专利名称:依柯胰岛素的制备方法
专利类型:发明专利
专利申请号:CN202311731287.0
专利申请(专利权)人:瀚晖制药有限公司
权利人地址:浙江省杭州市富阳区胥口镇海正路2号
专利发明(设计)人:王二文,徐有富,李小益,潘宜武,王智鸣
专利摘要:本发明涉及胰岛素技术领域,尤其是涉及一种依柯胰岛素的制备方法,包括如下步骤:(a)将固相包涵体进行变性、复性、酶切,得到胰岛素前体;(b)在胰岛素前体上连接脂肪酸侧链,制备得到依柯胰岛素;变性缓冲液为含8~12mM NaHCO3和0.1~1.2mM的EDTA的水溶液;复性缓冲液为pH为8.9~9.1的、含22~28mM甘氨酸和5~25mM Tris的水溶液。本发明通过对依柯胰岛素的制备过程中的变性和复性的条件进行改变,降低了变复性的成本、环保压力和能耗,同时缩短复性时间和保证了收率。
主权利要求:
1.依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(a)将固相包涵体进行变性、复性、酶切,得到胰岛素前体;
(b)在所述胰岛素前体上连接脂肪酸侧链,制备得到依柯胰岛素;
其中,所述变性处理包括:将所述固相包涵体加入变性缓冲液中,并调节pH至11.9~
12.1,搅拌使包涵体溶解;再加入β‑巯基乙醇,室温下,搅拌反应30min以上,得到变性溶液;
所述复性处理包括:将所述变性溶液与4~9倍体积的复性缓冲液混合,然后加入硫酸铜溶液,于16~24℃、pH为9.2~9.3的条件下,搅拌复性2h以上;
所述变性缓冲液为含8~12mMNaHCO3和0.1~1.2mM的EDTA的水溶液;所述复性缓冲液为pH为8.9~9.1的、含22~28mM甘氨酸和5~25mMTris的水溶液;
所述变性处理中,所述固相包涵体的用量与所述变性缓冲液的用量的比例为(7~7.5)g﹕100mL;
步骤(b)中,所述连接脂肪酸侧链的方法包括:(b1)在所述胰岛素前体的溶液中加入硼酸或碳酸氢钠后,再加入乙腈,并调节pH至
10.2~10.5;
(b2)在20~25℃条件下,将侧链活化酯溶液加入步骤(b1)的溶液中,避光反应15~
20min;然后加入乙醇胺终止反应;
所述加入乙腈,使乙腈在加入乙腈后的所述胰岛素前体的溶液中的体积分数为30%~
50%;加入乙腈后的所述胰岛素前体的溶液中,胰岛素前体的浓度为4~5mg/mL;
所述连接脂肪酸侧链中,所述胰岛素前体与所述侧链活化酯的摩尔比为1﹕(1.5~
2.4);
所述侧链活化酯为不含有保护基的侧链活化酯,其结构式为:;
所述连接脂肪酸侧链中,所述胰岛素前体与所述侧链活化酯的摩尔比为1﹕(1.2~
3.0)。
2.根据权利要求1所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,所述变性处理中,采用氢氧化钠水溶液调节pH值11.9~12.1。
3.根据权利要求2所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,所述加入β‑巯基乙醇使变性处理的体系中,所述β‑巯基乙醇的浓度为0.38~0.42mL/L。
4.根据权利要求1所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,所述复性缓冲液中,所述Tris的浓度为15~25mM。
5.根据权利要求2所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,加入所述硫酸铜溶液,使所述硫酸铜的终浓度为1.8~2.2μM。
6.根据权利要求1所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,所述搅拌复性的时间为
5~7h。
7.根据权利要求6所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,所述搅拌复性中,所述搅拌的转速为200~300rpm。
8.根据权利要求1所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,所述加入硼酸,使硼酸在加入乙腈后的所述胰岛素前体的溶液中的浓度为0.08~0.12M。
9.根据权利要求1所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,加入碳酸氢钠,使碳酸氢钠在加入乙腈后的所述胰岛素前体的溶液中的浓度为0.08~0.12M。
10.根据权利要求1所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,所述加入乙醇胺,使所述乙醇胺的体积与所述避光反应后的体系的体积比为(0.0018~0.0022)﹕1。
11.根据权利要求1所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,步骤(b)还包括:向所述连接脂肪酸侧链后的体系中加入2~2.5倍体积的水,调节pH至5.7~5.9;然后进行反相层析纯化。
12.根据权利要求11所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,将所述反相层析纯化后的物料进行超滤、结晶、冻干,得到依柯胰岛素。
13.根据权利要求1所述的依柯胰岛素的制备方法,其特征在于,将所述复性后的样品进行浓缩后再进行所述酶切。 说明书 : 依柯胰岛素的制备方法技术领域[0001] 本发明涉及胰岛素技术领域,尤其是涉及一种依柯胰岛素的制备方法。背景技术[0002] 胰岛素类药物用于治疗糖尿病,目前的胰岛素需要每日注射,而每日给药的方式增加了副作用发生概率,降低了患者用药的顺应性。依柯胰岛素是诺和诺德研发的新一代长效胰岛素,依柯胰岛素具备更长的半衰期。在注射进人体后,依柯胰岛素会与白蛋白紧密但可逆的结合在一起,使得其可在一周时间内连续、缓慢且稳定地降低血糖,因而可实现一周注射一次。具体依柯胰岛素的结构如下:[0003][0004] 现有的依柯胰岛素的制备中,在变复性过程中,尿素用量大,成本高,且环保压力大;同时复性要求低温,且时间长,能耗高。[0005] 有鉴于此,特提出本发明。发明内容[0006] 本发明的目的在于提供依柯胰岛素的制备方法,以解决现有技术中存在的变复性过程的成本高、环保压力大、能耗高等技术问题。[0007] 为了实现本发明的上述目的,本发明提供了一种依柯胰岛素的制备方法,包括如下步骤:[0008] (a)将固相包涵体进行变性、复性、酶切,得到胰岛素前体;[0009] (b)在所述胰岛素前体上连接脂肪酸侧链,制备得到依柯胰岛素;[0010] 其中,所述变性处理包括:将所述固相包涵体加入变性缓冲液中,并调节pH至11.9~12.1,搅拌使包涵体溶解;再加入β‑巯基乙醇,室温下,搅拌反应30min以上,得到变性溶液;[0011] 所述复性处理包括:将所述变性溶液与4~9倍体积的复性缓冲液混合,然后加入硫酸铜溶液,于16~24℃、pH为9.2~9.3的条件下,搅拌复性2h以上;[0012] 所述变性缓冲液为含8~12mMNaHCO3和0.1~1.2mM的EDTA的水溶液;所述复性缓冲液为pH为8.9~9.1的、含22~28mM甘氨酸和5~25mMTris的水溶液。[0013] 在本发明的具体实施方式中,所述变性处理中,采用氢氧化钠水溶液调节pH值11.9~12.1。进一步地,所述加入β‑巯基乙醇使变性处理的体系中,所述β‑巯基乙醇的浓度为0.38~0.42mL/L。[0014] 在本发明的具体实施方式中,所述变性处理中,所述固相包涵体的用量与所述变性缓冲液的用量的比例为(5~8)g﹕100mL,优选为(7~7.5)g﹕100mL。[0015] 在本发明的具体实施方式中,所述复性缓冲液中,所述Tris的浓度为15~25mM。[0016] 在本发明的具体实施方式中,加入所述硫酸铜溶液,使所述硫酸铜的终浓度为1.8~2.2μM。[0017] 在本发明的具体实施方式中,所述搅拌复性中,所述搅拌的转速为200~300rpm。进一步地,所述搅拌复性的时间为5~7h。[0018] 在本发明的具体实施方式中,步骤(b)中,所述连接脂肪酸侧链的方法包括:(b1)在所述胰岛素前体的溶液中加入硼酸或碳酸氢钠后,再加入乙腈,并调节pH至10.2~10.5;[0019] (b2)在20~25℃条件下,将侧链活化酯溶液加入步骤(b1)的溶液中,避光反应15~20min;然后加入乙醇胺终止反应。[0020] 在本发明的具体实施方式中,所述加入硼酸,使硼酸在加入乙腈后的所述胰岛素前体的溶液中的浓度为0.08~0.12M;[0021] 加入碳酸氢钠,使碳酸氢钠在加入乙腈后的所述胰岛素前体的溶液中的浓度为0.08~0.12M;[0022] 所述加入乙腈,使乙腈在加入乙腈后的所述胰岛素前体的溶液中的体积分数为30%~50%;[0023] 所述加入乙醇胺,使所述乙醇胺的体积与所述避光反应后的体系的体积比为(0.0018~0.0022)﹕1。[0024] 在本发明的具体实施方式中,所述连接脂肪酸侧链中,所述胰岛素前体与所述侧链活化酯的摩尔比为1﹕(1.2~3.0),优选为1﹕(1.5~2.4)。[0025] 在本发明的具体实施方式中,步骤(b1)中,加入乙腈后的所述胰岛素前体的溶液中,胰岛素前体的浓度为1~5mg/mL,优选为4~5mg/mL。[0026] 在本发明的具体实施方式中,所述侧链活化酯溶液为所述侧链活化酯的DMF溶液。进一步地,所述侧链活化酯溶液的浓度为10~30g/L。[0027] 在本发明的具体实施方式中,步骤(b)还包括:向所述连接脂肪酸侧链后的体系中加入2~2.5倍体积的水,调节pH至5.7~5.9;然后进行反相层析纯化。进一步地,将所述反相层析纯化后的物料进行超滤、结晶、冻干,得到依柯胰岛素。[0028] 在本发明的具体实施方式中,将所述复性后的样品进行浓缩后再进行所述酶切。其中,所述浓缩包括超滤洗脱浓缩澄清,得到浓度为8~12g/L的溶液。[0029] 与现有技术相比,本发明的有益效果为:[0030] (1)本发明通过对依柯胰岛素的制备过程中的变性和复性的条件进行改变,降低了变复性的成本、环保压力和能耗,同时缩短复性时间和保证了收率;[0031] (2)本发明进一步对连接脂肪酸侧链的路线进行改变,一方面免去了在胰岛素生产车间的脱保护工序,使得现有的胰岛素车间能够满足本发明的工艺路线的要求;另一方面通过对胰岛素前体与脱去保护基的侧链活化酯的反应条件进行优化,保证胰岛素的收率。具体实施方式[0032] 下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,但是本领域技术人员将会理解,下列所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。[0033] 本发明提供了一种依柯胰岛素的制备方法,包括如下步骤:[0034] (a)将固相包涵体进行变性、复性、酶切,得到胰岛素前体;[0035] (b)在胰岛素前体上连接脂肪酸侧链,制备得到依柯胰岛素;[0036] 其中,变性处理包括:将固相包涵体加入变性缓冲液中,并调节pH至11.9~12.1,搅拌使包涵体溶解;再加入β‑巯基乙醇,室温下,搅拌反应30min以上,得到变性溶液;[0037] 复性处理包括:将变性溶液与4~9倍体积的复性缓冲液混合,然后加入硫酸铜溶液,于16~24℃、pH为9.2~9.3的条件下,搅拌复性2h以上;[0038] 变性缓冲液为含8~12mMNaHCO3和0.1~1.2mM的EDTA的水溶液;复性缓冲液为pH为8.9~9.1的、含22~28mM甘氨酸和5~25mMTris的水溶液。[0039] 本发明通过对依柯胰岛素的制备过程中的变性和复性的条件进行改变,降低了变复性的成本、环保压力和能耗,同时缩短复性时间和保证了收率。[0040] 如在不同实施方式中,变性处理中,将固相包涵体加入变性缓冲液中,可调节pH至11.9、12或12.1。[0041] 如在不同实施方式中,复性处理中,可将变性溶液与4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍于变性溶液的体积的复性缓冲液混合;然后加入硫酸铜水溶液,可在16℃、18℃、20℃、22℃、24℃或其中任意两者组成的范围下进行搅拌复性;其中,在加入硫酸铜水溶液中,调节体系的pH至9.2、9.3等。[0042] 进一步地,搅拌复性的时间可以为5~7h。[0043] 如在不同实施方式中,变性缓冲液中,NaHCO3的浓度可以为8mM、9mM、10mM、11mM、12mM或其中任意两者组成的范围;EDTA的浓度可以为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.5mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM或其中任意两者组成的范围,优选为0.8~1.2mM。在一种优选实施方式中,变相缓冲液为含10mMNaHCO3和1mM的EDTA的水溶液。[0044] 如在不同实施方式中,复性缓冲液中,甘氨酸的浓度可以为22mM、24mM、25mM、26mM、28mM或其中任意两者组成的范围;Tris的浓度可以为5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或其中任意两者组成的范围;复性缓冲液的pH可以为8.9、9.0、9.1或其中任意两者组成的范围,具体可采用氢氧化钠水溶液进行pH的调节。[0045] 在本发明的具体实施方式中,变性处理中,采用氢氧化钠水溶液调节pH值11.9~12.1,其中,氢氧化钠水溶液的质量分数可根据实际需求进行调整,如可以为4wt%氢氧化钠水溶液。进一步地,加入β‑巯基乙醇使变性处理的体系中,β‑巯基乙醇的浓度为0.38~0.42mL/L。[0046] 如在不同实施方式中,加入β‑巯基乙醇使变性处理的体系中,β‑巯基乙醇的浓度为0.38mL/L、0.39mL/L、0.4mL/L、0.41mL/L、0.42mL/L或其中任意两者组成的范围。[0047] 在本发明的具体实施方式中,变性处理中,固相包涵体的用量与变性缓冲液的用量的比例为(5~8)g﹕100mL,优选为(7~7.5)g﹕100mL。[0048] 如在不同实施方式中,变性处理中,固相包涵体的用量与变性缓冲液的用量比例可以为5g﹕100mL、6g﹕100mL、7g﹕100mL、8g﹕100mL或其中任意两者组成的范围。调控比例在上述范围内,进一步提高收率。[0049] 在本发明的具体实施方式中,复性缓冲液中,Tris的浓度为15~25mM。[0050] 如在不同实施方式中,复性缓冲液中,Tris的浓度可以为15mM、18mM、20mM、22mM、25mM或其中任意两者组成的范围。[0051] 通过调整复性缓冲液中的Tris的浓度在上述范围内,可进一步提高反应收率。[0052] 在本发明的具体实施方式中,加入硫酸铜溶液,使硫酸铜的终浓度为1.8~2.2μM。如在不同实施方式中,加入硫酸铜溶液,使硫酸铜的终浓度为1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM或其中任意两者组成的范围。如在实际操作中,硫酸铜溶液的质量分数可根据实际需求进行调整,如可以采用五水硫酸铜配制硫酸铜水溶液,其中五水硫酸铜的质量分数可以为2.5wt%。[0053] 在本发明的具体实施方式中,搅拌复性中,搅拌的转速为200~300rpm。[0054] 在本发明的具体实施方式中,步骤(b)中,连接脂肪酸侧链的方法包括:(b1)在胰岛素前体的溶液中加入硼酸或碳酸氢钠后,再加入乙腈,并调节pH至10.2~10.5;[0055] (b2)在20~25℃条件下,将侧链活化酯溶液加入步骤(b1)的溶液中,避光反应15~20min;然后加入乙醇胺终止反应。[0056] 在本发明的具体实施方式中,加入硼酸,使硼酸在加入乙腈后的胰岛素前体的溶液中的浓度为0.08~0.12M;加入碳酸氢钠,使碳酸氢钠在加入乙腈后的胰岛素前体的溶液中的浓度为0.08~0.12M;加入乙腈,使乙腈在加入乙腈后的胰岛素前体的溶液中的体积分数为30%~50%;加入乙醇胺,使乙醇胺的体积与避光反应后的体系的体积比为(0.0018~0.0022)﹕1。[0057] 如在不同实施方式中,加入硼酸,使硼酸在加入乙腈后的胰岛素前体的溶液中的浓度可以为0.08M、0.09M、0.1M、0.11M、0.12M或其中任意两者组成的范围;加入碳酸氢钠,使碳酸氢钠在加入乙腈后的胰岛素前体的溶液中的浓度可以为0.08M、0.09M、0.1M、0.11M、0.12M或其中任意两者组成的范围;加入乙腈,使乙腈在加入乙腈后的胰岛素前体的溶液中的体积分数可以为30%、35%、40%、45%、50%或其中任意两者组成的范围,在实际操作中,体积不足部分用水补足,以调节乙腈的含量满足上述要求;加入乙醇胺,使乙醇胺的体积与避光反应后的体系的体积比可以为0.0018﹕1、0.0019﹕1、0.002﹕1、0.0021﹕1、0.0022﹕1或其中任意两者组成的范围。[0058] 其中,硼酸和碳酸氢钠可以分别以水溶液的形式加入,硼酸水溶液或碳酸氢钠水溶液的浓度可各自独立地选自0.8~1.2M,如可以为0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M等。[0059] 其中,在胰岛素前体上连接脂肪酸侧链是指在胰岛素前体B29赖氨酸上连接脂肪酸侧链。现有的在胰岛素前体上连接脂肪酸侧链的工艺是:将带保护基的侧链活化酯作为原料与胰岛素前体进行连接,得到带保护基的胰岛素;然后再经过三氟乙酸脱保护得到最终形态的胰岛素;这个脱保护的工序是在胰岛素车间内完成。而脱保护中所需要用到的高浓度的三氟乙酸,是一种强腐蚀性、强挥发性和强刺激性的强酸,并且脱保护后必须用乙醚沉淀离心,对车间的生产设备和厂房等均有较高的要求,而现有的胰岛素车间不能满足要求,并且带保护基的胰岛素用三氟乙酸脱保护的过程中,胰岛素暴露在强酸中容易变性,导致收率降低。具体的,现有的在胰岛素前体上连接脂肪酸侧链的工艺流程参考如下:[0060][0061] 本发明将不含有保护基的侧链活化酯作为原料与胰岛素前体直接进行反应,免去了在胰岛素生产车间脱保护的工序;同时反应条件温和,收率高。具体的,本发明在胰岛素前体上连接脂肪酸侧链的工艺流程参考如下:[0062][0063] 其中,不含有保护基的侧链活化酯(即侧链活化酯)的结构式为[0064][0065] 不含有保护基的侧链活化酯可以外购或自制,具体自制方法可参考如下,但不局限于此:[0066] (a)称取化合物A,加入THF搅拌溶解至澄清透明,加入HSTU(N,N,N',N'‑四甲基脲‑O‑(N‑琥珀酸亚胺基)六氟磷),搅拌;加入DIPET,室温搅拌反应4~12h,得到浑浊反应液;室温过滤,收集滤液,于35~40℃旋蒸去除溶剂,加入二氯甲烷溶解,用饱和食盐水洗涤2~3次,室温过滤、无水硫酸钠干燥,30~35℃旋蒸去除溶剂,得到侧链活化酯;[0067] (b)取步骤(a)制得的侧链活化酯粗品1g,加入切割试剂20mL(按照TFA/TIS/水体积比为95%/2.5%/2.5%进行配制)溶解澄清透明,室温搅拌反应2~3h,旋蒸/氮气去除大部分溶剂,至有大量沉淀析出加入适量乙醚进行沉淀,离心;然后乙醚洗涤一次,离心,冻干,得到不含有保护基的侧链活化酯。通过结构表征确认为不含有保护基的侧链活化酯。[0068] 其中,化合物A的结构式如下:[0069][0070] 在本发明的具体实施方式中,连接脂肪酸侧链中,胰岛素前体与侧链活化酯的摩尔比为1﹕(1.2~3.0),优选为1﹕(1.5~2.4)。[0071] 如在不同实施方式中,连接脂肪酸侧链中,胰岛素前体与侧链活化酯的摩尔比可以为1﹕1.2、1﹕1.4、1﹕1.5、1﹕1.6、1﹕1.8、1﹕2、1﹕2.2、1﹕2.4、1﹕2.5、1﹕2.6、1﹕2.8、1﹕3或其中任意两者组成的范围,兼顾保证低成本和高收率。[0072] 在本发明的具体实施方式中,侧链活化酯溶液为侧链活化酯的DMF溶液。进一步地,侧链活化酯溶液的浓度为10~30g/L。[0073] 如在不同实施方式中,侧链活化酯溶液中,侧链活化酯的浓度可以为10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L或其中任意两者组成的范围。[0074] 在本发明的具体实施方式中,步骤(b1)中,加入乙腈后的溶液中,胰岛素前体的浓度为1~5mg/mL,优选为4~5mg/mL。[0075] 研究发现,当调控胰岛素前体的溶液中的胰岛素前体的浓度在上述范围内,可极大程度的提高产品收率。[0076] 在本发明的具体实施方式中,步骤(b)还包括:向连接脂肪酸侧链后的体系中加入2~2.5倍体积的水,调节pH至5.7~5.9;然后进行反相层析纯化。进一步地,将反相层析纯化后的物料进行超滤、结晶、冻干,得到依柯胰岛素。[0077] 在本发明的具体实施方式中,将复性后的样品进行浓缩后再进行酶切。其中,浓缩包括超滤洗脱浓缩澄清,得到浓度为8~12g/L的溶液。[0078] 在本发明的具体实施方式中,酶切包括:采用酶切缓冲液调节溶液中样品的浓度至5~7mg/mL,调节pH至8.4~8.6,于16~24℃条件下加入重组胰蛋白酶溶液,再加入氯化钙溶液至体系中钙离子浓度为1mM,进行酶切反应;反应结束后,调节pH至3.0,终止酶切。酶切缓冲液为pH为8.5、含25mMTris的水溶液。[0079] 其中,酶切方式不局限于此,其余可用于制备依柯胰岛素的酶切方式均可。[0080] 在本发明的具体实施方式中,还包括对所述酶切后的样品进行阳离子层析纯化。[0081] 在本发明的具体实施方式中,阳离子层析纯化包括:[0082] (1)采用流动相A平衡阳离子层析柱1.5~3CV后上样;酶切后的样品的上样载量≤10g/L;[0083] (2)采用0.5~1.5CV的流动相A洗涤阳离子层析柱;[0084] (3)采用流动相A和流动性B对阳离子层析柱进行梯度洗脱;梯度洗脱包括:先用30%B洗脱2~5CV,再用30%~45%B梯度洗脱5CV,当洗脱主峰在UV280上升到200~300mAu开始收集样品,UV280下降到200mAu~50mAu结束收集样品;[0085] 流动相A为:pH为3.0、25mM的乙酸钠水溶液;流动相B为:pH为3.0、含25mM乙酸钠、含1M氯化钠的水溶液。[0086] 其中,阳离子层析的方式不局限于此,其余可实现对胰岛素前体进行纯化目的的阳离子层析的方式均可。[0087] 在本发明的具体实施方式中,还包括,对阳离子层析纯化收集的洗脱液进行超滤;超滤包括:将洗脱液浓缩至20~25g/L,然后采用30vol.%乙腈水溶液超滤置换8~10倍。[0088] 在本发明的具体实施方式中,反相层析纯化包括:[0089] (1)采用流动相A平衡C8层析柱3~4CV后上样;样品的上样载量≤10g/L;[0090] (2)采用1~1.5CV的流动相A洗涤C8层析柱;[0091] (3)采用流动相A和流动性B对C8层析柱进行梯度洗脱;梯度洗脱包括:先用0%~30%B线性梯度洗脱1CV,再用35%~40%B线性梯度洗脱8~12CV,当洗脱主峰在UV280上升到100mAu开始收集样品,UV280下降到200mAu结束收集样品;[0092] 流动相A为:体积比为90﹕10的0.4M乙酸铵水溶液和乙腈;流动相B为:体积比为50﹕50的0.4M乙酸铵水溶液和乙腈。[0093] 其中,反相层析的方式不局限于此,其余可实现对依柯胰岛素进行纯化目的的反相层析的方式均可。[0094] 在本发明的具体实施方式中,固相包涵体的制备包括:培养工程菌菌体,并表达胰岛素原。具体的固相包涵体的制备可参考现有的依柯胰岛素的固相包涵体的制备方法。本发明的固相包涵体的制备可包括:(1)挑取冻存的工程菌株,加入种子培养基中,在37℃、220rpm条件下培养至OD600值3~10;然后将种子液接入发酵培养基进行发酵,当OD600为45~55时,无菌滤入IPTG溶液,使得IPTG的终浓度为0.2mM,开始诱导,诱导时间为12~15h,OD600值达到100以上放罐;放罐后离心收集菌体;(2)将菌体洗涤后降温至2~10℃,破碎处理,然后离心收集固相包涵体。其中,发酵的条件包括:温度为37℃,搅拌转速为100~200rpm,通气量为1vvm(以基础培养基起始体积计),pH为6.6~6.8。[0095] 实施例1[0096] 本实施例提供了依柯胰岛素的制备方法,包括如下步骤:[0097] (1)包涵体的制备:将冻存的大肠杆菌工程菌株按0.1%的比例无菌接入种子培养基(LB培养基,每升含10克蛋白胨、5克酵母抽提物和10克氯化钠)中,然后转入恒温振荡培养箱内,在37℃、220rpm条件下培养至OD600值3~10;确认发酵培养基温度为37℃、搅拌转速150rpm、通气量1vvm(以基础培养基起始体积计)、pH值为6.7准备就绪后,将摇瓶种子液按0.5%比例无菌接入100L发酵罐开始发酵;当菌体生长到OD600在45~55时(培养8~10h),无菌滤入IPTG溶液,使得IPTG的终浓度为0.2mM,开始诱导,诱导时间15h,OD600达到100放罐(体积71升)。放罐后菌液用离心的方式收集菌体。其中,100L发酵罐表达量为7.12g/L。[0098] 其中,发酵培养基含如下成分:YeastExtract20g/L、C3H6O320g/L、C6H8O7·H2O7.5g/L、NaCl0.5g/L、KH2PO42g/L、K2HPO4·3H2O10g/L、(NH4)2SO47g/L、MgSO4·7H2O2.5g/L、CaCl2·2H2O0.3g/L、H3PO41.5ml/L、消泡剂0.2ml/L。[0099] 菌体用均质缓冲液(用Tris和EDTA‑2Na配制,Tris浓度为2.42g/L,EDTA‑2Na浓度为1.86g/L,pH为7.0)洗涤两遍,再降温至2~10℃,用高压均质机在≥800bar条件下破碎2遍(每次均质前料液需降温到2~10℃);均质后的均质液用离心机离心收集固相包涵体,包涵体的收率为79.61%。[0100] (2)变性和复性:取步骤(1)中得到的固相包涵体,加入变性缓冲液中,用适量的氢氧化钠水溶液调节pH至12,搅拌使包涵体溶解;加入β‑巯基乙醇,使目前体系中β‑巯基乙醇的浓度为0.4mL/L,然后于室温下搅拌反应30min,得到变性溶液;然后将变性溶液与变性溶液9倍体积的复性缓冲液混合,然后加入终浓度为2μM的硫酸铜溶液,控制温度为24℃,调节体系pH至9.3,于200~300rpm转速搅拌,复性7h,变性和复性的收率为71.34%。将复性好的样品采用100K/10K超滤洗脱澄清浓缩至约10g/L的浓度,超滤收率为80.58%。[0101] 其中,变性缓冲液为含10mMNaHCO3和1mM的EDTA的水溶液;复性缓冲液为pH为9、含25mM甘氨酸和25mMTris的水溶液;固相包涵体与变性缓冲液的用量比例为7g﹕100mL。[0102] (3)酶切:用酶切缓冲液(25MmTris,pH8.5)调节步骤(2)获得的样品的浓度至6mg/mL;然后控制温度在24℃,调节pH至8.5;将新鲜配制的重组胰蛋白酶溶液加入其中,再加入1M氯化钙溶液至钙离子终浓度为1mM,边加入边搅拌,加入完毕后持续低速搅拌。酶切反应时间15h以上,中间取样检测HPLC,分析酶切过程,当目标蛋白增长缓慢或基本不增加时终止酶切,用6M盐酸溶液调节酶切体系pH至3.0,终止酶切,所得样品为酶切后样品,酶切收率为70.34%。[0103] (4)阳离子层析:用C1A相(pH3.0、25mM的乙酸钠水溶液)平衡层析柱(用GE公司的SP‑FF阳离子填料)2.0CV,使柱后电导、UV、pH等趋于平稳,准备上样;将步骤(3)得到的酶切后样品按不超过10g/L载量分次上样;用C1A相1.0CV洗涤层析柱使UV值基线平稳;设置层析系统梯度洗脱程序参数:先用30%的C1B相(pH3.0、含25mM乙酸钠和1M氯化钠的水溶液)洗脱3CV,再用30%~45%的C1B相线性梯度洗脱5CV,洗脱主峰在UV280上升到200~300mAu开始收集样品,UV280下降到200~50mAu结束收集样品。将收集的洗脱液浓缩到25g/L,用置换缓冲液(30vol.%乙腈水溶液)超滤置换9.0倍,得到纯化胰岛素前体溶液。其中,阳离子层析和超滤的收率为70.81%。[0104] (5)连接侧链:根据步骤(4)得到的纯化胰岛素前体溶液的浓度和体积、以及稀释后胰岛素前体溶液的终浓度(5mg/L)确定稀释后胰岛素前体溶液的体积,按此体积计算加入的1M的硼酸水溶液的体积使稀释后胰岛素前体溶液中硼酸终浓度为0.1M,计算加入乙腈的体积使稀释后胰岛素前体溶液中乙腈的终浓度为40vol.%;根据计算量,向纯化胰岛素前体溶液中加入1M硼酸水溶液和乙腈,然后调节pH值至10.3;在25℃条件下,将侧链活化酯溶液加入前述胰岛素前体溶液中,边加入边搅拌,控制在15min内加完,然后避光搅拌反应15min。然后加入乙醇胺终止反应。反应结束后,在样品中加入2倍纯化水稀释,调节pH至5.8,置于4℃保存。连接侧链的步骤中,收率为84.47%。[0105] 其中,侧链活化酯溶液为侧链活化酯的DMF溶液,侧链活化酯的浓度为20g/L,侧链活化酯的物质的量为胰岛素前体的物质的量的2.3倍(相当于2.3eq);乙醇胺的体积与避光搅拌反应后的体系的体积之比为0.002﹕1。[0106] (6)反相层析:用3CV的C2A相(体积比为90﹕10的0.4M乙酸铵水溶液和乙腈)平衡层析柱(用赛分公司C8(2)填料),使柱后UV、电导、pH趋于平稳;将步骤(5)得到的样品进行上样,载量为10g/L;然后用1.5CV的C2A相冲洗;设置层析系统梯度洗脱程序参数,先0%~35%的C2B相(体积比为50﹕50的0.4M乙酸铵水溶液和乙腈)线性梯度洗脱1CV,再用35%~40%的C2B相线性梯度洗脱10CV。当洗脱主峰UV280上升到100mAU开始收集样品,UV280下降到200mAU结束收集样品,收集过程分段收集,液相检测蛋白纯度、浓度,确认合并样品。然后将样品用3K的膜超滤,用水置换,得到终浓度约为20g/L的超滤样品。其中,反相层析和超滤的收率为78.23%。[0107] (7)调节步骤(6)得到的超滤样品的pH至8,加入苯酚和乙酸锌(按照超滤样品的体积加入苯酚,加入10%超滤样品体积的0.2M的苯酚水溶液;按依柯胰岛素的质量加入乙酸锌,1g依柯胰岛素对应添加2.73mL的0.01M乙酸锌水溶液),搅拌均匀后再把pH调到5,搅拌5min后放4℃静置结晶;结晶完成后用中空纤维收集晶体;将晶体置入冻干机中冻干,得到粉末,采用铝塑袋分装、密封,于‑20℃保存。其中,结晶和冻干的收率为90.74%。[0108] 从放罐时表达量乘以放罐体积得到表达的总蛋白量开始计算制备依柯胰岛素的总收率为13.66%。[0109] 实施例2~17[0110] 实施例2~17参考实施例1的制备方法,区别仅在于:步骤(2)变性和复性的部分参数不同,具体相关参数(其余未提及的参数则与实施例1相同)、变性和复性收率见表1。[0111] 表1不同变性和复性条件及收率[0112][0113][0114] 实施例18~34[0115] 实施例18~34参考实施例1的制备方法,区别仅在于:步骤(5)连接侧链的部分参数不同,具体相关参数(其余未提及的参数则与实施例1相同)、连接侧链步骤的收率见表2。[0116] 表2不同连接侧链条件及收率[0117][0118][0119] 实施例35~41[0120] 实施例35~41参考实施例1的制备方法,区别仅在于:步骤(5)连接侧链中,均采用1M的碳酸氢钠水溶液替换实施例1中的1M的硼酸水溶液,具体相关参数(其余未提及的参数则与实施例1相同)、连接侧链步骤的收率见表3。[0121] 表3不同连接侧链条件及收率[0122][0123][0124] 对比例1[0125] 对比例1参考实施例1的制备方法,区别在于:步骤(2)和步骤(5)不同,步骤(6)的上样步骤不同。[0126] 对比例1的步骤(2)包括:取步骤(1)得到的固相包涵体,加入8M尿素缓冲液中,搅拌溶解,然后用预冷的复性液稀释10倍,保持温度在3~5℃复性18h;其中,尿素缓冲液为含2.2g/L甘氨酸和0.48kg/L尿素的水溶液,并采用氢氧化钠水溶液调节pH至10.5~10.9;固相包涵体与尿素缓冲液的用量为7g﹕100mL;复性液为含1.9g/L甘氨酸的水溶液,并采用氢氧化钠水溶液调节pH至10.5~10.7。对比例1的步骤(2)的变性和复性的收率为68.13%。[0127] 对比例1的步骤(5)包括:[0128] ①称取化合物A,加入THF搅拌溶解至澄清透明,加入HSTU(N,N,N',N'‑四甲基脲‑O‑(N‑琥珀酸亚胺基)六氟磷),搅拌;加入DIPET,室温搅拌反应4~12h,得到浑浊反应液;室温过滤,收集滤液,于35~40℃旋蒸去除溶剂,加入二氯甲烷溶解,用饱和食盐水洗涤2~3次,室温过滤、无水硫酸钠干燥,30~35℃旋蒸去除溶剂,得到带保护基的侧链活化酯。[0129] ②称取2.3eq的带保护基的侧链活化酯,用DMF溶解(浓度约20mg/mL),备用;配制1M硼酸水溶液,用1M氢氧化钠水溶液调节pH至约10.2。[0130] ③根据步骤(4)得到的纯化胰岛素前体溶液的浓度和体积、以及稀释后胰岛素前体溶液的终浓度(5mg/L)确定稀释后胰岛素前体溶液的体积,按此体积计算加入的1M的硼酸水溶液的体积使稀释后胰岛素前体溶液中硼酸终浓度为0.1M,计算加入乙腈的体积使稀释后胰岛素前体溶液中乙腈的终浓度为40vol.%;根据计算量,向纯化胰岛素前体溶液中加入1M硼酸水溶液和乙腈,然后调节pH值至10.3;在25℃条件下,将带保护基的侧链活化酯溶液加入前述胰岛素前体溶液中,边加入边搅拌,控制在15min内加完,然后避光搅拌反应15min。然后加入乙醇胺终止反应。35~40℃旋蒸去除乙腈,样品冻干,得带保护基的依柯胰岛素粗品。[0131] ④按照TFA/TIS/水体积比为95%/2.5%/2.5%,配制脱保护溶液;取上一步的粗品按1g加20mL的比例加入脱保护溶液,溶解澄清透明,淡黄色或无色,室温搅拌反应3h。旋蒸/氮气去除大部分溶剂,至有大量沉淀析出时加入适量乙醚,进行沉淀,离心,再用乙醚洗涤一次,离心,冻干,得依柯胰岛素粗品。[0132] 对比例1的步骤(5)的连接侧链步骤中,胰岛素前体与带保护基的侧链活化酯的反应步骤收率为78.32%,脱保护步骤的收率为49.65%。[0133] 对比例1的步骤(6)中,采用C2A相将步骤(5)得到的固体依柯胰岛素粗品进行溶解,使粗品浓度约为4g/L进行上样;其余条件同实施例1。[0134] 由上可知,本发明通过对依柯胰岛素的制备过程中的变性和复性的条件进行改变,降低了变复性的成本、环保压力和能耗,同时缩短复性时间、保证甚至提高了收率。本发明进一步对连接脂肪酸侧链的路线进行改变,一方面免去了在胰岛素生产车间的脱保护工序,使得现有的胰岛素车间能够满足本发明的工艺路线的要求;另一方面通过对胰岛素前体与脱去保护基的侧链活化酯的反应条件进行优化,保证甚至提高了胰岛素的收率。[0135] 最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
专利地区:浙江
专利申请日期:2023-12-15
专利公开日期:2024-09-03
专利公告号:CN117756914B