专利名称:一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子及其应用
专利类型:发明专利
专利申请号:CN202311636345.1
专利申请(专利权)人:中国农业大学
权利人地址:北京市海淀区圆明园西路2号
专利发明(设计)人:陈晶瑜,李文倩
专利摘要:本发明公开了一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子及其应用,尤其是设计了一种具有高转录活性的组成型启动子。具体地,以单核细胞增生李斯特氏菌为研究对象,经过筛选和改造得到一系列不同长度的组成型启动子,随后以绿色荧光蛋白为报告基因,通过不同长度启动子驱动其表达,比较荧光强度差异,最终获得了具有较高活性的强组成型启动子。该启动子在大肠杆菌中表达GFP的活性是以IPTG诱导表达的2‑4倍。该启动子也被证实能够在单核细胞增生李斯特氏菌中高效表达蛋白。本发明的启动子具有良好的应用前景,丰富了合成生物学元件,同时也为不同菌种尤其是李斯特菌在基因工程改造及外源基因表达上奠定了基础。
主权利要求:
1.一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子,其特征在于,所述强组成型启动子为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。
2.包含权利要求1所述强组成型启动子的表达载体。
3.一种重组核酸构建体,其特征在于,包含权利要求1所述强组成型启动子,以及连接在启动子下游的一核酸分子。
4.一种基因表达单元,其特征在于,包含权利要求3所述重组核酸构建体和终止子。
5.包含权利要求1所述强组成型启动子的重组细胞。
6.根据权利要求5所述的重组细胞,其特征在于,宿主细胞来源于微生物。
7.根据权利要求6所述的重组细胞,其特征在于,宿主细胞为大肠杆菌或单核细胞增生李斯特氏菌。
8.包含权利要求1所述强组成型启动子的表达系统。
9.权利要求1所述强组成型启动子在对微生物细胞进行遗传改造中的应用。
10.一种提高基因组成型表达的方法,其特征在于,采用权利要求1所述强组成型启动子对基因进行组成型表达。 说明书 : 一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子及其应用技术领域[0001] 本发明涉及生物工程技术领域,具体涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子及其应用。背景技术[0002] 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一种革兰氏阳性的食源性致病菌。其大小约为1.0‑2.0μm×0.5μm,兼性厌氧且不能够产生芽孢。李斯特氏菌的生长温度范围较为广泛,在‑0.4至50℃间均可生长,另外,由于该菌能够产生生物被膜,因此可以耐受一些高盐或是低水分活度的环境。Lm广泛存在于自然界中,植物、土壤、地表水样品、或是畜禽体内及野生动物体内都可能存在Lm,并且其很容易通过生产和加工过程污染食品。当进食这些被Lm污染的食品后,Lm可穿透人体的三大屏障:肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障,导致肠胃炎、脑膜炎、败血症、流产等症状,被认为是最严重的食源性疾病。国内外对于Lm的研究大多集中在环境耐受性、流行性、食品中的生长动力学等方面,针对分子生物学方面的研究,尤其是启动子的开发相对较少。启动子是含有RNA聚合酶特异性识别、结合和转录起始所需的保守序列的基因表达元件,多数启动子是位于结构基因转录起始点的上游,是基因表达和转录的“开关”。启动子按照是否需要诱导可分为分组成型启动子和诱导型启动子两大类,araA,T7启动子等是常用的诱导型强启动子,需要在昂贵的诱导剂的使用才能启动基因表达,相较于诱导性启动子,组成型启动子能够稳定持续表达成为多数蛋白表达的优先选择。目前合成生物学的兴起对于启动子元件的需求不断扩大,找到一个组成型的强启动子具有重要的应用价值。发明内容[0003] 为解决上述技术问题,本发明在单核细胞增生李斯特氏菌中,以报告基因对其启动子进行筛选和应用评价,获得了一组组成型的强启动子。[0004] 本发明的第一个目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌强组成型启动子,所述强组成型启动子为SEQIDNO.1‑4所示的核苷酸序列之一。[0005] 本发明的第二个目的是提供包含上述强组成型启动子的表达载体。[0006] 进一步地,所述表达载体为核酸载体、质粒或病毒载体。[0007] 进一步地,所述表达载体为适用于单核细胞增生李斯特氏菌或大肠杆菌组成型表达的载体。[0008] 进一步地,所述表达载体的出发载体可为任何适用于宿主细胞的载体,包括但不限于pET系列载体、pIMK2载体等。[0009] 本发明的第三个目的是提供一种重组核酸构建体,包含上述强组成型启动子以及连接在启动子下游的一核酸分子。[0010] 进一步地,核酸分子可为基因,基因可编码一蛋白。[0011] 本发明的第四个目的是提供一种基因表达单元,包含上述重组核酸构建体和终止子。[0012] 本发明的第五个目的是提供包含上述强组成型启动子的重组细胞。[0013] 进一步地,所述重组细胞的宿主细胞可来源于动物、植物或微生物。[0014] 进一步地,所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌或单核细胞增生李斯特氏菌。[0015] 本发明的第六个目的是提供包含上述强组成型启动子的表达系统。[0016] 本发明的第七个目的是提供上述强组成型启动子在对细胞进行遗传改造中的应用。如应用于基因工程改造或合成生物学领域,当然不限于其他方面如生物传感等领域的应用。[0017] 进一步地,所述的应用是采用上述启动子启动组成型基因的表达。[0018] 本发明的第八个目的是提供一种提高基因组成型表达的方法,采用上述启动子对基因进行组成型表达。[0019] 进一步地,所述基因为大肠杆菌或李斯特菌中含有的基因。[0020] 本发明的有益效果:[0021] 本发明以单核细胞增生李斯特氏菌为研究对象,经过筛选和改造得到一系列不同长度的组成型启动子,随后以绿色荧光蛋白为报告基因,通过不同启动子驱动其表达,比较荧光强度差异,最终获得了具有较高活性的强组成型启动子。该启动子在大肠杆菌中表达GFP的活性是以IPTG诱导表达的2‑4倍。该启动子也被证实能够在单核细胞增生李斯特氏菌中高效表达蛋白。因此本发明的启动子具有良好的应用前景,丰富了合成生物学元件,同时也为不同菌种尤其是李斯特菌在基因工程改造及外源基因表达上奠定了基础。附图说明[0022] 图1是不同启动子对GFP蛋白表达的影响。[0023] 图2是过表达菌株Western‑blot验证结果(从左到右分别为:野生菌株、空载体菌株、过表达菌株)。具体实施方式[0024] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。[0025] 下述实施例中涉及的材料如下:[0026] LB液体培养基:称量10g胰蛋白胨,10gNaCl,5g酵母提取物,以975ml去离子水溶解混匀,调节pH为7.0,121℃,20min高温高压灭菌。[0027] LB固体培养基:称量10g胰蛋白胨,5gNaCl,5g酵母提取物,以975ml去离子水溶解混匀,每100ml培养基添加1.8‑2.0g琼脂粉,121℃,20min高温高压灭菌。[0028] BHI培养基:称量37.5gBHI培养基粉末,以963ml去离子水溶解混匀,调节pH为7.0,121℃,20min高温高压灭菌。[0029] 实施例1[0030] 1)质粒片段及启动子序列扩增:将质粒pET‑28a利用引物28a‑F和28a‑R2通过表1中的PCR体系进行线性化。选择基因组提取试剂盒提取Lm10403S的基因组,同时,不同长度的启动子片段(60bp,110bp,160bp,210bp,310bp,410bp,510bp)用表3中所涉及的上引以及下引Half‑R;以提取的基因组为模板进行PCR。GFP荧光标签为pBb1k‑GFPuv质粒中的GFPuv标签,利用引物Half‑gfp‑F,Half‑gfp‑R进行PCR获得。PCR程序:94℃预变性1min;94℃变性10s,55℃复性5s,72℃延伸10s,循环32次;72℃延伸1min。[0031] 2)扩增后片段使用PCR产物纯化回收试剂盒进行纯化回收,电泳检测是否有目的条带及条带大小,进行下一步实验或保存于‑20℃。[0032] 3)纯化后的质粒和目的片段以片段长度(20ng/kb)配置酶连体系(如表2所示),通过Hieff UniversalOneStepCloningKit进行,将体系至于50℃连接45min。[0033] 4)从‑80℃冰箱里取出100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞于冰上化冻;在超净工作台中向感受态里加入10μL连接产物,轻轻混匀,冰浴30min;将离心管平稳地放入42℃水浴热激45s,再立即冰浴3min;而后在超净工作台中向其中加入1mLLB液体培养基,37℃,180rpm复苏培养60min;5000rpm离心1min,留下约200μL液体将菌体重悬,涂布于含卡纳霉素的抗性平板,37℃培养16h以上。最后通过PCR、酶切筛选鉴定阳性转化子克隆,并利用Sanger测序对阳性转化子进行进一步确定,得到重组质粒pET‑28a‑X‑GFPuv系列质粒(表4)。[0034] 表1:PCR反应体系[0035][0036] 表2:酶连反应体系[0037][0038] 表3菌株构建所涉及的引物[0039][0040] 表4质粒中包含的相应的启动子[0041][0042][0043] 实施例2[0044] 将所获得的验证正确的单菌落接种于LB液体培养基中,37℃180rpm培养过夜。取400μL测定菌液在600nm的吸光度值OD600nm,取1mL菌液离心后用水清洗两次,调整OD600nm为统一值,各取200μL加入96孔板黑色酶标板,用多功能荧光酶标仪测定其荧光强度。设定激发波长为395nm、发射波长为508nm检测荧光强度。同时,构建重组质粒pET28a‑GFPuv、pBb1k‑GFPuv、pM1s3AsR‑GFPuv并将其导入大肠杆菌宿主中,测定其荧光强度,具体操作同上。[0045] 根据图1所示结果,P210,P310,P410的荧光表达强度分别为11028±22,12975±111,21144±141,以0.8mMIPTG诱导pBb1k‑GFPuv表达的荧光强度约为7547±52,P510与其相当。[0046] 实施例3[0047] 在细菌中,HU是一种重要的DNA结合蛋白,参与维持拟核结构并参与各种原核生物功能,例如转录、DNA修复、毒力和代谢调节。作为细胞调节网络的“枢纽点”,HU会影响细菌的存活,在结核分枝杆菌中已发现HU的DNA结合抑制剂。本实施例想要探究通过P210,P310,P410过表达单核细胞增生李斯特氏菌的HU蛋白(Lmhu,氨基酸序列如SEQIDNO.5所示),对细胞的生命活动是否有影响。[0048] 构建pIMK2‑Lmhu过表达载体:[0049] 1)基因片段扩增:以Lm10403S基因组为模板,通过引物Halflmhu‑F(ATATGTCGACTCAGTGGTGGTGGT)和Halflmhu‑R(ATATCCCGGGAACGGTGTCAGTTT)PCR获得Lmhu片段(LMRG_RS09775),其中包含启动子P210,P310或是P410。将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,并对目的片段利用切胶回收试剂盒进行回收获得纯化后的片段Lmhu。[0050] 2)质粒与片段酶切:将回收获得的Lmhu以及pIMK2质粒进行酶切,酶切后利用产物纯化试剂盒进行纯化。[0051] 3)连接并转化:利用T4连接酶分别将适量的Lmhu以及pIMK2进行连接。本申请采用25℃连接30min。连接完成后,将目标载体pIMK2‑Lmhu转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化并复苏后的大肠杆菌涂布于LB固体培养基上,在37℃培养箱中过夜培养。[0052] 4)菌落PCR验证:将平板上获得单菌落进行菌落PCR验证,筛选阳性克隆子。并将剩余的PCR产物进行测序。挑取正确的阳性菌株于LB液体培养基中37℃,180rpm过夜培养后,60%甘油保菌存于‑80℃并提取质粒。结果发现该步骤无法获得以P310及P410启动子表达Lmhu的质粒,猜测P310和P410启动子诱导Lmhu的活性太强,使大肠杆菌无法存活。[0053] 5)构建Lmhu过表达菌株:[0054] 分别将构建好的质粒pIMK2‑lmhu以及空载体pIMK2加到Lm10403S感受态细胞中,轻轻混匀,加入到预先处理过的电转杯中将电转仪调至400Ω,25μF,1kV,擦干电转杯并进行电击,电击完毕后马上加入1mLBHI(含0.5M蔗糖),37℃温育3h。温育结束后4000rpm离心10min,弃上清,将剩余液体悬浮细菌并涂布到BHI固体平板上,37℃培养2天。[0055] 6)菌落PCR验证:将平板上获得单菌落的使用验证引物yzhalflmhu‑F和yzhalflmhu‑R进行菌落PCR验证,筛选阳性克隆子。将菌株于‑80℃保存。[0056] 7)Western‑blot检测LmHU的表达量:[0057] LmHU抗体是以pET‑28a为载体纯化获得的重组蛋白,由兔子免疫后的血清获得。标8准的western‑blot分析,是将2×10个细胞以5000g离心10分钟收集,并在20mLPBS缓冲液中重悬。10μL样品加入2×上样缓冲液后,在100℃下处理10min并采用SDS‑PAGE。PAGE凝胶中的蛋白质在4℃、150mA条件下转移到PVDF膜上。在室温环境中,用5%(w/v)脱脂牛奶对PVDF膜封闭2h。随后洗涤膜,并用LmHU一抗和二抗兔HRP偶联抗体孵育。最后利用AmershamImageQuant800生物分子成像仪(Cytiva)对膜进行成像。结果如图2所示,结果显示WT‑p‑Lmhu菌株LmHU蛋白的表达量约是野生菌株的4倍左右,即利用P210启动子能够实现蛋白的高效表达。[0058] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
专利地区:北京
专利申请日期:2023-12-01
专利公开日期:2024-09-03
专利公告号:CN117701565B