专利名称:一种多重竞争检测方法及试剂盒
专利类型:发明专利
专利申请号:CN202410711169.1
专利申请(专利权)人:天津中新科炬生物制药股份有限公司
权利人地址:天津市滨海新区经济技术开发区第六大街65号
专利发明(设计)人:范永刚,赵娜,杜瑶,孟佳,秦月,周洪锐,李昀地,王俊水,武鹏,李慧,肖福磊
专利摘要:本发明提供了一种多重竞争检测方法,所述方法包括:使样本与待测物特异性抗体和待测物特异性抗体‑信号分子复合物结合,形成首次竞争,剩余待测物特异性抗体和待测物特异性抗体‑信号分子复合物竞争结合待测物重组抗原,形成再次竞争;根据待测物特异性抗体‑信号分子复合物与待测物重组抗原的结合量分析样本中待测物含量。本发明采用多重竞争法,针对传统竞争方法其灵敏度更高,通过二次竞争得到正向结果显示,检测线性范围更宽。
主权利要求:
1.一种多重竞争检测方法,其特征在于:所述方法包括:
(a)使样本与待测物特异性抗体和待测物特异性抗体‑信号分子复合物结合,形成首次竞争,剩余待测物特异性抗体和待测物特异性抗体‑信号分子复合物竞争结合待测物重组抗原,形成再次竞争;
(b)根据待测物特异性抗体‑信号分子复合物与待测物重组抗原的结合量分析样本中待测物含量;随着待测物的增加,待测物特异性抗体的消耗增加,待测物重组抗原结合待测物特异性抗体‑信号分子复合物会越来越多,检测线出线颜色越来越深,实现待测物浓度与显示结果的正相关;
待测物特异性抗体和待测物特异性抗体‑信号分子复合物中待测物特异性抗体含量为
5‑30:1。
2.根据权利要求1所述的一种多重竞争检测方法,其特征在于:样本与待测物特异性抗体结合前还包括:样本与红细胞单抗‑磁珠偶联物结合去除红细胞。
3.根据权利要求1所述的一种多重竞争检测方法,其特征在于:样本与待测物特异性抗体结合前还包括:样本与解离剂结合,分解成游离的待测物和相应的结合蛋白。
4.一种多重竞争检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括依次设置的层析垫2、层析垫3、检测线,层析垫2中包被有待测物特异性抗体,层析垫3中包被有待测物特异性抗体‑信号分子复合物,检测线包被有待测物重组抗原;随着待测物的增加,待测物特异性抗体的消耗增加,待测物重组抗原结合待测物特异性抗体‑信号分子复合物会越来越多,检测线出线颜色越来越深,实现待测物浓度与显示结果的正相关;
待测物特异性抗体和待测物特异性抗体‑信号分子复合物中待测物特异性抗体含量为
5‑30:1。
5.根据权利要求4所述的一种多重竞争检测试剂盒,其特征在于:所述信号分子采用胶体金、纳米银、有色金属、高纯稀土氧化物、荧光微球、乳胶微球、磁珠、硅球纳米材料、稀土金属化合物、半导体发光材料中的一种。
6.根据权利要求4所述的一种多重竞争检测试剂盒,其特征在于:还包括加样垫,加样垫中包被有红细胞单抗‑磁珠偶联物,加样垫下方设有磁吸装置。
7.根据权利要求4所述的一种多重竞争检测试剂盒,其特征在于:还包括质控线,质控线包被有二抗。
8.根据权利要求4所述的一种多重竞争检测试剂盒,其特征在于:层析垫2和加样垫之间还设有层析垫1,层析垫1中干燥有解离剂;
所述解离剂的组成为:0.1‑1M的Tris溶液、0.1‑1%的柠檬酸钠溶液、0.05‑1mg/ml的二硫苏糖醇、0.1‑3%的SDS溶液、0.1‑5mg/ml的盐酸胍溶液;
所述Tris溶液的pH为7‑8。
9.根据权利要求4‑8任一项所述的多重竞争检测试剂盒使用权利要求1‑3任一项的多重竞争检测方法进行检测的应用。
10.根据权利要求4‑8任一项所述的多重竞争检测试剂盒在制备多重竞争检测产品中的应用。 说明书 : 一种多重竞争检测方法及试剂盒技术领域[0001] 本发明属于检测试剂盒技术领域,尤其是涉及一种多重竞争检测方法及试剂盒。背景技术[0002] 血液通过循环系统与全身各组织器官密切联系,参与机体呼吸、运输、防御、调节体液渗透压和酸碱平衡等各项生理活动,维持机体正常新陈代谢和内外环境的平衡,在病理情况下,造血系统的各种疾患,除直接累及血液外,常会影响全身各组织器官,例如贫血患者,由于血液携带氧功能降低,可使全身各器官缺氧,导致循环、消化、神经、泌尿等系统出现相应的临床症状和体征;反之各组织器官的病变也可直接或间接地引起血液发生相应的变化,例如全身各组织的感染性炎症可引起血液内白细胞总数和分类计数的改变,因此,血液检验不仅是诊断各种血液病的主要依据,对其他系统疾病的诊断和鉴别诊断也可提供许多信息,是临床检验中最常用、最重要的基本的措施。[0003] 人体内的血液中存在各种物质成分,各种物质成分在体内的含量和浓度变化是反映人体健康机能的指标,运用生化技术和免疫原理,可以在从人体采集的血液中测定各种成分的含量和浓度值,从而指导临床医师对病患的诊断和治疗。[0004] 现有检测技术中,检测前需要对样本进行滤血、解离等前处理,操作步骤复杂,且反应灵敏度、结果准确性有待提高。发明内容[0005] 有鉴于此,本发明旨在提出一种多重竞争检测方法及试剂盒,以解决检测步骤复杂、反应灵敏度低、结果准确性差的问题。[0006] 为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:[0007] 本发明第一方面提供了一种多重竞争检测方法,所述方法包括:[0008] (a)使样本与待测物特异性抗体和待测物特异性抗体‑信号分子复合物结合,形成首次竞争,剩余待测物特异性抗体和待测物特异性抗体‑信号分子复合物竞争结合待测物重组抗原,形成再次竞争;[0009] (b)根据待测物特异性抗体‑信号分子复合物与待测物重组抗原的结合量分析样本中待测物含量。[0010] 进一步的,样本与待测物特异性抗体结合前还包括:样本与红细胞单抗‑磁珠偶联物结合去除红细胞。[0011] 进一步的,样本与待测物特异性抗体结合前还包括:样本与解离剂结合,分解成游离的待测物和相应的结合蛋白。[0012] 本发明第二方面提供了一种多重竞争检测试剂盒,所述试剂盒包括依次设置的层析垫2、层析垫3、检测线,层析垫2中包被有待测物特异性抗体,层析垫3中包被有待测物特异性抗体‑信号分子复合物,检测线包被有待测物重组抗原。[0013] 进一步的,所述层析垫2中包被有待测物特异性鼠抗体,层析垫3中包被有待测物特异性鼠抗体‑信号分子复合物。[0014] 进一步的,层析垫2和层析垫3中包被的待测物特异性抗体含量为5‑30:1。[0015] 进一步的,信号分子采用胶体金、纳米银、有色金属、高纯稀土氧化物、荧光微球、乳胶微球、磁珠、硅球纳米材料、稀土金属化合物、半导体发光材料中的一种。[0016] 进一步的,所述待测物特异性抗体‑信号分子复合物的制备方法为:[0017] (1)使用pH为7.0的PB溶液将待测物特异性抗体稀释至0.01‑2mg/mL,取信号分子溶液1mL,向其中加入稀释后的待测物特异性抗体,室温反应30min;[0018] (2)封闭:向反应后的信号分子‑待测物特异性抗体溶液中加入5μL5%的BSA溶液,室温反应15min,离心去上清液;[0019] 离心速度为10000r/min,离心时间为10min;[0020] (3)复溶:加入pH为7.0的PBS溶液100μL,重悬沉淀,4℃保存备用。[0021] 进一步的,还包括加样垫,加样垫中包被有红细胞单抗‑磁珠偶联物,加样垫下方设有磁吸装置。[0022] 所述红细胞单抗‑磁珠偶联物的制备方法为:[0023] (1)取粒径为5‑7μm的活化好的磁珠100μL到1.5mL离心管中,磁性分离后取出上清液;[0024] (2)偶联抗体:使用pH为7.0的PBS缓冲液将人红细胞单抗稀释至0.1‑2mg/mL,向活化后的磁珠中加入稀释后的人红细胞单抗,混匀,室温反应30min,反应结束后磁吸去上清;[0025] (3)封闭:加入5%的BSA溶液重悬反应后的磁珠,室温反应30min,磁吸去上清,重悬于pH为7.0的PBS缓冲液,4℃保存备用。[0026] 所述磁珠为羧基磁性高分子微珠。[0027] 进一步的,还包括质控线,质控线包被有二抗。[0028] 进一步的,所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。[0029] 质控线上包被的二抗结合待测物特异性抗体‑信号分子复合物,检测样本时,无论样本呈阴性还是阳性,质控线均出现红色色带,表示试剂检测正常。[0030] 进一步的,层析垫2和加样垫之间还设有层析垫1,层析垫1中干燥有解离剂;[0031] 所述解离剂的组成为:0.1‑1M的Tris溶液、0.1‑1%的柠檬酸钠溶液、0.05‑1mg/ml的二硫苏糖醇、0.1‑3%的SDS溶液、0.1‑5mg/ml的盐酸胍溶液;[0032] 所述Tris溶液的pH为7‑8。[0033] 进一步的,所述多重竞争检测试剂盒使用第一方面所述多重竞争检测方法进行检测。[0034] 本发明的第三方面提供了本发明第二方面所述多重竞争检测试剂盒使用本发明的第一方面所述的多重竞争检测方法进行检测的应用。[0035] 本发明的第四方面提供了本发明第二方面所述多重竞争检测试剂盒在制备多重竞争检测产品中的应用。[0036] 进一步的,所述多重竞争检测产品应用第一方面所述检测方法。[0037] 进一步的,应用所述试剂盒进行检测的方法,包括以下步骤:[0038] 取20mL样本加入到加样孔中,待样本渗透完全后,再加入100mL稀释液,10‑15min后将试剂卡插入免疫荧光分析仪读取结果。[0039] 所述免疫荧光分析仪型号为NS3001型/NS5001型/NS7001型/NS7001PHTS型/NS7001BRDI型等免疫层析结果判读记录仪。[0040] 进一步的,所述样本为指尖血或静脉血。[0041] 本发明的反应原理为:[0042] 当样本经过干燥有抗体和抗体‑胶体金复合物的层析垫时进行首次竞争,流经检测线时进行再次竞争,最终以正相关关系对检测结果进行表达。[0043] 具体的,当阴性样本(全血)流经加样垫时,红细胞首先与红细胞单抗‑磁珠复合物结合,形成红细胞聚集物,并在磁吸装置的作用下沉积在加样垫底部,而血浆物质将继续向上层析;血浆首先流经层析垫1,与解离剂进行反应,因为阴性样本中不存在待测物质与其结合蛋白的复合物,所以在层析垫1不发生反应;血浆继续向上层析,依次流经层析垫2和层析垫3,因为不存在待测抗原,所以在层析垫2和层析垫3均不发生反应;层析垫2中的待测物特异性抗体、层析垫3中的待测物特异性抗体‑信号分子复合物中的待测物特异性抗体按照一定比例进行反应,当其同时到达检测线时,由于没有结合胶体金的待测物特异性抗体的量远远超过结合胶体金的待测物特异性抗体,所以在瞬时反应过程中,检测线所包被的抗原首先被待测物特异性抗体结合完全,则没有空余表位与待测物特异性抗体‑信号分子复合物再进行结合,故不会出线,检测视窗仅存在一条质控线。[0044] 当阳性样本(全血)流经加样垫时,红细胞首先与红细胞单抗‑磁珠复合物结合,形成红细胞聚集物,并在磁吸装置的作用下沉积在加样垫底部,而血浆物质将继续向上层析;血浆首先流经层析垫1,待测物质与其结合蛋白复合物经解离剂作用,将分解成游离的待测物质和相应的结合蛋白;游离的待测物质继续流经至层析垫2,首先与待测物特异性抗体进行结合,剩余的待测物特异性抗体与待测物特异性抗体‑信号分子复合物流经检测线时则竞争结合检测线所包被的抗原。若剩余待测物特异性抗体的量仍然远远超过待测物特异性抗体‑信号分子复合物,则在瞬时反应过程中,待测物特异性抗体瞬间结合所有表位,检测线仍然不会出线;但是随着结合待测物质的量的增加,剩余待测物特异性抗体的量越来越少时,直至待测物特异性抗体的量与待测物特异性抗体‑信号分子复合物的量接近时,则两者与检测线包被抗原结合的机会相当;当剩余待测物特异性抗体的量少于待测物特异性抗体‑信号分子复合物的量时,则检测线包被抗原在瞬时反应过程中会被待测物特异性抗体‑信号分子复合物所结合,所以随着待测物质的增加,待测物特异性抗体的消耗增加,检测线抗原结合待测物特异性抗体‑信号分子复合物会越来越多,检测线出线颜色越来越深。[0045] 由此实现待测物质浓度与显示结果的正相关。[0046] 相对于现有技术,本发明所述的一种多重竞争检测方法及试剂盒具有以下优势:[0047] (1)本发明所述的多重竞争法,双抗体同时竞争抗原,灵敏度更高,检测范围更广,检测结果较传统方法学更准确;[0048] (2)本发明所述的待测物特异性抗体经胶体金颗粒修饰提高与抗原结合的亲和力,通过调整待测物特异性抗体‑信号分子复合物与待测物特异性抗体之间的比例提高反应灵敏度和结果准确性,同时也可以通过调整比例实现拓宽检测范围;[0049] (3)对于需要解离剂的样本,本发明实现解离剂与检测试剂一体化,无需单独准备解离剂进行反应,加样后随反应进行样本可在试剂中实现解离;[0050] (4)本发明在试剂内可实现滤血功能,无需单独对样本进行处理,磁珠结合红细胞单抗形成的复合物能够强有效的吸附红细胞,使其沉降在加样垫底部,更加有效、快速的实现全血分离,消除红细胞对于试剂检测过程的干扰,检测结果更加准确、准确度更高。附图说明[0051] 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:[0052] 图1为本发明实施例1所述的层析垫2中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物含量为5:1的线性分析曲线图;[0053] 图2为本发明实施例1所述的层析垫2中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物含量为10:1的线性分析曲线图;[0054] 图3为本发明实施例1所述的层析垫2中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物含量为20:1的线性分析曲线图;[0055] 图4为本发明实施例1所述的层析垫2中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物含量为30:1的线性分析曲线图;[0056] 图5为本发明实施例1所述的层析垫2中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物含量为40:1的线性分析曲线图;[0057] 图6为本发明实施例1所述的层析垫2中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物含量为50:1的线性分析曲线图。具体实施方式[0058] 需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。[0059] 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。[0060] 实施例1[0061] 以25‑羟基维生素D定量检测试剂为实施例。[0062] 制备过程:[0063] 红细胞单抗‑磁珠制备:取粒径为7μm的活化后的羧基磁性高分子微珠100μL到1.5mL离心管中,磁性分离后取出上清液;使用pH为7.0的PBS缓冲液将人红细胞单抗稀释至0.5mg/mL,向活化后的羧基磁性高分子微珠中加入稀释后的人红细胞单抗,混匀,室温反应30min,反应结束后磁吸去上清;加入5%的BSA溶液重悬反应后的羧基磁性高分子微珠,室温反应30min,磁吸去上清,重悬于pH为7.0的PBS缓冲液,干燥于加样垫。[0064] 所述羧基磁性高分子微珠购买于武汉新纵科生物技术有限公司;所述人红细胞单抗购买于南京佛晓生物,货号T112601M。[0065] 解离剂制备:取1M的pH为7.4的Tris溶液10mL、1%的柠檬酸钠溶液5mL、0.5mg/ml的二硫苏糖醇10mL、2%的SDS溶液5mL、2mg/ml的盐酸胍溶液5mL、水65mL,混匀后干燥于层析垫1。[0066] 层析垫2包被25‑羟基维生素D特异性鼠抗体。[0067] 25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物制备:使用pH为7.0的PB溶液将25‑羟基维生素D特异性鼠抗体稀释至0.2mg/mL,取胶体金溶液1mL,向其中加入稀释后的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体,室温反应30min;向反应后的胶体金‑25‑羟基维生素D特异性鼠抗体溶液中加入5μL5%的BSA溶液,室温反应15min,离心去上清液,离心速度为10000r/min,离心时间为10min;加入pH为7.0的PBS溶液100μL,重悬沉淀,干燥于层析垫3。[0068] 检测线包被25‑羟基维生素D重组抗原,质控线包被羊抗鼠IgG抗体。[0069] 检测过程:[0070] 取20mL指尖血或者静脉血加入到加样孔中,待样本渗透完全后再加入100mL稀释液,10‑15min后将试剂卡插入免疫荧光分析仪读取结果。[0071] 对比试剂:[0072] 试剂盒名称:25‑羟基维生素D检测试剂盒;厂家:罗氏诊断试剂;方法学:电化学发光;竞争方法,包被抗原,标记抗体;仪器:罗氏全自动电化学发光免疫分析仪(cobase411、cobase601、cobase602)。[0073] 检测结果:[0074] 本发明检测试剂与对比试剂比较,数据如下:[0075] (1)检测效率[0076] 表125‑羟基维生素D检测试剂与对比试剂检测时间对比[0077][0078] 由表1可知,本发明所制备的25‑羟基维生素D检测试剂无需单独将样本解离,较对比试剂所需检测时间少5min,效率更高。[0079] (2)灵敏度、检测限分析[0080] 表225‑羟基维生素D检测试剂与对比试剂灵敏度和检测限对比[0081][0082] 选取25‑羟基维生素D浓度为0.5ng/mL、4.1ng/mL和32.2ng/mL的定值样本,进行灵敏度和准确性的对比。[0083] 由表2可知,对比试剂线性范围为4‑70ng/mL,本发明25‑羟基维生素D检测试剂线性范围为0.5‑70ng/mL,本发明检测线性范围更宽,灵敏度更高,同一样本的准确度也更高。[0084] (3)相关性分析[0085] 表3不同比例试剂对定值样本实际检测值[0086][0087] 将层析垫2中的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物比例设置为1:5、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1和50:1,同时测试定值样本,将其检测结果与定值样本真实值进行相关性分析。[0088] 由表3可知,当层析垫2中的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物比例设置为1:5、1:1、2:1、3:1、4:1时,层析垫2中所含25‑羟基维生素D特异性鼠抗体的量少,导致剩余量不足,进而导致层析垫3中25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物增加了与检测线包被的25‑羟基维生素D重组抗原结合的机会,导致检测结果过高,相关性较差;当比例设置为5:1、10:1、20:1和30:1时,则其相关性良好;当其比例高于40:1时,则由于层析垫2中的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体量过多而导致的灵敏度下降。[0089] (4)准确度分析[0090] 表4不同比例对定值15.5ng/mL的样本的检测值及准确度[0091][0092] 表5不同比例对定值52.6ng/mL的样本的检测值及准确度[0093][0094] 选取层析垫2中的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物比例5:1、10:1、20:1和30:1进行准确度分析,选择25‑羟基维生素D浓度为15.5ng/mL和52.6ng/mL的两个定值样本。[0095] 由表4和表5可知,在两个浓度下,将层析垫2中的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体与层析垫3中的25‑羟基维生素D特异性鼠抗体‑胶体金复合物的比例设置为10:1时准确度更高。[0096] 实施例2[0097] 以丙型肝炎抗原检测试剂(定性产品)为实施例。[0098] 制备过程:[0099] 红细胞单抗‑磁珠制备:取粒径为7μm的活化后的羧基磁性高分子微珠100μL到1.5mL离心管中,磁性分离后取出上清液;使用pH为7.0的PBS缓冲液将人红细胞单抗稀释至0.5mg/mL,向活化后的羧基磁性高分子微珠中加入稀释后的人红细胞单抗,混匀,室温反应30min,反应结束后磁吸去上清;加入5%的BSA溶液重悬反应后的羧基磁性高分子微珠,室温反应30min,磁吸去上清,重悬于pH为7.0的PBS缓冲液,干燥于加样垫。[0100] 解离剂制备:无需解离剂。[0101] 层析垫2包被丙型肝炎特异性鼠抗体。[0102] 丙型肝炎特异性鼠抗体‑胶体金复合物制备:使用pH为7.0的PB溶液将丙型肝炎特异性鼠抗体稀释至0.2mg/mL,取胶体金溶液1mL,向其中加入稀释后的丙型肝炎特异性鼠抗体,室温反应30min;向反应后的胶体金‑丙型肝炎特异性鼠抗体溶液中加入5μL5%的BSA溶液,室温反应15min,离心去上清液,离心速度为10000r/min,离心时间为10min;加入pH为7.0的PBS溶液100μL,重悬沉淀,干燥于层析垫3。[0103] 检测线包被丙型肝炎重组抗原,质控线包被羊抗鼠IgG抗体。[0104] 检测过程:[0105] 取20mL指尖血或者静脉血加入到加样孔中,待样本渗透完全后再加入100mL稀释液,10‑15min后将试剂卡插入免疫荧光分析仪读取结果。[0106] 对比试剂:[0107] 试剂盒名称:丙型肝炎病毒检测试剂盒;厂家:广州健仑生物科技有限公司;方法学:胶体金法;竞争方法,包被抗原,标记抗体;仪器:无需仪器,肉眼观察。[0108] 检测结果:[0109] 本发明检测试剂与对比试剂比较,选取50例丙型肝炎阴性临床样本,100例丙型肝炎阳性临床样本,数据如下:[0110] 表6本发明试剂与对比试剂样本符合性对比结果[0111][0112] 由表6可知,本发明所制备的丙型肝炎抗原检测试剂检测临床样本的阴性样本、阳性样本符合率均可达100%;而对比试剂由于竞争法在灵敏度以及线性范围的局限性,阴性样本符合率为100%,阳性样本符合率为98%。[0113] 本发明采用二次竞争法,针对传统竞争方法其灵敏度更高,通过二次竞争得到正向结果显示,检测线性范围更宽。[0114] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
专利地区:天津
专利申请日期:2024-06-04
专利公开日期:2024-09-03
专利公告号:CN118275671B