专利名称:一种用于制备N-乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基
专利类型:发明专利
专利申请号:CN202410831108.9
专利申请(专利权)人:山东润德生物科技有限公司
权利人地址:山东省泰安市新泰市开发区润德路78号
专利发明(设计)人:马善丽,卢健行,赵鹏,李贵伶,袁涛,曹瑞
专利摘要:本发明公开了一种用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基,属于生物发酵技术领域。培养基由以下重量份的原料组成:20‑25份的葡萄糖、8‑10份的苹果渣水解液、10‑15份的酵母粉、5‑10份的发酵助剂、5‑8份的磷酸氢二钾、0.5‑1份的硫酸铁、1‑1.5份的硫酸镁、0.2‑0.5份的氯化钙和0.8‑1份的微量元素。本发明提供的发酵培养基能够有效提高谷氨酸棒杆菌发酵制备N‑乙酰氨基葡萄糖时的产量以及发酵效率。
主权利要求:
1.一种用于谷氨酸棒杆菌发酵制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基,其特征在于,由以下重量份的原料组成:20‑25份的葡萄糖、8‑10份的苹果渣水解液、10‑15份的酵母粉、5‑
10份的发酵助剂、5‑8份的磷酸氢二钾、0.5‑1份的硫酸铁、1‑1.5份的硫酸镁、0.2‑0.5份的氯化钙和0.8‑1份的微量元素;
所述发酵助剂由甜菜碱、牛磺酸和酵母提取物按照(1‑2):(0.5‑1):(1‑2)的重量比组成;
所述苹果渣水解液由以下方法制备:
(1)将苹果渣粉碎过50‑60目筛,然后加入氯化1‑丁基‑3‑甲基咪唑,使苹果渣的质量浓度为5‑10%,然后在80‑100℃、40‑60r/min的条件下搅拌60‑90min,得到苹果渣溶液;
(2)向苹果渣溶液中加入5‑6倍体积的水,在200‑220r/min条件下搅拌40‑60min,然后在4000‑4100r/min条件下离心10‑20min,收集沉淀,50‑60℃下干燥4‑5h得到再生苹果渣;
(3)按照1g:(2‑5)ml的比例向再生苹果渣中加入水并搅拌均匀,然后加入纤维素酶,在
50‑60℃条件下水解10‑12h,最后升温至100‑110℃并维持10min,得到苹果渣水解液;
所述微量元素包括氯化钴、氯化锰和氯化铬中的一种或多种。 说明书 : 一种用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基技术领域[0001] 本发明属于生物发酵技术领域,涉及一种用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基。背景技术[0002] N‑乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc),化学名称为1‑乙酰氨基‑2‑脱氧葡萄糖,化学式为C8H15NO6,是一种被广泛应用的重要多功能单糖。N‑乙酰氨基葡萄糖作为自然界第二大天然多糖几丁质的基本组成单位,具有还原性,不仅是合成双歧因子的重要前提,还在生物体内作为多糖透明质酸、肝素和硫酸角质素的重要组成部分之一,维持着生物体正常的生理功能,在生物体正常生长代谢过程中起重要作用,在医药保健、食品和化妆品等领域都具有广阔的应用。目前,制备N‑乙酰氨基葡萄糖的方法主要由化学法、微生物发酵法和酶解法。其中,化学法是直接在高温条件下使用浓盐酸或硫酸水解几丁质,经纯化得到N‑乙酰氨基葡萄糖,但化学法生产效率低,存在安全隐患,且还需要对酸液进行处理。酶解法则是通过一种或多种酶协同催化几丁质生产N‑乙酰氨基葡萄糖,但目前酶工程的常用方法为:将微生物中能够水解几丁质的没基因异源表达至大肠杆菌表达系统以解决野生酶分离纯化困难、表达量低和酶活不高的问题。而微生物发酵法则是采用微生物菌剂进行发酵生产N‑乙酰氨基葡萄糖,微生物发酵法具有生产效率高、污染小等优点。[0003] 用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的微生物主要包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和谷氨酸棒状杆菌。大肠杆菌在发酵过程中会产生内毒素,且容易受到噬菌体的攻击;枯草芽孢杆菌具有易培养、不受噬菌体感染的特点,但是枯草芽孢杆菌自身存在的一些生理特性并不适用于工业化生产,例如在外界营养条件缺乏时会产生具有极度抗逆性的芽孢,而芽孢对于菌株的工业化生产是极其不利的,因其增加了发酵过程中对于工程菌控制的难度,容易造成工程菌对环境的污染;酿酒酵母的发酵周期长、效率低。相比于上述三种菌株,谷氨酸棒杆菌具有抗逆性高、致病性低、发酵过程中不产生孢子、不易受噬菌体侵染、不分泌胞外蛋白酶、发酵过程无明显异味产生等优点,因此它更具工业化规模生产GlcNAc的优势。[0004] 尽管重组谷氨酸棒杆菌具备合成GlcNAc的能力,但较低的产量及产率仍未满足工业化生产需求。例如,发明专利CN110195036B公开了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用,使用该工程菌发酵72h时氨基葡萄糖的产量为24.7g/L,仍有提高的空间,因此如何提高谷氨酸棒杆菌发酵制备N‑乙酰氨基葡萄糖的产量成为了工业生产亟待解决的难题。[0005] 2018‑2019年,全球苹果总产量已经超过6,860万吨,苹果加工行业每年约排出2,000万吨苹果加工副产品‑苹果渣。我国果树起源较早,水果种类较为丰富。苹果树种植面积和苹果总产量为世界总生产水平的三分之一左右,苹果产量位居世界首位,是苹果生产的第一大国。被遗弃的苹果渣会在短时间内腐败变质,最终造成环境污染和资源浪费。因此,科学、合理地开发利用苹果渣资源至关重要。发明内容[0006] 针对上述现有技术的不足,本发明的目的是提供一种用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基。[0007] 为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:[0008] 一种用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基,由以下重量份的原料组成:20‑25份的葡萄糖、8‑10份的苹果渣水解液、10‑15份的酵母粉、5‑10份的发酵助剂、5‑8份的磷酸氢二钾、0.5‑1份的硫酸铁、1‑1.5份的硫酸镁、0.2‑0.5份的氯化钙和0.8‑1份的微量元素;[0009] 所述发酵助剂由甜菜碱、牛磺酸和酵母提取物按照(1‑2):(0.5‑1):(1‑2)的重量比组成。[0010] 优选的,所述苹果渣水解液由以下方法制备:[0011] (1)将苹果渣粉碎过50‑60目筛,然后加入氯化1‑丁基‑3‑甲基咪唑并保持苹果渣质量浓度为5‑10%,然后在80‑100℃、40‑60r/min的条件下搅拌60‑90min,得到苹果渣溶液;[0012] (2)向苹果渣溶液中加入5‑6倍体积的水,在200‑220r/min条件下搅拌40‑60min,然后在4000‑4100r/min条件下离心10‑20min,收集沉淀,50‑60℃下干燥4‑5h得到再生苹果渣;[0013] (3)按照1g:(2‑5)ml的比例向再生苹果渣中加入水并搅拌均匀,然后加入纤维素酶,纤维素的加入量为25EGU;接着在50‑60℃条件下水解10‑12h,最后升温至100‑110℃并维持10min,得到苹果渣水解液。[0014] 优选的,所述微量元素包括氯化钴、氯化锰和氯化铬中的一种或多种。[0015] 本发明的有益效果:[0016] 本发明提供的发酵培养基使用了发酵助剂和苹果渣水解液,能够有效提高谷氨酸棒杆菌发酵制备N‑乙酰氨基葡萄糖时的产量以及发酵效率。其中,发酵助剂能够促进谷氨酸棒杆菌的生长速率,缩短其发酵时间,提高其发酵经济效益,而苹果渣水解液则能够为谷氨酸棒杆菌提供碳源以及其他营养物质,保证其发酵效率,提高发酵产量。具体实施方式[0017] 应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。[0018] 如前所述,谷氨酸棒杆菌相较于其他微生物具有抗逆性高等优点,更具工业化规模生产GlcNAc的优势。现有技术中已有重组谷氨酸棒杆菌合成GlcNAc的相关报道,但其产量及产率仍未满足工业化生产需求,提高谷氨酸棒杆菌发酵制备N‑乙酰氨基葡萄糖的产量成为了工业生产亟待解决的问题。[0019] 基于此,本发明提供了一种用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基,其中包含发酵助剂和苹果渣水解液等原料,其中发酵助剂,即甜菜碱、牛磺酸和酵母提取物,能够加快谷氨酸棒杆菌的生长速率,缩短其发酵时间,提高其发酵经济效益。苹果渣本身含有丰富的可溶性碳水化合物(果糖、葡萄糖和蔗糖等)和不溶性碳水化合物(纤维素、半纤维素和果胶等),将苹果渣水解后所得水解液能够在发酵时为谷氨酸棒杆菌提供丰富的营养。[0020] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。[0021] 说明:以下所使用酵母提取物购自西格玛奥德里奇生化科技有限公司,货号为Y1625;纤维素酶购自西格玛奥德里奇生化科技有限公司,货号为C2605;苹果渣为市售红富士苹果的加工副产物。[0022] 谷氨酸棒杆菌为以S9114为出发菌株的重组谷氨酸棒杆菌,重组菌株的构建方法参考发明专利CN110195036B中实施例1‑实施例2。[0023] 谷氨酸棒杆菌的活化方法为:[0024] 将谷氨酸棒杆菌按10%(v/v)的接种量接种于活化培养基,在200r/min、30℃条件下培养16h。活化培养基为:蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖5g/L,琼脂20g/L,pH7.0。[0025] 苹果渣水解液的制备方法为:[0026] (1)将苹果渣粉碎过60目筛,然后加入氯化1‑丁基‑3‑甲基咪唑,使苹果渣的质量浓度为5%,然后在100℃、60r/min的条件下搅拌90min,得到苹果渣溶液;[0027] (2)向苹果渣溶液中加入6倍体积的水,在220r/min条件下搅拌60min,然后在4000r/min条件下离心20min,收集沉淀,60℃下干燥5h得到再生苹果渣;[0028] (3)按照1g:5ml的比例向再生苹果渣中加入水并搅拌均匀,然后加入纤维素酶,纤维素的加入量为25EGU;接着在60℃条件下水解12h,最后升温至100℃并维持10min灭活纤维素酶,得到苹果渣水解液。[0029] 实施例1:用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基。[0030] 发酵培养基由以下重量份的原料组成:25份的葡萄糖、10份的苹果渣水解液、15份的酵母粉、10份的发酵助剂、8份的磷酸氢二钾、1份的硫酸铁、1.5份的硫酸镁、0.5份的氯化钙和1份的微量元素;[0031] 所述发酵助剂由甜菜碱、牛磺酸和酵母提取物按照1:0.5:1的重量比组成。[0032] 实施例2:用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基。[0033] 发酵培养基由以下重量份的原料组成:20份的葡萄糖、8份的苹果渣水解液、10份的酵母粉、5份的发酵助剂、5份的磷酸氢二钾、0.5份的硫酸铁、1份的硫酸镁、0.2份的氯化钙和0.8份的微量元素;[0034] 所述发酵助剂由甜菜碱、牛磺酸和酵母提取物按照2:1:2的重量比组成。[0035] 实施例3:用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵培养基。[0036] 发酵培养基由以下重量份的原料组成:23份的葡萄糖、9份的苹果渣水解液、12份的酵母粉、6份的发酵助剂、6份的磷酸氢二钾、0.8份的硫酸铁、1.3份的硫酸镁、0.3份的氯化钙和0.9份的微量元素;[0037] 所述发酵助剂由甜菜碱、牛磺酸和酵母提取物按照1.5:0.8:1.5的重量比组成。[0038] 对比例1:一种发酵培养基。[0039] 本对比例与实施例1中发酵培养基的区别在于,发酵培养基不含发酵助剂和苹果渣水解液。[0040] 对比例2:一种发酵培养基。[0041] 本对比例与实施例1中发酵培养基的区别在于,发酵培养基不含发酵助剂。[0042] 对比例3:一种发酵培养基。[0043] 本对比例与实施例1中发酵培养基的区别在于,发酵培养基不含苹果渣水解液。[0044] 试验例:N‑乙酰氨基葡萄糖产量的测定。[0045] (1)试验方法:[0046] 取实施例1、对比例1‑3的发酵培养基进行发酵,发酵步骤为:[0047] 将谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中,在30℃、220条件下发酵培养,接种量为发酵培养基体积的6%,气通量为2vvm,氧溶解量为25%。[0048] 于发酵第70h时取各组发酵液,检测N‑乙酰氨基葡萄糖的含量。N‑乙酰氨基葡萄糖含量检测方法为:[0049] 使用Agilent1260,RID检测器,HPX‑87H柱(Bio‑RadHercules,CA),流动相:5mMH2SO4,流速0.6mL/min,柱温40℃,进样体积为10μL。[0050] (2)试验结果:[0051] 表:发酵70h时N‑乙酰氨基葡萄糖产量[0052] 由上述数据可知,在发酵培养基中添加苹果渣水解液能够提高谷氨酸棒杆菌发酵制备N‑乙酰氨葡萄糖的产量和发酵效率,且苹果渣水解液与甜菜碱等发酵助剂之间起到了协同作用。[0053] 以上所述仅为本发明的较佳实施例,并非用以限制本发明实施应用,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何实施应用的修改、等同替换等,均应包含在本发明的保护范围之内。
专利地区:山东
专利申请日期:2024-06-26
专利公开日期:2024-09-03
专利公告号:CN118374562B