专利名称:一种具有生长优势的棘头梅童鱼培育方法
专利类型:发明专利
专利申请号:CN202410301432.X
专利申请(专利权)人:象山港湾水产苗种有限公司,宁波大学
权利人地址:浙江省宁波市象山县黄避岙乡外高泥村凤凰礁
专利发明(设计)人:徐万土,陶顺顺,竺俊全,曾肖,谢海军,陈裕,徐芳君,杨辉,黄富林
专利摘要:本发明提供一种具有生长优势的棘头梅童鱼培育方法,是使用特定的分子标记来选育具有快速生长性状的棘头梅童鱼,所述的分子标记为与棘头梅童鱼生长性状相关的SNP位点,所述的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1的核酸片段的第108位,为G或A。本发明通过分析位点基因型与棘头梅童鱼生长性状的相关性,发现棘头梅童鱼与生长性状相关的SNP位点,基因型为GG纯合型个体的体重、体长、体全长均显著高于GA与AA基因型个体生长性状的表型值,并通过PCR与基因测序法可快速鉴定对应性状。因此,生产中可优先选择该位点基因型为GG型个体作为亲本进行规模养殖。
主权利要求:
1.一种筛选具有快速生长潜力的棘头梅童鱼个体的方法,其特征在于,所述的方法是通过检测SNP位点的基因型来筛选具有快速生长潜力的棘头梅童鱼个体,所述的SNP位点位于序列为SEQIDNO:1的核酸片段的第108位,为G或A;
所述的方法是通过PCR扩增待检测的棘头梅童鱼个体的核酸样品,PCR产物进行基因测序分析后确定待检测的个体的基因型,来筛选具有快速生长潜力的个体;
所述的PCR扩增,其中使用的引物对,其上下游引物的序列为SEQIDNO:2、SEQIDNO:
3;
所述的SNP位点的基因型分型,是筛选基因型为GG纯合型个体。 说明书 : 一种具有生长优势的棘头梅童鱼培育方法技术领域[0001] 本发明属于鱼苗及鱼种繁殖技术领域,主要涉及一种具有生长优势的棘头梅童鱼培育方法。背景技术[0002] 棘头梅童鱼(Collichthyslucidus),俗称梅童,小金鳞,是我国重要的小型底栖经济鱼类,短期洄游、喜栖息于低盐度温水水域。棘头梅童鱼广泛分布于我国黄渤海、东海和南海水域,适温、适盐范围广,肉质细腻,味道鲜美,终年可以捕获,深受沿海居民的喜爱。然而,棘头梅童鱼有限的种群规模和繁衍速率难以满足市场需求,现已出现过度捕捞和种群衰退的危险。[0003] 棘头梅童鱼的生长速度是决定其在养殖过程中生产成本和经济效益的关键因素之一,生长性状的遗传选育已成为提高动物生长性状的重要手段。将鱼类的表型特征作为选育目标,结合分子标记辅助选择育种(molecularmarker‑assistedselection,MAS)可以缩短选育时间,提高选育效率,在优良性状的遗传选育中得到广泛应用。然而,目前对于棘头梅童鱼生长性状的分子标记开发及分子标记辅助选育生长速度快棘头梅童鱼新品种的报道,仍然较少。发明内容[0004] 本发明的主要目的是提供一种具有生长优势的棘头梅童鱼培育方法,是使用特定的分子标记来选育具有快速生长性状的棘头梅童鱼,从而弥补现有繁育技术的不足。[0005] 本发明首先提供一种与棘头梅童鱼生长性状相关的SNP位点,所述的SNP位点位于序列为SEQIDNO:1的核酸片段的第108位,为G或A;[0006] 本发明提供的SNP位点用于选育具有快速生长潜力的棘头梅童鱼个体。[0007] 本发明另一个方面提供一种筛选具有快速生长潜力的棘头梅童鱼个体的方法,是通过检测上述的SNP位点来实现的;[0008] 所述的方法,是通过PCR扩增待检测的棘头梅童鱼个体的核酸样品,PCR产物进行基因测序分析后确定待检测的个体的基因型,来确定是否具有快速生长潜力;[0009] 所述的PCR扩增方法,其中所使用的引物的序列信息如下:[0010] F:5’‑TGAGGCAGCATTGTGTGAGT‑3’(SEQIDNO:2),[0011] R:5’‑GAAGGAACTGGCAGCCACA‑3’(SEQIDNO:3);[0012] 所述的PCR与基因测序分析,是确定SNP位点的基因型分型,其中基因型为GG纯合型个体的体长、体高、体重均显著高于GA和AA基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。[0013] 本发明通过分析位点基因型与棘头梅童鱼生长性状的相关性,发现棘头梅童鱼与生长性状相关的SNP位点,基因型为GG纯合型个体的体重、体长、体全长均显著高于GA与AA基因型个体生长性状的表型值(p<0.05),并通过PCR与基因测序法可快速鉴定对应性状。因此,生产中可优先选择该位点基因型为GG型个体作为亲本进行规模养殖。附图说明[0014] 图1:SNP6多态性位点;[0015] 图2:标记组和其他组棘头梅童鱼一龄的生长性状数据图;[0016] 图3:子代棘头梅童鱼一龄生长数据柱状图。具体实施方式[0017] 在国家重点研发计划“海洋农业与淡水渔业科技创新”重点专项—东海渔业资源一体化修复与海洋牧场构建技术(2023YFD2401902)项目的支持下,本发明利用RNA‑Seq测序技术对棘头梅童鱼生长差异个体进行分析,筛选有利于生长的相关候选基因及通路,开发生长性状相关的SNP分子标记,提高优良品种选择效率,为棘头梅童鱼种质资源保护和合理开发提供重要的依据。[0018] 下面通过实施例和附图对本发明做进一步说明。[0019] 实施例1:筛选SNP位点[0020] 1、实验动物[0021] SNP生长位点初筛所用样品为从上海某水产养殖公司实验基地饲养的棘头梅童鱼生长选育系F0中选取的体长5%极大值(Max,体长18cm)和5%极小值(Min,体长<6cm)2种极端表型个体各30尾,测量其体长、体高、体重等生长相关性状数据,‑20℃保存备用。[0022] 2、DNA提取[0023] (1)处理材料:动物组织(脾组织用量应少10mg)应先打碎处理为细胞悬液,然后10,000r/min离心1min,倒尽上清,加200μl缓冲液GA,振荡至彻底悬浮。[0024] (2)加入20μlProteinaseK溶液,混匀。在56℃放置,直至组织溶解,简短离心以去除管盖内壁的水珠,再进行下一步骤。[0025] (3)加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10min,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。[0026] (4)加人200μl无水乙醇,充分振荡混匀15sec,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。[0027] (5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12,000r/min离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。[0028] (6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000r/min离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。[0029] (7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000r/min离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。[0030] (8)重复操作步骤7。[0031] (9)将吸附柱CB3放回收集管中,12,000r/min离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。[0032] (10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50‑200μl洗脱缓冲液TE,室温放置2‑5min,12,000r/min离心2min,将溶液收集到离心管中,即得到样品基因组DNA。[0033] (11)将装有基因组DNA的离心管做好标记,‑20℃冰箱保存。[0034] 使用分光光度计对样品进行检测,记录OD260/OD280值、OD260/OD230和样品浓度,样本标准为浓度>20ng/uL,OD260/OD280比值符合1.7,OD260/OD230比值>1.5,表明DNA样本达到标准。[0035] 3、SNP标记位点的筛选[0036] 参考棘头梅童鱼基因序列(GenBankID:240159),利用Primer5软件对基因分段设计引物,扩增基因全长,共设计6对引物。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。进行PCR扩增,将检测合格的PCR产物送交上海迈浦生物科技有限公司测序,读取峰图。[0037] 使用6对引物进行扩增测序,共获得10个SNP标记位点,详见表1。[0038] 表1:部分棘头梅童鱼SNP引物序列信息表[0039][0040] 使用PopGene3.2对生长性状极端群体进行观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、哈温平衡(Hardy‑Weinbergequilibrium,HWE)和遗传多样性指数(Nei)分析和计算,在Cervus中计算位点多态信息含量(PIC)。卡方检验10个SNP标记位点与棘头梅童鱼生长极端群体的相关性。采用一般线性模型(Generallinearmodel,GLM)对60尾棘头梅童鱼个体各位点基因型与其5个生长性状进行相关性分析,以体长、体重等形态性状为因变量,筛选得到的SNP标记位点的不同基因型为自变量。[0041] 在具有显著生长性状的棘头梅童鱼群体中进行多态性检测,结果显示(表2),极大群体PIC范围为0~0.39,平均值为0.252;Ho在0.02~0.68,平均值为0.305;He在0.16~0.51,平均值为0.359;极小群体PIC范围为0~0.36,平均值为0.192;Ho在0.22~0.70,平均值为0.387;He在0.14~0.51,平均值为0.371。哈温平衡分析发现极大鱼群体和极小鱼群体中均有2个SNP标记位点显著偏离平衡(P<0.05)。[0042] 表2:棘头梅童鱼SNP标记为点多态性信息表[0043][0044] 将10个SNP标记在2个生长性状极端棘头梅童鱼群体中的各基因型比例进行统计(表3),经卡方检验标记位点在极端群体中与生长性状存在潜在相关性。[0045] 表3:棘头梅童鱼极大群体和极小群体中的SNPs基因型分布表[0046][0047][0048] *表示位点在极端群体中与生长性状存在潜在相关性[0049] 关联显著的2个SNP标记位点的不同基因型间生长性状进行多重比较,结果(表4)显示,SNP6位点的GG基因型个体3种性状参数的平均值均高于基因型GA和AA。[0050] 表4:与生长性状显著相关的2个SNP标记位点不同基因型棘头梅童鱼生长性状的多重比较表[0051][0052] 将PCR产物送至生物公司测序,其中SNP6位点位于SEQIDNO:1的序列的第108位,为G/A替换(图1),基因序列如下:[0053] TTTTGATGAGGCAGCATTGTGTGAGTCCCTGAGAAAAGCTGTTACCAAGTCTGGTTACGTGAAGCCGACCCCTGTACAGAAGCATGGGATCCCAATCATCTCTGCTGACAGAGATCTCATGGCCTGTGCTCAAACTGGATCTGGTAAAACGGCTGCGTTCCTGCTCCCTATTCTGCAGCAGCTGATGACAGACGGTGTGGCTGCCAGTTCCTTCA(SEQIDNO:1)。[0054] 用于检测该位点的引物对序列如下:[0055] 正向引物F:TGAGGCAGCATTGTGTGAGT(SEQIDNO:2)、[0056] 反向引物R:GAAGGAACTGGCAGCCACA(SEQIDNO:3),[0057] 使用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的上下游引物进行扩增,在SNP6标记位点存在GG、GA和AA三种基因型,其中GG的个体生长情况优于基因型为GA和AA,表明基因型GG为优势的生长基因型。[0058] 实施例2:使用SNP位点筛选具有生长优势的棘头梅童鱼[0059] 在上海某渔业养殖公司饲养池选取健康、发育良好、无损的棘头梅童鱼鱼苗,用无损的方式采样,获得棘头梅童鱼组织获得每头棘头梅童鱼的基因组DNA,使用上下游序列为SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的引物对SNP6标记位点进行扩增检测,筛选基因型为GG的个体。[0060] 从总共1500只棘头梅童鱼中共筛选了150只具有SNP6标记位点的棘头梅童鱼,其中基因型为GG个体共50只。将筛选出的个体与其它个体在相同的养殖条件下进行室内养殖,养殖一年后进行生长性状测量(表5、图2),结果表明含有特定条带的个体具有显著的生长效果。[0061] 表5:标记组和其它组棘头梅童鱼一龄的生长性状数据表[0062][0063] 将筛选获得的基因型为GG的个体为亲本进行子代繁育,待子代生长至1龄时随机选取无明显损伤、表观无病变、活力好的个体200头,利用游标卡尺和天平测量棘头梅童鱼形态性状(表6/图3)。[0064] 表6:子代棘头梅童鱼一龄生长性状数据表[0065][0066][0067] 结果可见,使用本发明提供的SNP位点所筛选的棘头梅童鱼GG基因型个体其生长速度显著高于GA与AA型个体,以筛选出来的个体为亲本进行繁育,获得的子代也具有生长优势,证实本发明所提供的SNP标记位点能够用于更好生长性状的棘头梅童鱼亲本的筛选。
专利地区:浙江
专利申请日期:2024-03-15
专利公开日期:2024-09-03
专利公告号:CN118147315B