),60℃真空干燥过夜制得钒酸铋纳米花球。[0035] ②DNA/Au@BiVO4电化学探针的制备。首先采用硼氢化钠还原法在钒酸铋表面修饰‑1纳米金。冰水浴条件下,搅拌200mL含有0.1mgmL 的钒酸铋、0.1mM氯金酸混合液0.5小时后,迅速加入5mL冰水浴制备的10mM硼氢化钠溶液,保持冰水浴接着搅拌1小时,10000rpm离心5‑1分钟,取沉淀60℃真空干燥过夜,制得Au@BiVO4。其次,在1mLAu@BiVO4(0.1mgmL ,25mMTris‑acetate缓冲液,pH8.0)中加入100μL含有15μMDNA,0.5mMTCEP的混合液,避光孵育过夜。将制得的DNA/Au@BiVO4的电化学探针用10mM,pH8.0PB缓冲液清洗两遍后,分散在1mL缓冲液(10mMTris‑HCl、1mMEDTA、50mMNaCl,pH7.4)中4℃保存待用。[0036] C、组胺的电化学检测[0037] 在适配体/AuNFs/ITO表面滴加10μL含有不同浓度组胺的PBS缓冲液(10mM,pH8.0),反应15分钟后,用PB缓冲液润洗2遍,除去可能未反应完全的组胺。然后在电极表面滴加10μLDNA/Au@BiVO4电化学探针(10mMTris‑HCl、1mMEDTA、50mMNaCl,pH7.4),室温下孵育1.5小时,随后用PB缓冲液(pH=8.0)清洗3次除去多余的探针。以此电极作为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在含有1.0mMH2O2和0.5mMTMB的0.1MPBS(pH6.5)电解质中进行差分脉冲伏安法DPV测量,扫描电位范围从0.5到‑0.1V,测量结果如图2。[0038] 实施例2[0039] 河蟹样品检测(组胺提取按GB5009.208—2016的方法):[0040] 取河蟹可食部分100g,用捣碎机充分捣碎,均分两份分别装入洁净容器中,密封并注明标记,‑20℃保存。准确称取绞碎均匀的河蟹2样品10g(精确至0.01g),加入20mL10%三氯乙酸溶液浸泡2h~3h,振荡2min混匀,滤纸过滤,准确吸取2.0mL滤液于分液漏斗中,逐滴加入氢氧化钠溶液调节pH在10~12之间,加入3mL正戊醇振摇提取5min,静置分层,将正戊醇提取液(上层)转移至10mL刻度试管中。正戊醇提取三次,合并提取液,并用正戊醇稀释至刻度。吸取2.0mL正戊醇提取液于分液漏斗中,加入3mL盐酸溶液振摇提取,静置分层,将盐酸提取液(下层)转移至10mL刻度试管中。提取三次,合并提取液,稀释至20mL。最后用PB缓冲液储备液调节pH至8.0。[0041] 在适配体/AuNFs/ITO表面滴加10μL河蟹提取液,反应15分钟后,用PB缓冲液润洗2遍,除去可能未反应完全的组胺。然后在电极表面滴加10μLDNA/Au@BiVO4电化学探针(10mMTris‑HCl、1mMEDTA、50mMNaCl,pH7.4),室温下孵育1.5小时,随后用PB缓冲液(pH=8.0)清洗3次除去多余的探针。随后在含有1.0mMH2O2和0.5mMTMB的0.1MPBS(pH6.5)电解质中进行DPV测量,对照标准曲线,测量结果见表1。[0042] 表1河蟹样品中组胺的检测[0043]
专利地区:江苏
专利申请日期:2021-04-06
专利公开日期:2024-08-30
专利公告号:CN113358716B