一种长链非编码RNA及其应用发明专利

专利名称：一种长链非编码RNA及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410705614.3

专利申请（专利权）人：北京市肿瘤防治研究所
权利人地址：北京市海淀区阜成路52号

专利发明（设计）人：刘小锋,辛泽昌,王崑

专利摘要：本发明公开了一种长链非编码RNA及其应用，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该长链非编码RNA在结直肠癌患者、结直肠癌化疗耐药患者、结直肠癌预后不良患者的肿瘤组织中高表达，当抑制该长链非编码RNA的表达后，能显著减缓肿瘤生长，降低耐药性。基于此，本发明还提供了该长链非编码RNA作为生物标志物和靶点在制备诊断和治疗结直肠癌相关药物中的应用，扩大了结肠癌耐药的诊断治疗药物选择。

主权利要求：
1.抑制长链非编码RNA表达的产品在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
抑制长链非编码RNA表达的产品为shRNA或寡核苷酸；
所述shRNA的核苷酸序列如下shRNA1、shRNA2的任意一组：shRNA1：
shRNA1F：
CCGGCACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTGTTTTTG，shRNA1R：AATTCAAAAACACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTG；
shRNA2：
shRNA2F：
CCGGGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTCTTTTTG，shRNA2R：AATTCAAAAAGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTC；
所述寡核苷酸的核苷酸序列如下所示：TACTATGCATGACCATTGTG。
2.抑制长链非编码RNA表达的产品在制备逆转结直肠癌化疗耐药的药物中的应用，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
抑制长链非编码RNA表达的产品为shRNA或寡核苷酸；
所述shRNA的核苷酸序列如下shRNA1、shRNA2的任意一组：shRNA1：
shRNA1F：
CCGGCACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTGTTTTTG，shRNA1R：AATTCAAAAACACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTG；
shRNA2：
shRNA2F：
CCGGGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTCTTTTTG，shRNA2R：AATTCAAAAAGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTC；
所述寡核苷酸的核苷酸序列如下所示：TACTATGCATGACCATTGTG。
3.抑制长链非编码RNA表达的产品联合结直肠癌化疗药在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
抑制长链非编码RNA表达的产品为shRNA或寡核苷酸；
所述shRNA的核苷酸序列如下shRNA1、shRNA2的任意一组：shRNA1：
shRNA1F：
CCGGCACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTGTTTTTG，shRNA1R：AATTCAAAAACACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTG；
shRNA2：
shRNA2F：
CCGGGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTCTTTTTG，shRNA2R：AATTCAAAAAGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTC；
所述寡核苷酸的核苷酸序列如下所示：TACTATGCATGACCATTGTG。
4.一种用于抑制长链非编码RNA表达的shRNA，其特征在于，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述shRNA的核苷酸序列如下shRNA1、shRNA2的任意一组：shRNA1：
shRNA1F：
CCGGCACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTGTTTTTG，shRNA1R：AATTCAAAAACACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTG；
shRNA2：
shRNA2F：
CCGGGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTCTTTTTG，shRNA2R：AATTCAAAAAGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTC。
5.一种用于抑制长链非编码RNA表达的寡核苷酸，其特征在于，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述寡核苷酸的核苷酸序列如下所示：TACTATGCATGACCATTGTG。 说明书 : 一种长链非编码RNA及其应用技术领域[0001] 本发明涉及疾病诊断、治疗技术领域，具体涉及一种长链非编码RNA及其在结直肠癌相关诊断、治疗、预后评价中的应用。背景技术[0002] 化疗是转移性结直肠癌最主要的治疗方法之一，但患者易出现化疗耐药性。结直肠癌一线化疗药物包括5‑氟尿嘧啶（5‑Fu）、奥沙利铂（Oxaliplatin）和伊立替康等。目前最常用的化疗方案为5‑Fu和奥沙利铂联合应用。然而，基于这些药物的联合化疗方案有效率仅有30‑50%。近年来，靶向药的出现有效提高了化疗的有效率。但是，化疗耐药仍然是转移性结直肠癌患者治疗失败的重要原因。因此，研究结直肠癌化疗耐药机制将为结直肠癌治疗提供潜在的新靶点。[0003] 肿瘤耐药的机制十分复杂，目前尚不完全清楚。而抵抗药物诱导的细胞死亡是肿瘤耐药的关键。通常抗癌药物能够杀死大部分癌细胞，但是有些癌细胞却会存活下来，它们成为疾病复发以及治疗失败的隐患。[0004] 近年来研究表明，长链非编码RNA(longnon‑codingRNA,lncRNA)与结直肠癌化疗耐药有密切联系。LncRNA是长度超过200核苷酸的非编码RNA，能够在不同水平上调节基因表达。lncRNA作为基因表达的关键调节因子，通过不同的机制来改变对多种疾病的易感性，包括调节基因‑环境及基因‑基因间的相互作用。随着基因测序技术的迅速发展，越来越多的lncRNA被发现在参与肿瘤的发生和进展。它们可以通过多种方式参与调节细胞增殖、细胞凋亡、细胞转移和耐药等过程。例如，LncRNAMIAT在结直肠癌细胞中高表达，能促进结直肠癌细胞增殖和侵袭转移（刘朝霞，长链非编码RNAMIAT在结直肠癌增殖和侵袭转移中的作用和机制研究，南京医科大学博士学位论文，2017年11月）；LncRNAH19在结直肠癌中高表达（曹伟军等，长链非编码RNA在结直肠癌中的表达研究，临床肿瘤学杂志，2013年10月底18卷第10期，882‑886）；LncRNACCAT1、LncRNAPVT‑1、LncRNAMALAT‑1在结直肠癌患者标本中都有大量表达（李鹏，长链非编码RNA在人结直肠癌中的异常表达，解放军医学院研究生学位论文，2015年5月）。对于LncRNA的研究仍在继续，以期能够找到具有适用于诊断、治疗、耐药预测、预后评价等实用价值的LncRNA，为结直肠癌诊断治疗提供新靶点。发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种新的长链非编码RNA，并提供了该长链非编码RNA的结直肠癌诊断治疗方面的相关应用。[0006] 本发明技术方案详述如下：[0007] 第一方面，本发明提供了一种长链非编码RNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0008] AAGTGAATGACTACTAAATTAGCCATCACTTCAATTTCAAACCATATTCAGTAGAAAATTGATTTATATAATATGTAAAACAAAGACATTTATAAGAACACAATTTCCTATGCTTGGAACTTTTGGAAGAGAAGATAATTATTCTTCAATCTACTTAATATTCCATTAAAACTAATTACTATGCATGACCATTGTGTAATGATTCTAGTCATTCCTCAGAACTCCAATCTGAGTGCTCAAAATTTGTCCCTGAATCAGTTTCATATAGTTACCTGAATAAAAGAAATCAGAAGTTAAAGTT（SEQIDNo.1）。[0009] 本发明通过大数据筛选及相关实验，获得了一段长链非编码RNA，lncRNA107308.1，将其命名为lncRNA‑HMG（高迁移率蛋白相关的长链非编码RNA）。lncRNA‑HMG的基因编码序列包括301个碱基。[0010] 第二方面，本发明提供了检测上述长链非编码RNA表达水平的产品在制备检测试剂中的应用，所述长链非编码RNA作为标志物，所述检测试剂用于诊断结直肠癌、评估结直肠癌耐药性、评估结直肠癌预后中的至少一种。[0011] 进一步的，相对于正常组织，结直肠癌患者、结直肠癌耐药患者、结直肠癌预后不良患者的肿瘤组织中所述长链非编码RNA表达水平显著上升。[0012] 第三方面，本发明提供了一种用于检测长链非编码RNA表达水平的产品，包括以下核苷酸序列的引物对：[0013] 上游引物：TGCTTGGAACTTTTGGAAGAGA（SEQIDNO.2），[0014] 下游引物：CACTCAGATTGGAGTTCTGAGGA（SEQIDNO.3）。[0015] 第四方面，本发明提供了抑制上述长链非编码RNA表达的产品在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。体内外实验表明，抑制lncRNA‑HMG表达后，肿瘤细胞增殖明显降低，肿瘤体积和重量明显降低。[0016] 第五方面，本发明提供了抑制上述长链非编码RNA表达的产品在制备逆转结直肠癌化疗耐药的药物中的应用。体内外实验表明，化疗耐药情况下，抑制lncRNA‑HMG表达后，肿瘤对化疗药物的敏感性显著提高，耐药能力减弱，肿瘤增长明显减缓。[0017] 第六方面，本发明提供了抑制上述长链非编码RNA表达的产品，联合结直肠癌化疗药物，在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。[0018] 可选或优选的，上述应用中，所述抑制长链非编码RNA表达的产品为shRNA或寡核苷酸。[0019] 第七方面，本发明提供了一种shRNA，用于靶向抑制上述长链非编码RNA（lncRNA‑HMG）表达，所述shRNA的核苷酸序列如下shRNA1、shRNA2的任意一组：[0020] shRNA1：[0021] shRNA1F：[0022] CCGGCACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTGTTTTTG（SEQIDNO.4），[0023] shRNA1R：[0024] AATTCAAAAACACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTG（SEQIDNO.5）；[0025] shRNA2：[0026] shRNA2F：[0027] CCGGGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTCTTTTTG（SEQIDNO.6），[0028] shRNA2R：[0029] AATTCAAAAAGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTC（SEQIDNO.7）。[0030] 第八方面，本发明提供了一种寡核苷酸，用于靶向抑制上述长链非编码RNA（lncRNA‑HMG）表达，所述寡核苷酸的核苷酸序列如下所示：TACTATGCATGACCATTGTG（SEQIDNO.8）。[0031] 寡核苷酸（anti‑senseoligonucleotide，ASO）是一种长度约在12 30nt的单~链寡核苷酸片段，主要通过碱基互补配对与靶标RNA结合，导致RNaseH剪切靶标RNA，从而抑制基因表达。[0032] 本发明具有如下有益效果：[0033] 本发明提供了一种新的长链非编码RNA，即lncRNA‑HMG，其在结直肠癌患者、结直肠癌耐药患者、结直肠癌预后不良患者的肿瘤组织中的表达量显著高于正常组织，而且随着表达水平的增加，结直肠癌患者、结直肠癌耐药患者的预后也越差。更进一步的研究表明，lncRNA‑HMG的表达水平与结直肠癌患者的耐药性密切相关，高表达水平还伴随着肿瘤细胞增殖能力的提高。基于此，lncRNA‑HMG能够作为生物标志物用于制备诊断结直肠癌产品、评估结直肠癌耐药性产品、评估结直肠癌预后产品等，为其化疗耐药、药效评价开辟新的途径。[0034] 更进一步的，降低lncRNA‑HMG的表达可以明显减缓肿瘤增长、降低患者对药物的耐药能力，因此，lncRNA‑HMG能够作为靶点用于制备治疗结直肠癌的药物。本发明提供的shRNA和寡核苷酸ASO，均能够有效降低癌细胞中lncRNA‑HMG的表达。通过直接注入体内发现，使用ASO后小鼠的肿瘤增长明显减缓，同时肿瘤对药物的耐药能力也减弱。这项研究的结果为结直肠癌的治疗和诊断提供了新的思路和策略，为开发相关药物和诊断产品提供了新的方向。[0035] 本发明最终阐明lncRNA‑HMG在结直肠癌诊疗中的作用及相关分子机制，有力地推动我国结直肠癌诊疗的现状。附图说明[0036] 图1为实施例1中不同组织和细胞中lncRNA‑HMG表达量检测结果，左图为结直肠癌组织和癌旁组织lncRNA‑HMG表达量，右图为不同细胞中lncRNA‑HMG表达量。[0037] 图2为实施例2耐药细胞与结直肠癌患者lncRNA‑HMG表达水平与结直肠癌耐药以及患者预后相关性统计结果，其中左图为不同耐药细胞系中lncRNA‑HMG表达水平检测结果，右图为结直肠癌患者lncRNA‑HMG对应的mRNA水平与患者的生存时间的关系。[0038] 图3为实施例3利用shRNA构建抑制lncRNA‑HMG表达的细胞系中lncRNA‑HMG表达水平检测结果，左图为细胞LoVo不同组检测结果，右图为细胞HCT116不同组检测结果。[0039] 图4为实施例4利用shRNA构建抑制lncRNA‑HMG表达的细胞系药物敏感性增强的实验结果，其中第一、二排为两种细胞的克隆测定结果（平板培养结果及细胞数量统计结果），第三排为药物IC50值测定统计结果。[0040] 图5为实施例5利用shRNA构建抑制lncRNA‑HMG表达后促进结直肠癌细胞铁死亡的实验结果，两图分别是不同的LoVo、HCT116细胞经实验处理后GSH测定统计结果。[0041] 图6为实施例6对正常结直肠癌细胞及经shRNA抑制lncRNA‑HMG表达的结直肠癌细胞进行p53蛋白及内参蛋白β‑Actin含量检测的结果。其中，最上第一排为不同的LoVo、HCT116细胞中p53蛋白免疫印迹电泳图；第二排为正常结直肠癌细胞LoVo及经过lncRNA‑HMGshRNA1抑制处理的结直肠癌细胞LoVo中不同时间加入CHX后的p53蛋白免疫印迹电泳图；最下面一排为正常结直肠癌细胞LoVo及经过lncRNA‑HMGshRNA1抑制处理的结直肠癌细胞LoVo中不同时间加入CHX后的p53蛋白含量统计结果。[0042] 图7为实施例7正常结直肠癌细胞及经shRNA抑制lncRNA‑HMG表达的结直肠癌细胞中SLC7A11和VKORC1L1的mRNA和蛋白水平。其中，第一排为各组细胞SLC7A11和VKORC1L1的mRNA表达水平统计结果，第二排为各组细胞SLC7A11和VKORC1L1的蛋白质表达水平统计结果。[0043] 图8为实施例8shRNA抑制在体内促进结直肠癌细胞化疗敏感性实验检测结果，其中最上第一排为不同组小鼠肿瘤组织外观照片，第二排为不同组小鼠肿瘤组织切片进行免疫组化和HE染色的结果；第三排和第四排为不同组小鼠p53、SLC7A11和VKORC1L1蛋白的表达水平，图中1‑6为小鼠编号，C表示对照组，S表示shRNA组，最下一排的5‑Fu+Oxa及加号共同表示注射了5‑氟尿嘧啶和奥沙利铂的小鼠。[0044] 图9为实施例9靶向lncRNA‑HMG的反义寡核苷酸（ASO）可以在PDX模型中增强结直肠癌化疗效果的实验结果，其中第一排左图为在细胞LoVo中验证ASO的作用效果，即在细胞中分别加入Control和ASO处理后，检测lncRNA‑HMG的表达水平，中图为Control组和ASO组的小鼠肿瘤组织外观照片，右图为Control组和ASO组的小鼠肿瘤组织重量统计；第二排左图为Control+5‑Fu+Oxa组和ASO+5‑Fu+Oxa组的小鼠肿瘤组织外观照片，右图为两组小鼠肿瘤组织重量统计；第三排左图为四组小鼠肿瘤组织切片进行免疫组化和HE染色的结果，右图为SLC7A11和VKORC1L1蛋白的表达水平，图中1‑6为小鼠编号，C表示对照组，S表示ASO组，5‑Fu+Oxa及加号共同表示注射了5‑氟尿嘧啶和奥沙利铂的小鼠。[0045] 上述各图中，*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。[0046] 图中，NCM460是人正常肠上皮细胞系，SW480是人结肠腺癌细胞系，SW620是人结直肠腺癌细胞系，DLD1是人结直肠腺癌上皮细胞系，LoVo、HCT116均是人结直肠癌细胞细胞系。具体实施方式[0047] 为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合实施例及附图，对本申请进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。如无特殊说明，实施例中所用生物材料、仪器、试剂均可通过商业途径购买，所用实验手段为常规技术。[0048] 实施例1lncRNA‑HMG在结直肠癌组织及细胞中的表达水平[0049] 利用实时荧光定量PCR（qPCR）方法来评估被检测组织中lncRNA‑HMG的表达水平。利用Cox回归分析，探讨了lncRNA‑HMG在肿瘤组织和正常组织表达的差异。本实施例收集了北京大学肿瘤医院2013‑2016年80例确诊结直肠癌患者的组织样本（包括癌组织和癌旁正常组织）进行分析，此实施例中使用了12例。同时，还对人正常细胞系NCM460，结直肠癌相关细胞系SW480、SW620、DLD1、LoVo和HCT116中的lncRNA‑HMG表达水平进行了检测。[0050] 引物序列：[0051] lncRNA‑HMGqPCR‑F：TGCTTGGAACTTTTGGAAGAGA，[0052] lncRNA‑HMGqPCR‑R：CACTCAGATTGGAGTTCTGAGGA。[0053] PCR反应体系：[0054][0055] 利用ABI7500fast仪器进行real‑timePCR实验，具体反应条件如下：95℃预变性1min，接着95℃‑1min、55℃‑30s、72℃‑30s共39个循环，最后为溶解曲线程序95℃15s、55℃1min、95℃30s、55℃15s。[0056] 运行结束后，导出数据并使用软件分析数据。[0057] qPCR检测结果如图1所示，lncRNA‑HMG在结直肠癌组织中表达水平明显高于正常组织。lncRNA‑HMG在结直肠癌细胞中的表达水平也明显高于正常结肠细胞。提示lncRNA‑HMG片段在结直肠癌中呈现高表达水平。[0058] 实施例2lncRNA‑HMG表达水平与结直肠癌耐药以及患者预后的关系[0059] 在本实施例中，通过药物浓度递增法构建对5‑FU耐药的LoVo细胞株（耐5‑FU组）以及对Oxaliplatin耐药的LoVo细胞株（耐奥沙利铂组）。通过荧光定量PCR方法检测了结直肠癌耐药细胞株LoVo中lncRNA‑HMG的表达水平。共设置三组，不耐药的普通LoVo细胞作为对照组，耐5‑FU组，耐Oxaliplatin组（耐奥沙利铂组）。[0060] 另外，收集了北京大学肿瘤医院2013‑2016年80例确诊结直肠癌患者的组织样本（包括癌组织和癌旁正常组织）。通过荧光定量PCR检测80例患者lncRNA‑HMG的表达水平，利用Kaplan‑Meier分析和Cox回归分析，探讨了lncRNA‑HMG表达水平与患者的生存和预后之间的关系。[0061] 结果如图2所示，左图为各组细胞系中lncRNA‑HMG表达水平qPCR检测结果，显示lncRNA‑HMG在耐5‑Fu和耐奥沙利铂结直肠癌细胞株中均呈高表达水平。右图为结直肠癌患者lncRNA‑HMG对应的mRNA水平与患者的生存时间的关系。表明高水平的lncRNA‑HMGmRNA表达与患者的平均生存时间呈负相关，提示lncRNA‑HMG片段的高表达可能与较差的预后相关。[0062] 实施例3靶向lncRNA‑HMG对应基因的慢病毒药物能够降低结直肠癌细胞中lncRNA‑HMG的表达水平[0063] 采用以下两个shRNA敲除lncRNA‑HMG表达。[0064] lncRNA‑HMGshRNA1:[0065] F：[0066] CCGGCACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTGTTTTTG，[0067] R：[0068] AATTCAAAAACACTTCAATTTCAAACCATATTCCTCGAGGAATATGGTTTGAAATTGAAGTG。[0069] lncRNA‑HMGshRNA2：[0070] F：[0071] CCGGGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTCTTTTTG，[0072] R：[0073] AATTCAAAAAGAGAAGATAATTATTCTTCAATCCTCGAGGATTGAAGAATAATTATCTTCTC。[0074] 同时设置对照基因，使用对应的shRNAlncRNA‑HMG对照基因。[0075] 2.1构建敲除lncRNA‑HMG的稳定细胞系[0076] 首先构建慢病毒表达载体质粒，然后通过HEK293T细胞进行慢病毒的包装，进而用慢病毒感染结直肠癌细胞系（LoVo，HCT116）构建稳转细胞株。具体方法如下：[0077] 实验分为三组，其余成分相同，区别成分如下：[0078] lncRNA‑HMGshRNA1组：目的质粒含有lncRNA‑HMGshRNA1；[0079] lncRNA‑HMGshRNA2组：目的质粒含有lncRNA‑HMGshRNA2；[0080] 对照组：目的质粒含有对照shRNA。[0081] 其余各实验条件和操作三组之间相同。结直肠癌细胞采用两种，分别是LoVo细胞和HCT116细胞。[0082] 1）慢病毒包装：[0083] a)根据以下剂量，将慢病毒质粒和DMEM混合（慢病毒质粒中包装质粒1‑3μg，目的质粒3μg，DMEM2ml）得质粒混合物。将转染试剂和DMEM混合（转染试剂PEI21μL，DMEM2ml）得转染试剂混合物，然后将质粒混合物和转染试剂混合物彻底混合得混合溶液，在室温静置20分钟。[0084] b)将HEK293T细胞（密度80%‑90%）撤上清，加入上述混合溶液（约4ml），8小时后更换完全培养基7ml。[0085] c)转染48小时后第一次收上清（4℃静置），完全培养基补液4ml继续培养，24小时后第二次收上清；将两次收得上清3000rpm，4℃离心15分钟，上清用0.22μm滤膜过滤。滤液加入5×PEG8000（滤液体积:PEG8000=4:1），在4℃条件下每隔20分钟混匀一次，混匀3‑6次，然后在4℃静置过夜。[0086] d)第二天3000g离心30分钟，弃上清，用完全培养基200μl溶解沉淀，转移至1.5mlEP管中，4℃过夜溶解，得病毒液，然后冻存于‑80℃[0087] 2）慢病毒感染细胞：[0088] 将结直肠癌细胞（LoVo细胞和HCT116细胞）接种于6孔板，密度20%‑30%，贴壁后撤液，加入病毒液，补1ml完全培养基，6‑8小时后观察细胞状态，换液或补液至2ml总体积，48小时后进行药筛。[0089] 药筛基于qPCR，检测不同组感染后结直肠癌细胞中lncRNA‑HMG的表达情况。[0090] 结果见图3，图中可以看出两种shRNA即lncRNA‑HMGshRNA1和lncRNA‑HMGshRNA2都能够抑制lncRNA‑HMG的表达。表明敲除lncRNA‑HMG的稳定细胞系构建成功。在lncRNA‑HMG稳定敲除细胞LoVo和HCT116中lncRNA‑HMG的表达水平明显降低。[0091] 实施例4shRNA抑制lncRNA‑HMG的表达增强结直肠癌细胞药物敏感性[0092] 4.1克隆形成测定[0093] 以实施例3构建的lncRNA‑HMG稳定敲除细胞LoVo和HCT116作为实验对象，分别设置DMSO组和5‑Fu+Oxa组，每组均包括对照细胞（control）、lncRNA‑HMGshRNA1敲除细胞（ShHMG‑1）和lncRNA‑HMGshRNA2敲除细胞（ShHMG‑2）。[0094] DMSO组：DMSO（二甲基亚砜，药物溶剂，作为对照）处理12天[0095] 5‑Fu+Oxa组：5‑Fu(5μM)和Oxaliplatin(40μM)处理细胞12天[0096] 各组细胞被分离和计数。然后，将500个细胞播种到含有10%血清的6孔板中的每个孔中，并在培养基中培养12天。最后，使用结晶紫固定和染色细胞以计数可见的集落。[0097] 4.2药物IC50值测定[0098] 以实施例3构建的lncRNA‑HMG稳定敲除细胞LoVo和HCT116作为实验对象，两种细胞均设置对照细胞（control）、lncRNA‑HMGshRNA1敲除细胞（ShHMG‑1）和lncRNA‑HMGshRNA2敲除细胞（ShHMG‑2）。[0099] 采用细胞计数试剂盒（CCK‑8）（YeasenBiotechnologyCo.,Ltd.，中国）按照制造商的方案评估细胞生长。以每孔1,000个细胞的密度播种在96孔板中，并在含有10%血清的培养基中培养，将细胞分为两组：[0100] 5‑Fu组：细胞中加入5‑氟尿嘧啶（5‑Fu），药物浓度分别以0，0.001，0.01，0.1，1，2，5，10μmol/l的培养24小时；[0101] Oxaliplatin（奥沙利铂）组：细胞中加入奥沙利铂，药物浓度分别以0，0.001，0.01，0.1，1，2，5，10μmol/l培养24小时。[0102] 向两组细胞中添加CCK‑8试剂，1h后在450nm处检测其吸光度值，然后进行统计分析。计算IC50值。[0103] 克隆形成及药物IC50值测定实验结果参见图4，图4克隆形成测定结果显示，敲除lncRNA‑HMG后的细胞，相较于DMSO组，5‑Fu+Oxa组的克隆形成数量明显减少，表明敲除lncRNA‑HMG后细胞的耐药能力明显降低。药物IC50值测定结果显示，两种细胞相较于对照组（Control），敲除lncRNA‑HMG后细胞的IC50值明显降低，表明敲除lncRNA‑HMG后，细胞的耐药性明显降低。[0104] 实施例5shRNA抑制lncRNA‑HMG的表达促进结直肠癌细胞铁死亡[0105] 5.1还原型谷胱甘肽（GSH）测定[0106] 以实施例3构建的lncRNA‑HMG稳定敲除细胞LoVo和HCT116作为实验对象，两种细胞均设置对照细胞（control）、lncRNA‑HMGshRNA1敲除细胞（ShHMG‑1）和lncRNA‑HMGshRNA2敲除细胞（ShHMG‑2）。[0107] 两种类型细胞各设置两个大组：[0108] DMSO组：DMSO（二甲基亚砜，药物溶剂，作为对照）处理24小时；[0109] 5‑Fu+Oxa组：5‑Fu(5μM)和Oxaliplatin(40μM)处理细胞24小时。[0110] 处理完成后，取细胞进行裂解。[0111] 细胞裂解液中GSH的相对浓度是通过使用GSH检测试剂盒（SolarbioTechnologyCo.LTD，中国）按照制造商的指南确定的。反应速率直接与GSH浓度相关。通过使用微孔板读取器在415nm处测量所得黄色产物（5‑硫基‑2‑硝基苯甲酸）的吸光度，计算获得GSH水平。随后，这些值相对于蛋白质浓度进行了分析，并在所有组中进行了归一化处理。[0112] 在细胞发生铁死亡过程中，GSH的升高可以抑制细胞内ROS（活性氧）的生成，从而抑制铁死亡的发生。[0113] 结果如图5所示，两图为细胞经不同处理后的GSH测定统计结果。从图中可以看出，添加药物5‑氟尿嘧啶（5‑Fu）和奥沙利铂（Oxaliplatin）的各组细胞，相较于未添加药物的各组细胞，敲除lncRNA‑HMG的细胞铁死亡明显增加，GSH水平明显降低。[0114] 实验结果表明，shRNA抑制lncRNA‑HMG的表达能够促进结直肠癌细胞铁死亡。[0115] 实施例6shRNA抑制lncRNA‑HMG的表达影响p53水平[0116] 以实施例3构建的lncRNA‑HMG稳定敲除细胞LoVo和HCT116作为实验对象，两种细胞均设置对照细胞（Vector）、lncRNA‑HMGshRNA1敲除细胞（ShHMG‑1）和lncRNA‑HMGshRNA2敲除细胞（ShHMG‑2）。[0117] 6.1免疫印迹（westernblot）[0118] 通过免疫印迹检测稳定敲除lncRNA‑HMG细胞中p53的水平。[0119] 免疫印迹具体方法如下：[0120] SDS‑PAGE胶配置：根据目的蛋白的大小制备所需浓度的SDS‑PAGE胶；[0121] （1）准确组装电泳仪器的正负极后，灌满1×RunningBuffer，上样，恒压进行电泳，常用80V。[0122] （2）转膜：电泳结束后，除去压缩胶后按照黑面（负极）—海绵—三层滤纸—胶—膜—三层滤纸—海绵—白面（正极）的顺序叠放，膜使用NC膜；组装好仪器，在内部放上冰板，外部冰盒冷却，灌满1×TransBuffer，恒压80V转膜2h；转膜完成后，NC膜用丽春红染液染色检测是否转膜成功，并根据Marker位置进行裁剪；[0123] （3）Westernblot：剪裁完成后的NC膜用封闭液封闭1小时；弃封闭液，用PBS‑T洗膜3次，每次10min；用封闭液按比例稀释一抗（商业化抗体），4℃过夜；一抗回收后，用0.5%PBS‑T洗膜共3次，每次10min；用封闭液按1：10000稀释二抗（鼠抗兔二抗或羊抗兔二抗），室温孵育1小时；弃二抗后用PBS‑T洗膜3次，每次10min，晾干NC膜后，使用奥德赛曝光仪曝光并观察结果。[0124] 6.2细胞半衰期实验方法[0125] （1）细胞培养及处理：[0126] 将目标细胞在培养皿中培养至对数生长期。在实验开始前，根据实验设计，在适当的时间点添加蛋白质合成抑制剂氯霉素环素（CHX）至培养基中，以达到适当的浓度（通常为10‑100μg/ml），开始蛋白质合成的抑制。[0127] 样品收集及处理：在不同的CHX处理时间点（如0、0.5、1、1.5、2小时）收集细胞。[0128] （2）蛋白质提取：使用细胞裂解缓冲液对细胞进行裂解，以提取蛋白质。使用蛋白质定量方法（如Bradford法或BCA法）测定提取物中的蛋白质浓度。[0129] （3）免疫印迹分析（Westernblotting）。[0130] （4）使用β‑Actin作为内部参考蛋白质进行数据归一化。[0131] （5）数据分析：分析蛋白质带的强度，并绘制蛋白质信号与时间的曲线。使用曲线拟合软件计算蛋白质半衰期。[0132] 结果如图6，最上第一排为不同的LoVo、HCT116细胞中p53蛋白免疫印迹电泳图，其中，Vector表示对照shRNA，ShHMG‑1表示lncRNA‑HMGshRNA1，ShHMG‑2表示lncRNA‑HMGshRNA2，加号表示转染了该种shRNA，减号表示没有转染该种shRNA。结果显示，利用shRNA抑制lncRNA‑HMG表达后，p53蛋白水平增加。图6第二排为正常结直肠癌细胞LoVo及经过lncRNA‑HMG shRNA1抑制处理的结直肠癌细胞LoVo中不同时间加入CHX后的p53蛋白免疫印迹电泳图。结果显示，正常结直肠癌细胞在加入CHX后，p53蛋白的合成受到抑制，而经过lncRNA‑HMG shRNA1抑制处理的结直肠癌细胞对CHX的抑制作用反应不明显。最下面一排为正常结直肠癌细胞LoVo及经过lncRNA‑HMG shRNA1抑制处理的结直肠癌细胞LoVo中不同时间加入CHX后的p53蛋白含量统计结果。表明敲除lncRNA‑HMG后p53的表达水平明显升高。敲除lncRNA‑HMG后p53蛋白半衰期明显升高。shRNA 抑制 lncRNA‑HMG 的表达能够提高 p53的半衰期。[0133] 实施例7shRNA抑制lncRNA‑HMG的表达影响p53下游基因的表达[0134] 在细胞铁死亡过程中，p53发挥着关键作用，通过目前的研究表明，p53主要通过抑制SLC7A11和VKORC1L1水平来发挥促进细胞铁死亡的功能，从而抑制肿瘤的发生发展。[0135] 本实施例在实施例6的基础上，继续检测了各组细胞中SLC7A11和VKORC1L1的mRNA和蛋白水平。[0136] 结果如图7所示，结果表明，敲除lncRNA‑HMG后SLC7A11和VKORC1L1的mRNA和蛋白水平均明显降低。表明抑制lncRNA‑HMG表达后可以抑制p53下游基因的表达。[0137] 实施例8 shRNA抑制在体内促进结直肠癌细胞化疗敏感性[0138] 8.1 细胞系来源的异体移植肿瘤模型[0139] 构建小鼠皮下成瘤模型。五周的雌性裸鼠随机分成六组（每组n = 6），注射剂量为61×10个细胞/只，肿瘤细胞皮下注射到每只小鼠的右侧肋旁。然后，实验组小鼠每3天接受一次腹腔注射奥沙利铂（6 mg/kg）和5‑氟尿嘧啶（20mg/kg）。[0140] Control组：注射的肿瘤细胞为结直肠癌细胞LoVo。[0141] shHMG‑1组：注射的肿瘤细胞为经过lncRNA‑HMG shRNA1抑制处理的结直肠癌细胞LoVo。[0142] shHMG‑2组：注射的肿瘤细胞为经过lncRNA‑HMG shRNA2抑制处理的结直肠癌细胞LoVo。[0143] Control+5‑Fu+Oxa组：注射的肿瘤细胞为结直肠癌细胞LoVo，注射的药物为奥沙利铂和5‑氟尿嘧啶。[0144] shHMG‑1+5‑Fu+Oxa组：注射的肿瘤细胞为经过lncRNA‑HMG shRNA1抑制处理的结直肠癌细胞LoVo，注射的药物为奥沙利铂和5‑氟尿嘧啶。[0145] shHMG‑2+5‑Fu+Oxa组：注射的肿瘤细胞为经过lncRNA‑HMG shRNA2抑制处理的结直肠癌细胞LoVo，注射的药物为奥沙利铂和5‑氟尿嘧啶。[0146] 各组小鼠肿瘤体积每五天测量一次，并使用公式长度×宽度2×0.5（mm3）进行计算。35天后，小鼠安乐死，检查小鼠肿瘤的生长。通过western blot分析SLC7A11、VKORC1L1和p53的蛋白水平。[0147] 8.2 免疫组化[0148] （1）脱蜡与水化：待检测组织样本石蜡切片放置于60°烤箱烤片30‑60min。而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min。PBS洗3次，3 min/次。[0149] （2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40mlPBS+120μlTritonX‑100+400μl30%H2O2）浸润切片30min（RT避光），降低内源性过氧化物酶的活性。PBS洗3次，3min/次。[0150] （3）抗原修复：微波修复，pH6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。PBS洗3次，3min/次。[0151] （4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点，37℃温箱中30min，用滤纸吸去多余的血清。[0152] （5）孵育一抗：滴加稀释好的一抗（商业化抗体）20μl，4℃过夜或者37℃孵育1‑2h。PBS洗3次，3min/次。[0153] （6）孵育二抗：稀释好的二抗（鼠抗兔二抗或羊抗兔二抗）20μl，37℃孵育1‑2h，PBS洗3次，3min/次。[0154] （7）切片显色：用DAB‑H2O2显色10min，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。[0155] （8）复染及封片：苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。脱水时，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各2min。二甲苯5min使切片透明化，最后加入中性树胶封片。观察免疫组化结果。[0156] 参见图8，为代表性肿瘤组织外观照片和肿瘤组织切片进行免疫组化和HE染色的结果。相比较对照组可以发现敲除lncRNA‑HMG后肿瘤的增殖能力即肿瘤大小明显降低，参见图8最上一排左图，Sh‑HMG‑1组和Sh‑HMG‑2组的肿瘤体积均小于Control组），当予以小鼠化疗药物5‑Fu和奥沙利铂后，肿瘤的增殖能力即肿瘤大小降低较对照组更加明显。参见图8最上一排右图，shHMG‑1+5‑Fu+Oxa组和shHMG‑2+5‑Fu+Oxa组的肿瘤体积均显著小于Control+5‑Fu+Oxa组，说明敲除lncRNA‑HMG后小鼠对化疗药物的敏感性更高。[0157] Ki67代表组织细胞增殖能力，通过免疫组化可以看出敲除lncRNA‑HMG后肿瘤的增殖能力明显降低，同时SLC7A11的表达水平下降，可以间接表明铁死亡水平增加。图8第二排免疫组化染色结果图，相较于Control组，Sh‑HMG‑1组和Sh‑HMG‑2组中Ki67和SLC7A11染色较浅；相较于Control+5‑Fu+Oxa组，shHMG‑1+5‑Fu+Oxa组和shHMG‑2+5‑Fu+Oxa组Ki67和SLC7A11染色较浅。[0158] 敲除lncRNA‑HMG后肿瘤组织中的p53水平升高，SLC7A11和VKORC1L1的表达水平降低。图8最下面两排，未注射药物的三组小鼠中，Sh‑HMG‑1组和Sh‑HMG‑2组的每只小鼠p53蛋白表达量都高于Control组的小鼠，SLC7A11和VKORC1L1的表达量都低于Control组的小鼠；注射了药物的三组小鼠中，shHMG‑1+5‑Fu+Oxa组和shHMG‑2+5‑Fu+Oxa组的每只小鼠p53蛋白表达量也都高于Control+5‑Fu+Oxa组的小鼠，SLC7A11和VKORC1L1的表达量都低于Control+5‑Fu+Oxa组的小鼠。[0159] 实验结果表明，shRNA抑制在体内促进结直肠癌细胞化疗敏感性，提高p53水平，降低SLC7A11和VKORC1L1水平。[0160] 实施例9靶向lncRNA‑HMG的反义寡核苷酸（ASO）可以在PDX模型中增强结直肠癌化疗效果[0161] 设计反义寡核苷酸ASO序列，具体序列如下：TACTATGCATGACCATTGTG。[0162] 使用高表达lncRNA‑HMG的结直肠癌患者的新鲜肿瘤样本建立了PDX模型。肿瘤组织首先被皮下植入小鼠作为第一代（F0）。当肿瘤达到适当大小时，将其切除、分割，并作为第二代（F2）再次皮下植入小鼠。[0163] 肿瘤皮下植入后，携带肿瘤的小鼠被随机分为四组，包括：[0164] Control组：注射生理盐水作为对照；[0165] ASO组：注射ASO，每次注射10nmol每只；[0166] Control+5‑Fu+Oxa组：注射生理盐水，同时注射5‑氟尿嘧啶和奥沙利铂；[0167] ASO+5‑Fu+Oxa组：注射ASO，每次注射10nmol每只；同时注射5‑氟尿嘧啶和奥沙利铂。[0168] ASO通过肿瘤内注射给予，而5‑FU（20mg/kg）和奥沙利铂（6mg/kg）通过腹腔注射给予。治疗每3天进行一次。[0169] PDX小鼠的肿瘤直径和宽度每7天测量一次，以计算肿瘤体积（V=0.5×D×W2；V，体积；D，直径；W，宽度）。35天后，安乐死。然后，切除肿瘤组织，拍照，称重，并包埋石蜡中进行进一步的分析。[0170] 结果如图9，检测了ASO在结直肠癌细胞中敲除lncRNA‑HMG的能力，结果显示，ASO可以明显敲除lncRNA‑HMG的表达水平（第一排左图，ASO组中lncRNA‑HMG表达水平显著低于Control组），在体内实验中给小鼠注射ASO后小鼠肿瘤增长水平明显降低（第一排中图和右图，相较于Control组，ASO组肿瘤外观体积和重量均下降），在给药组及5‑Fu和奥沙利铂（Oxa）组中可以看到肿瘤的大小明显缩小（第二排两图，ASO+5‑Fu+Oxa组的肿瘤体积、重量均低于Control+5‑Fu+Oxa组），可以通过免疫组化看到ki67即肿瘤的增殖能力明显降低，SLC7A11的水平降低即铁死亡水平增加（第三排左图）。westernblot发现敲除lncRNA‑HMG后p53的下游蛋白SLC7A11和VKORC1L1表达降低（第三排右图）。[0171] 本实施例实验结果表明，靶向lncRNA‑HMG的反义寡核苷酸ASO可以在PDX模型中增强结直肠癌化疗效果。[0172] 本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：北京

专利申请日期：2024-06-03

专利公开日期：2024-09-03

专利公告号：CN118272381B