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红参中化合物丙氨酸双糖苷ADFG的合成新方法

更新时间:2024-11-01
红参中化合物丙氨酸双糖苷ADFG的合成新方法 专利申请类型:实用新型专利;
地区:吉林-长春;
源自:长春高价值专利检索信息库;

专利名称:红参中化合物丙氨酸双糖苷ADFG的合成新方法

专利类型:实用新型专利

专利申请号:CN202410403891.9

专利申请(专利权)人:吉林农业大学
权利人地址:吉林省长春市新城大街2888号吉林农业大学中药材学院

专利发明(设计)人:李伟,王梓,胡锐意,李新殿,唐姗,姜爽,胡俊男,刘志

专利摘要:丙氨酸双糖苷(Alanine‑fructosyl‑glucose,ADFG)是人参在加工成红参的过程中发生美拉德反应生成的产物。目前尚未进行系统研究,按照红参中精氨酸双糖苷(AFG)、精氨酸单糖苷(AF)等其他氨基酸类衍生物的药理活性猜测,ADFG也应该具有类似的药理活性。因其在红参中含量较少且分离成本高,不足以满足实验研究,故本研究提供了一种化合物ADFG的高效人工合成方法,降低从红参中分离的成本,为后续研究提供物质基础,使具有经济高效、操作简单、安全等特点,适用于工业化生产。随后对其进行了体外IEC‑6细胞活性筛选,结果表明ADFG可以缓解低剂量顺铂(Cisplatin)诱导的IEC‑6细胞衰老,可用于抗衰老药物的应用。

主权利要求:
1.化合物ADFG在制备抗衰老药物中的应用,其特征在于,所述应用为在制备预防或者治疗顺铂(Cisplatin)诱导的肠粘膜细胞衰老药物中的应用,所述化合物ADFG的结构式如下:
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述化合物ADFG的人工合成方法包括:A.精确称取丙氨酸(L‑Ala)与D‑(+)‑麦芽糖,质量比例为1:1~1:5,置于20倍体积(以丙氨酸质量计,g/mL)的反应媒介中,且反应媒介的浓度为75%~100%;
B.置于恒温震荡摇床中,设置60~95℃进行反应60‑140min;
C.反应结束后使用有机试剂对其进行沉淀洗涤,抽滤,得到湿品,随后对其进行低温真空干燥得到丙氨酸双糖苷粗品。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,反应媒介为不同浓度的醋酸水溶液,v/v分别为75%、80%、85%、90%、95%醋酸水溶液;和冰醋酸。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,丙氨酸与麦芽糖的质量比例为1:3。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述丙氨酸按照10.0g计时、麦芽糖按照
30.0g计时,冰醋酸的使用量为200mL。
6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,反应温度为85℃。
7.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,选择的反应时间为120min。
8.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的有机试剂为丙酮,其中冰醋酸与丙酮的体积比为1:(15~20)。
9.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,洗涤次数为3‑4次,将冰醋酸清洗干净。 说明书 : 红参中化合物丙氨酸双糖苷ADFG的合成新方法技术领域[0001] 本发明属于有机化合物合成制备的技术领域,具体涉及一种化合物丙氨酸双糖苷(Alanine‑fructosyl‑glucose,ADFG)的人工合成方法及最佳工艺筛选。同时,公开了该化合物对低剂量顺铂(Cisplatin,CP)致肠粘膜细胞衰老的拮抗作用。背景技术[0002] 红参(Redginseng)系五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.经蒸制后的干燥根。美拉德反应(Maillardreaction,MR)是红参在加工炮制过程中发生的重要反应之一,红参中含有的氨基酸及还原糖会在加工炮制时进行羟醛缩合,生成非皂苷类成分(氨基酸[1,2] [3,4]类衍生物) ,并且该类成分具有显著的药理活性。1996年郑毅男教授 发现碱性氨基[5,6]酸精氨酸会在红参加工过程中与还原糖生成精氨酸双糖苷(AFG)具有较强的药理活性 ;目前研究表明,红参中还含有组氨酸双糖苷(HFG)、精氨酸乳糖苷(AFGA),并且中性氨基酸丙氨酸在人参中的含量也较高,在红参加工过程会使丙氨酸和人参中麦芽糖发生MR,生成丙氨酸双糖苷。[0003] 顺铂(Cisplatin,CP)化疗尽管有效,但其对肠粘膜细胞的毒性是一个严重问题,[7]尤其是当使用低剂量化疗时 。低剂量化疗旨在减少药物的全身毒性,通过诱导癌细胞衰老来抑制肿瘤生长,但这也导致正常肠粘膜细胞过早衰老。细胞衰老是一种细胞周期停滞[8]的状态,细胞在这种状态下会增大、代谢改变且线粒体功能受损 。因此,开发能够减轻CP引起的肠粘膜细胞衰老的方法,对于提高化疗的安全性和有效性至关重要。近期,一种新的美拉德反应产物在红参中被发现,并被命名为丙氨酸双糖苷(ADFG),它具有良好的抗氧化和抗炎活性,有望用于抗衰老药物的研发。因其分离成本较高,故对其进行人工合成获取大量该化合物,并且截至目前为止,关于红参化学成分的研究并未对丙氨酸双糖苷的人工合成进行报道。发明内容[0004] 本课题组创新发现并分离了丙氨酸与麦芽糖的合成物—丙氨酸双糖苷(Alanine‑fructosyl‑glucose,即ADFG),确定其结构为1‑(丙氨酸‑Nα基)‑1‑去氧‑4‑O‑(α‑D‑吡喃葡萄糖基)‑D‑果糖。并且ADFG在红参中含量较少并且分离困难且成本高,因此本发明使用丙氨酸与麦芽糖在酸性、高温的条件下进行人工合成大量制备。[0005] 本发明提供了一种操作简单、反应条件与反应温度容易控制、原料易得、合成率高的ADFG人工合成方法及最佳工艺筛选。[0006] 本发明所述的化合物命名为丙氨酸双糖苷,分子式为:C15H27NO12,结构式如下:[0007][0008] 本发明通过以下技术方案来实现:[0009] 本发明所述化合物ADFG的人工合成方法由以下步骤组成:[0010] 将一定比例的丙氨酸、麦芽糖置于酸性反应媒介中,混合均匀后在高温的条件下合成丙氨酸双糖苷,具体步骤如下所示:[0011] A.精确称取丙氨酸(L‑Ala)与D‑(+)‑麦芽糖,质量比例为1:1~1:5,置于20倍体积(以丙氨酸质量计,g/mL)的反应媒介中,且反应媒介的浓度为75%~100%;[0012] B.置于恒温震荡摇床中,设置60~95℃进行反应60‑140min;[0013] C.反应结束后使用有机试剂对其进行沉淀洗涤,抽滤,得到湿品,随后对其进行低温真空干燥得到丙氨酸双糖苷粗品;[0014] 作为本发明的一种优选技术方案,反应媒介为不同浓度的醋酸水溶液(v/v),分别为75%、80%、85%、90%、95%醋酸水溶液和冰醋酸,优选的反应媒介为冰醋酸。[0015] 作为本发明的一种优选技术方案,丙氨酸与麦芽糖的质量比例分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5,优选质量比例为1:3。[0016] 作为本发明的一种优选技术方案,选择的反应温度范围为60、70、80、85、90、95℃,优选反应温度为85℃。[0017] 作为本发明的一种优选技术方案,选择的反应时间范围为60、80、100、120、140、160min,优选反应时间为120min。[0018] 作为本发明的一种优选方案,所述的有机试剂为丙酮,单次沉淀洗涤使用量与反应媒介体积比为(15~20):1。[0019] 作为本发明的一种优选方案,使用有机试剂丙酮洗涤3~4次,可将反应媒介洗净。[0020] 本发明相对于现有技术的优点在于:[0021] 首次实现化合物丙氨酸双糖苷的人工合成制备,并且对现有相关的技术进行总结与优化,进行综合考察之后得到操作更加简单、成本低和合成率高的方法,粗品合成率可达72%以上,白色无味沉淀,对其进一步纯化分离后纯度可达97%以上。[0022] 本发明进一步提供了所述的化合物ADFG在制备抗衰老药品和/或保健品中的应用,具体地,在制备预防、治疗或者改善低剂量CP诱导的IE‑6细胞衰老中的应用。附图说明[0023] 图1为本发明ADFG的美拉德反应路线示意图[0024] 图2为本发明ADFG的HPLC‑ELSD谱图[0025] 图3为本发明不同醋酸浓度对丙氨酸与麦芽糖合成反应的影响[0026] 图4为本发明不同反应温度对丙氨酸与麦芽糖合成反应的影响[0027] 图5为本发明不同反应时间对丙氨酸与麦芽糖合成反应的影响[0028] 图6为本发明物质不同质量比对丙氨酸与麦芽糖合成反应的影响[0029] 图7为本发明ADFG的1H‑NMR谱图[0030] 图8为本发明ADFG的13C‑NMR谱图[0031] 图9为本发明ADFG的HMBC谱图[0032] 图10为本发明ADFG的HSQC谱图[0033] 图11为本发明ADFG的HR‑ESI‑MS谱图[0034] 参考文献:[0035] [1]李向高,郑毅男,刘墨祥,等.红参加工中梅拉德反应及其产物的研究[J].吉林农业大学学报,1997,(04):10‑6.[0036] [2]杜芹芹,宋凤瑞,刘志强,等.红参加工过程中梅拉德初级反应产物的研究[J].化学学报,2010,68(13):1331‑6.[0037] [3]郑毅男,松浦幸永,韩立坤,高久武司,向兰,龟田健治,李向高,奥田拓道.红参中新化合物──精氨酸衍生物的分离与结构鉴定[J].药学学报,1996,(03):191‑5.[0038] [4]郑毅男,奥田拓道,韩立坤,等.红参中的一种新氨基酸衍生物(英文)[J].JournalofChinesePharmaceuticalSciences,1998,(01):7‑10.[0039] [5]LEEJ‑S,KIMG‑N,LEES‑H,etal.Invitroandcellularantioxidantactivityofarginyl‑fructoseandarginyl‑fructosyl‑glucose[J].FoodScienceandBiotechnology,2009,18(6):1505‑10.[0040] [6]LIUW,ZHANGH,HOUY‑Y,etal.Arginyl‑fructosyl‑glucose,amajorMaillardreactionproductofredginsengmitigatescisplatin‑evokedintestinaltoxicityinvivoandinvitro[J].Food&Function,2022,13(21):11283‑97.[0041] [7]SHAHIDF,FAROOQUIZ,KHANF.Cisplatin‑inducedgastrointestinaltoxicity:Anupdateonpossiblemechanismsandonavailablegastroprotectivestrategies[J].EuropeanJournalofPharmacology,2018,827:49‑57.[0042] [8]MIWAS,KASHYAPS,CHINIE,etal.Mitochondrialdysfunctionincellsenescenceandaging[J].TheJournalofclinicalinvestigation,2022,132(13).具体实施方式[0043] 下面将结合具体实施例对本发明所述的人工合成方法及抗衰老活性进行进一步说明,但本发明所保护的范围并局限于次。[0044] 所述的丙氨酸双糖苷ADFG是由前期本课题组从红参中分离得到,鉴定如下:[0045] 根据HR‑ESI‑MSm/z:412.145[M‑H]‑(计算值:413.15),结合NMR谱确定其分子式为C15H27NO12。经鉴定,化合物结构为(Ⅰ)。[0046][0047] 表1化合物ADFG的1H‑NMR和13C‑NMR的化学位移及HMBC数据(D2O)[0048][0049] 丙氨酸双糖苷粗合成物的检测[0050] 1.1检测方法:使用高效液相色谱‑蒸发光散射检测技术(HPLC‑ELSD)对所得粗合成物进行含量检测。[0051] 1.2样品制备:各组分别精密称取丙氨酸双糖苷粗品5.0mg,使用0.1moL/L的盐酸溶液定容至2mL容量瓶中,即得液相进样样品,浓度为2.5mg/mL。[0052] 1.3色谱条件:月旭 AminoAcidPlus氨基酸二代专用色谱柱(4.6mm×300mm),蒸发光散射检测器,漂移管温度120℃,载气流速3.2L/min,以0.3%七氟丁酸溶液(A)和乙腈(B)为流动相,梯度洗脱:0~10min,100%A;10~15min,100%~93%A;15~40min,93%~50%A;40~41min,50%~100%A,41~60min,100%A;柱温30℃,进样量20μL,流速1.0mL/min。流动相的配制:0.3%七氟丁酸溶液:取997mL水,加入3mL七氟丁酸,混匀,超声脱气,即得。[0053] 实施例1:[0054] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL75%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重。由于反应褐变不明显,反应物沉淀在底部,因此对其进行水溶解后冻干,检测样品中ADFG含量,重复试验3次,均产物得率为86.3%,ADFG纯度为4.9%。[0055] 实施例2:[0056] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL80%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重。由于反应褐变不明显,反应物沉淀在底部,因此对其进行水溶解后冻干,检测样品中ADFG含量,重复试验3次,均产物得率为82.7%,ADFG纯度为18.5%。[0057] 实施例3:[0058] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL85%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重。由于反应褐变不明显,反应物沉淀在底部,因此对其进行水溶解后冻干,检测样品中ADFG含量,重复试验3次,均产物得率为78.4%,ADFG纯度为31.6%。[0059] 实施例4:[0060] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL90%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为73.6%,ADFG纯度为59.1%。[0061] 实施例5:[0062] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL95%醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为68.3%,ADFG纯度为60.7%。[0063] 实施例6:[0064] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为68.7%,ADFG纯度为69.1%。[0065] 实施例7:[0066] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于60℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为89.3%,ADFG纯度为2.1%。[0067] 实施例8:[0068] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于70℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为79.6%,ADFG纯度为38.2%。[0069] 实施例9:[0070] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于80℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为70.1%,ADFG纯度为60.1%。[0071] 实施例10:[0072] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为63.6%,ADFG纯度为72.2%。[0073] 实施例11:[0074] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于90℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为55.3%,ADFG纯度为70.3%。[0075] 实施例12:[0076] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于95℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为49.7%,ADFG纯度为68.7%。[0077] 实施例13:[0078] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应60min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为78.6%,ADFG纯度为32.3%。[0079] 实施例14:[0080] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应80min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为72.3%,ADFG纯度为43.7%。[0081] 实施例15:[0082] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应100min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为68.7%,ADFG纯度为62.1%。[0083] 实施例16:[0084] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为65.3%,ADFG纯度为72.6%。[0085] 实施例17:[0086] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应140min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为59.4%,ADFG纯度为65.8%。[0087] 实施例18:[0088] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应160min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为51.2%,ADFG纯度为60.3%。[0089] 实施例19:[0090] 精密称取10g丙氨酸和10g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为75.6%,ADFG纯度为46.2%。[0091] 实施例20:[0092] 精密称取10g丙氨酸和20g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为69.1%,ADFG纯度为59.7%。[0093] 实施例21:[0094] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为64.3%,ADFG纯度为71.9%。[0095] 实施例22:[0096] 精密称取10g丙氨酸和40g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为79.8%,ADFG纯度为62.3%。[0097] 实施例23:[0098] 精密称取10g丙氨酸和50g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为82.3%,ADFG纯度为56.2%。[0099] 实施例24:[0100] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤1次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为65.3%,ADFG纯度为70.1%。[0101] 实施例25:[0102] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤2次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为64.1%,ADFG纯度为71.3%。[0103] 实施例26:[0104] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤3次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为62.7%,ADFG纯度为72.5%。[0105] 实施例27:[0106] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤4次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为61.9%,ADFG纯度为72.7%。[0107] 实施例28:[0108] 精密称取10g丙氨酸和30g麦芽糖,置于200mL冰醋酸中,混匀后置于85℃的恒温水浴摇床上,进行反应120min,结束后立即对其进行降温处理终止反应,使用丙酮对其反应液洗涤5次,进行抽滤,粗合成物低温干燥后称重,重复试验3次,均产物得率为61.6%,ADFG纯度为72.0%。[0109] 根据上述实施例,结果由表2可知:通过对不同浓度的醋酸调控合成ADFG,实验结果表明,当醋酸浓度为冰醋酸时反应时产物得率及纯度能达到理想状态。[0110] 表2.不同浓度醋酸对ADFG合成的影响的统计表[0111][0112] 由表2可知,反应媒介为冰醋酸时纯度达到最高,且经济适用。[0113] 根据上述实施例,结果由表3可知:通过对时间及温度的调控来合成ADFG,结果表明,当温度为85℃,时间为120min时合成物的纯度达到最大。[0114] 表3.不同时间及温度对ADFG合成的影响的统计表[0115][0116] 由表3可知,通过控制变量法分别调控时间及温度,得到ADFG最佳的合成温度为85℃,最佳时间为120min。[0117] 根据上述实施例,结果由表4可见:通过控制反应时丙氨酸与麦芽糖的质量比可得出合成ADFG的丙氨酸与麦芽糖的质量比为1:3。[0118] 表4.反应时丙氨酸与麦芽糖的质量比对合成ADFG的影响的统计表[0119][0120] 根据上述实施例,结果由表5可见:通过控制丙酮对反应溶液的洗涤次数可得出合成ADFG用丙酮的洗涤次数为3‑4次。[0121] 表5.丙酮洗涤次数对合成ADFG的影响的统计表[0122][0123] 本发明化合物ADFG对CP诱导大鼠小肠隐窝细胞IEC‑6细胞的保护作用。[0124] 1、药物配制[0125] ADFG、精氨酸双糖苷(AFG)、组氨酸双糖苷(HFG)和精氨酸乳糖苷(AFGA)用DMEM高糖培养基溶解,配成母液浓度为1mM的溶液,分别稀释至浓度为1、2、4、8、16、32、64和128μM。分析级CP首先用千分之五的DMSO溶液进行溶液,随后加入DMEM高糖培养基溶解,使其成为400μM溶液。ADFG、AFG、HFG和AFGA自身性质不稳定,使用时需现用现配,且整个过程均在无菌条件下完成,药品溶解完成后,需经过0.22μM滤膜进行过滤使用。[0126] 2、细胞培养[0127] IEC‑6细胞株(正常大鼠小肠隐窝细胞)购自中国科学院上海细胞库,放置在Thermo培养箱中并环境条件为37℃和5%CO2进行培养。使用的培养液为DMEM培养基中含有10%FBS、1%青霉素和1%链霉素。在进行正式实验时的条件为:显微镜下观察IEC‑6细胞为正常的核型,并细胞贴壁生长处于对数生长期,密度达到80~90%时。[0128] 3、MTT法测试ADFG对细胞活力的影响[0129] 将IEC‑6细胞接种于96孔培养板中,使用CP和不同浓度的ADFG、AFG、HFG和AFGA对其进行处理,然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL),在37℃培养箱中孵育3.5h后形成深蓝色甲瓒晶体弃去培养基上清,每孔加入DMSO溶液150μL溶解甲瓒晶体,振板混匀5min。随后使用DR‑200B酶标仪在490nm处测量吸光度。只使用DMEM培养基处理的组别被标准化为100%活力。[0130] 4、数据处理[0131] 所有数据均以不同实验中建立的均数±标准差(Mean±S.D.)表示,并采用单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验进行分析。通过使用GraphPadPrism8.0.2软件(GraphPadSoftware,Inc,SanDiego,USA)产生统计图。以p<0.05,p<0.01或p<0.001为差异有统计学意义。[0132] 5、结果[0133] ADFG、AFG、HFG和AFGA对CP诱导的大鼠小肠隐窝细胞IEC‑6细胞衰老的保护作用见表6及表7。根据MTT结果显示,采用MTT法测定不同氨基酸糖苷类物质(ADFG、AFG、HFG、AGFA)使用不同浓度(1、2、4、8、16、32、64和128μM)在添加或不添加CP条件下对IEC‑6细胞活力的***影响,CP处理后细胞活力明显下降( p<0.001),给予ADFG、AFG显示出较好的保护活性,且### ## #以ADFG的保护效果最佳( p<0.001, p<0.01,p<0.05)。[0134] 另外,Ala(丙氨酸)单独给药,在上述浓度范围内,无保护作用,结果略,不在赘述。[0135] 由此得出,ADFG在对CP诱导的IEC‑6细胞衰老方面具有较好的优势。[0136] 表6ADFG和AFG对CP诱导IEC‑6细胞衰老的活性比较[0137][0138] 表7HFG和AFGA对CP诱导IEC‑6细胞衰老的活性比较[0139][0140] 以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是,这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释,并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下,可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰,这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

专利地区:吉林

专利申请日期:2024-04-04

专利公开日期:2024-09-03

专利公告号:CN118255821B


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