专利名称:红参中化合物丙氨酸双糖苷ADFG的合成新方法
专利类型:实用新型专利
专利申请号:CN202410403891.9
专利申请(专利权)人:吉林农业大学
权利人地址:吉林省长春市新城大街2888号吉林农业大学中药材学院
专利发明(设计)人:李伟,王梓,胡锐意,李新殿,唐姗,姜爽,胡俊男,刘志
专利摘要:丙氨酸双糖苷(Alanine‑fructosyl‑glucose,ADFG)是人参在加工成红参的过程中发生美拉德反应生成的产物。目前尚未进行系统研究,按照红参中精氨酸双糖苷(AFG)、精氨酸单糖苷(AF)等其他氨基酸类衍生物的药理活性猜测,ADFG也应该具有类似的药理活性。因其在红参中含量较少且分离成本高,不足以满足实验研究,故本研究提供了一种化合物ADFG的高效人工合成方法,降低从红参中分离的成本,为后续研究提供物质基础,使具有经济高效、操作简单、安全等特点,适用于工业化生产。随后对其进行了体外IEC‑6细胞活性筛选,结果表明ADFG可以缓解低剂量顺铂(Cisplatin)诱导的IEC‑6细胞衰老,可用于抗衰老药物的应用。
主权利要求:
1.化合物ADFG在制备抗衰老药物中的应用,其特征在于,所述应用为在制备预防或者治疗顺铂(Cisplatin)诱导的肠粘膜细胞衰老药物中的应用,所述化合物ADFG的结构式如下:
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述化合物ADFG的人工合成方法包括:A.精确称取丙氨酸(L‑Ala)与D‑(+)‑麦芽糖,质量比例为1:1~1:5,置于20倍体积(以丙氨酸质量计,g/mL)的反应媒介中,且反应媒介的浓度为75%~100%;
B.置于恒温震荡摇床中,设置60~95℃进行反应60‑140min;
C.反应结束后使用有机试剂对其进行沉淀洗涤,抽滤,得到湿品,随后对其进行低温真空干燥得到丙氨酸双糖苷粗品。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,反应媒介为不同浓度的醋酸水溶液,v/v分别为75%、80%、85%、90%、95%醋酸水溶液;和冰醋酸。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,丙氨酸与麦芽糖的质量比例为1:3。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述丙氨酸按照10.0g计时、麦芽糖按照
30.0g计时,冰醋酸的使用量为200mL。
6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,反应温度为85℃。
7.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,选择的反应时间为120min。
8.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的有机试剂为丙酮,其中冰醋酸与丙酮的体积比为1:(15~20)。
9.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,洗涤次数为3‑4次,将冰醋酸清洗干净。 说明书 : 红参中化合物丙氨酸双糖苷ADFG的合成新方法技术领域[0001] 本发明属于有机化合物合成制备的技术领域,具体涉及一种化合物丙氨酸双糖苷(Alanine‑fructosyl‑glucose,ADFG)的人工合成方法及最佳工艺筛选。同时,公开了该化合物对低剂量顺铂(Cisplatin,CP)致肠粘膜细胞衰老的拮抗作用。背景技术[0002] 红参(Redginseng)系五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.经蒸制后的干燥根。美拉德反应(Maillardreaction,MR)是红参在加工炮制过程中发生的重要反应之一,红参中含有的氨基酸及还原糖会在加工炮制时进行羟醛缩合,生成非皂苷类成分(氨基酸[1,2] [3,4]类衍生物) ,并且该类成分具有显著的药理活性。1996年郑毅男教授 发现碱性氨基[5,6]酸精氨酸会在红参加工过程中与还原糖生成精氨酸双糖苷(AFG)具有较强的药理活性 ;目前研究表明,红参中还含有组氨酸双糖苷(HFG)、精氨酸乳糖苷(AFGA),并且中性氨基酸丙氨酸在人参中的含量也较高,在红参加工过程会使丙氨酸和人参中麦芽糖发生MR,生成丙氨酸双糖苷。[0003] 顺铂(Cisplatin,CP)化疗尽管有效,但其对肠粘膜细胞的毒性是一个严重问题,[7]尤其是当使用低剂量化疗时 。低剂量化疗旨在减少药物的全身毒性,通过诱导癌细胞衰老来抑制肿瘤生长,但这也导致正常肠粘膜细胞过早衰老。细胞衰老是一种细胞周期停滞[8]的状态,细胞在这种状态下会增大、代谢改变且线粒体功能受损 。因此,开发能够减轻CP引起的肠粘膜细胞衰老的方法,对于提高化疗的安全性和有效性至关重要。近期,一种新的美拉德反应产物在红参中被发现,并被命名为丙氨酸双糖苷(ADFG),它具有良好的抗氧化和抗炎活性,有望用于抗衰老药物的研发。因其分离成本较高,故对其进行人工合成获取大量该化合物,并且截至目前为止,关于红参化学成分的研究并未对丙氨酸双糖苷的人工合成进行报道。发明内容[0004] 本课题组创新发现并分离了丙氨酸与麦芽糖的合成物—丙氨酸双糖苷(Alanine‑fructosyl‑glucose,即ADFG),确定其结构为1‑(丙氨酸‑Nα基)‑1‑去氧‑4‑O‑(α‑D‑吡喃葡萄糖基)‑D‑果糖。并且ADFG在红参中含量较少并且分离困难且成本高,因此本发明使用丙氨酸与麦芽糖在酸性、高温的条件下进行人工合成大量制备。[0005] 本发明提供了一种操作简单、反应条件与反应温度容易控制、原料易得、合成率高的ADFG人工合成方法及最佳工艺筛选。[0006] 本发明所述的化合物命名为丙氨酸双糖苷,分子式为:C15H27NO12,结构式如下:[0007][0008] 本发明通过以下技术方案来实现:[0009] 本发明所述化合物ADFG的人工合成方法由以下步骤组成:[0010] 将一定比例的丙氨酸、麦芽糖置于酸性反应媒介中,混合均匀后在高温的条件下合成丙氨酸双糖苷,具体步骤如下所示:[0011] A.精确称取丙氨酸(L‑Ala)与D‑(+)‑麦芽糖,质量比例为1:1~1:5,置于20倍体积(以丙氨酸质量计,g/mL)的反应媒介中,且反应媒介的浓度为75%~100%;[0012] B.置于恒温震荡摇床中,设置60~95℃进行反应60‑140min;[0013] C.反应结束后使用有机试剂对其进行沉淀洗涤,抽滤,得到湿品,随后对其进行低温真空干燥得到丙氨酸双糖苷粗品;[0014] 作为本发明的一种优选技术方案,反应媒介为不同浓度的醋酸水溶液(v/v),分别为75%、80%、85%、90%、95%醋酸水溶液和冰醋酸,优选的反应媒介为冰醋酸。[0015] 作为本发明的一种优选技术方案,丙氨酸与麦芽糖的质量比例分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5,优选质量比例为1:3。[0016] 作为本发明的一种优选技术方案,选择的反应温度范围为60、70、80、85、90、95℃,优选反应温度为85℃。[0017] 作为本发明的一种优选技术方案,选择的反应时间范围为60、80、100、120、140、160min,优选反应时间为120min。[0018] 作为本发明的一种优选方案,所述的有机试剂为丙酮,单次沉淀洗涤使用量与反应媒介体积比为(15~20):1。[0019] 作为本发明的一种优选方案,使用有机试剂丙酮洗涤3~4次,可将反应媒介洗净。[0020] 本发明相对于现有技术的优点在于:[0021] 首次实现化合物丙氨酸双糖苷的人工合成制备,并且对现有相关的技术进行总结与优化,进行综合考察之后得到操作更加简单、成本低和合成率高的方法,粗品合成率可达72%以上,白色无味沉淀,对其进一步纯化分离后纯度可达97%以上。[0022] 本发明进一步提供了所述的化合物ADFG在制备抗衰老药品和/或保健品中的应用,具体地,在制备预防、治疗或者改善低剂量CP诱导的IE‑6细胞衰老中的应用。附图说明[0023] 图1为本发明ADFG的美拉德反应路线示意图[0024] 图2为本发明ADFG的HPLC‑ELSD谱图[0025] 图3为本发明不同醋酸浓度对丙氨酸与麦芽糖合成反应的影响[0026] 图4为本发明不同反应温度对丙氨酸与麦芽糖合成反应的影响[0027] 图5为本发明不同反应时间对丙氨酸与麦芽糖合成反应的影响[0028] 图6为本发明物质不同质量比对丙氨酸与麦芽糖合成反应的影响[0029] 图7为本发明ADFG的1H‑NMR谱图[0030] 图8为本发明ADFG的13C‑NMR谱图[0031] 图9为本发明ADFG的HMBC谱图[0032] 图10为本发明ADFG的HSQC谱图[0033] 图11为本发明ADFG的HR‑ESI‑MS谱图[0034] 参考文献:[0035] [1]李向高,郑毅男,刘墨祥,等.红参加工中梅拉德反应及其产物的研究[J].吉林农业大学学报,1997,(04):10‑6.[0036] [2]杜芹芹,宋凤瑞,刘志强,等.红参加工过程中梅拉德初级反应产物的研究[J].化学学报,2010,68(13):1331‑6.[0037] [3]郑毅男,松浦幸永,韩立坤,高久武司,向兰,龟田健治,李向高,奥田拓道.红参中新化合物──精氨酸衍生物的分离与结构鉴定[J].药学学报,1996,(03):191‑5.[0038] [4]郑毅男,奥田拓道,韩立坤,等.红参中的一种新氨基酸衍生物(英文)[J].JournalofChinesePharmaceuticalSciences,1998,(01):7‑10.[0039] 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1.1检测方法:使用高效液相色谱‑蒸发光散射检测技术(HPLC‑ELSD)对所得粗合成物进行含量检测。[0051] 1.2样品制备:各组分别精密称取丙氨酸双糖苷粗品5.0mg,使用0.1moL/L的盐酸溶液定容至2mL容量瓶中,即得液相进样样品,浓度为2.5mg/mL。[0052] 1.3色谱条件:月旭 AminoAcidPlus氨基酸二代专用色谱柱(4.6mm×300mm),蒸发光散射检测器,漂移管温度120℃,载气流速3.2L/min,以0.3%七氟丁酸溶液(A)和乙腈(B)为流动相,梯度洗脱:0~10min,100%A;10~15min,100%~93%A;15~40min,93%~50%A;40~41min,50%~100%A,41~60min,100%A;柱温30℃,进样量20μL,流速1.0mL/min。流动相的配制:0.3%七氟丁酸溶液:取997mL水,加入3mL七氟丁酸,混匀,超声脱气,即得。[0053] 实施例1:[0054] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL75%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重。由于反应褐变不明显,反应物沉淀在底部,因此对其进行水溶解后冻干,检测样品中ADFG含量,重复试验3次,均产物得率为86.3%,ADFG纯度为4.9%。[0055] 实施例2:[0056] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL80%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重。由于反应褐变不明显,反应物沉淀在底部,因此对其进行水溶解后冻干,检测样品中ADFG含量,重复试验3次,均产物得率为82.7%,ADFG纯度为18.5%。[0057] 实施例3:[0058] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL85%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重。由于反应褐变不明显,反应物沉淀在底部,因此对其进行水溶解后冻干,检测样品中ADFG含量,重复试验3次,均产物得率为78.4%,ADFG纯度为31.6%。[0059] 实施例4:[0060] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL90%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为73.6%,ADFG纯度为59.1%。[0061] 实施例5:[0062] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL95%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为68.3%,ADFG纯度为60.7%。[0063] 实施例6:[0064] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为68.7%,ADFG纯度为69.1%。[0065] 实施例7:[0066] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于60℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为89.3%,ADFG纯度为2.1%。[0067] 实施例8:[0068] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于70℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为79.6%,ADFG纯度为38.2%。[0069] 实施例9:[0070] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为70.1%,ADFG纯度为60.1%。[0071] 实施例10:[0072] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为63.6%,ADFG纯度为72.2%。[0073] 实施例11:[0074] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于90℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为55.3%,ADFG纯度为70.3%。[0075] 实施例12:[0076] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于95℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为49.7%,ADFG纯度为68.7%。[0077] 实施例13:[0078] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应60min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为78.6%,ADFG纯度为32.3%。[0079] 实施例14:[0080] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应80min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为72.3%,ADFG纯度为43.7%。[0081] 实施例15:[0082] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应100min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为68.7%,ADFG纯度为62.1%。[0083] 实施例16:[0084] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为65.3%,ADFG纯度为72.6%。[0085] 实施例17:[0086] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应140min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为59.4%,ADFG纯度为65.8%。[0087] 实施例18:[0088] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应160min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为51.2%,ADFG纯度为60.3%。[0089] 实施例19:[0090] 精密称取10g丙氨酸和10g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为75.6%,ADFG纯度为46.2%。[0091] 实施例20:[0092] 精密称取10g丙氨酸和20g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为69.1%,ADFG纯度为59.7%。[0093] 实施例21:[0094] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为64.3%,ADFG纯度为71.9%。[0095] 实施例22:[0096] 精密称取10g丙氨酸和40g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为79.8%,ADFG纯度为62.3%。[0097] 实施例23:[0098] 精密称取10g丙氨酸和50g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为82.3%,ADFG纯度为56.2%。[0099] 实施例24:[0100] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤1次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为65.3%,ADFG纯度为70.1%。[0101] 实施例25:[0102] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤2次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为64.1%,ADFG纯度为71.3%。[0103] 实施例26:[0104] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为62.7%,ADFG纯度为72.5%。[0105] 实施例27:[0106] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤4次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为61.9%,ADFG纯度为72.7%。[0107] 实施例28:[0108] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤5次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为61.6%,ADFG纯度为72.0%。[0109] 根据上述实施例,结果由表2可知:通过对不同浓度的醋酸调控合成ADFG,实验结果表明,当醋酸浓度为冰醋酸时反应时产物得率及纯度能达到理想状态。[0110] 表2.不同浓度醋酸对ADFG合成的影响的统计表[0111][0112] 由表2可知,反应媒介为冰醋酸时纯度达到最高,且经济适用。[0113] 根据上述实施例,结果由表3可知:通过对时间及温度的调控来合成ADFG,结果表明,当温度为85℃,时间为120min时合成物的纯度达到最大。[0114] 表3.不同时间及温度对ADFG合成的影响的统计表[0115][0116] 由表3可知,通过控制变量法分别调控时间及温度,得到ADFG最佳的合成温度为85℃,最佳时间为120min。[0117] 根据上述实施例,结果由表4可见:通过控制反应时丙氨酸与麦芽糖的质量比可得出合成ADFG的丙氨酸与麦芽糖的质量比为1:3。[0118] 表4.反应时丙氨酸与麦芽糖的质量比对合成ADFG的影响的统计表[0119][0120] 根据上述实施例,结果由表5可见:通过控制丙酮对反应溶液的洗涤次数可得出合成ADFG用丙酮的洗涤次数为3‑4次。[0121] 表5.丙酮洗涤次数对合成ADFG的影响的统计表[0122][0123] 本发明化合物ADFG对CP诱导大鼠小肠隐窝细胞IEC‑6细胞的保护作用。[0124] 1、药物配制[0125] ADFG、精氨酸双糖苷(AFG)、组氨酸双糖苷(HFG)和精氨酸乳糖苷(AFGA)用DMEM高糖培养基溶解,配成母液浓度为1mM的溶液,分别稀释至浓度为1、2、4、8、16、32、64和128μM。分析级CP首先用千分之五的DMSO溶液进行溶液,随后加入DMEM高糖培养基溶解,使其成为400μM溶液。ADFG、AFG、HFG和AFGA自身性质不稳定,使用时需现用现配,且整个过程均在无菌条件下完成,药品溶解完成后,需经过0.22μM滤膜进行过滤使用。[0126] 2、细胞培养[0127] IEC‑6细胞株(正常大鼠小肠隐窝细胞)购自中国科学院上海细胞库,放置在Thermo培养箱中并环境条件为37℃和5%CO2进行培养。使用的培养液为DMEM培养基中含有10%FBS、1%青霉素和1%链霉素。在进行正式实验时的条件为:显微镜下观察IEC‑6细胞为正常的核型,并细胞贴壁生长处于对数生长期,密度达到80~90%时。[0128] 3、MTT法测试ADFG对细胞活力的影响[0129] 将IEC‑6细胞接种于96孔培养板中,使用CP和不同浓度的ADFG、AFG、HFG和AFGA对其进行处理,然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL),在37℃培养箱中孵育3.5h后形成深蓝色甲瓒晶体弃去培养基上清,每孔加入DMSO溶液150μL溶解甲瓒晶体,振板混匀5min。随后使用DR‑200B酶标仪在490nm处测量吸光度。只使用DMEM培养基处理的组别被标准化为100%活力。[0130] 4、数据处理[0131] 所有数据均以不同实验中建立的均数±标准差(Mean±S.D.)表示,并采用单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验进行分析。通过使用GraphPadPrism8.0.2软件(GraphPadSoftware,Inc,SanDiego,USA)产生统计图。以p<0.05,p<0.01或p<0.001为差异有统计学意义。[0132] 5、结果[0133] ADFG、AFG、HFG和AFGA对CP诱导的大鼠小肠隐窝细胞IEC‑6细胞衰老的保护作用见表6及表7。根据MTT结果显示,采用MTT法测定不同氨基酸糖苷类物质(ADFG、AFG、HFG、AGFA)使用不同浓度(1、2、4、8、16、32、64和128μM)在添加或不添加CP条件下对IEC‑6细胞活力的***影响,CP处理后细胞活力明显下降( p<0.001),给予ADFG、AFG显示出较好的保护活性,且### ## #以ADFG的保护效果最佳( p<0.001, p<0.01,p<0.05)。[0134] 另外,Ala(丙氨酸)单独给药,在上述浓度范围内,无保护作用,结果略,不在赘述。[0135] 由此得出,ADFG在对CP诱导的IEC‑6细胞衰老方面具有较好的优势。[0136] 表6ADFG和AFG对CP诱导IEC‑6细胞衰老的活性比较[0137][0138] 表7HFG和AFGA对CP诱导IEC‑6细胞衰老的活性比较[0139][0140] 以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是,这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释,并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下,可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰,这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。
专利地区:吉林
专利申请日期:2024-04-04
专利公开日期:2024-09-03
专利公告号:CN118255821B