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适用于NK细胞培养的血液保存液及其制备方法和应用

更新时间:2024-10-28
适用于NK细胞培养的血液保存液及其制备方法和应用 专利申请类型:发明专利;
地区:广东-深圳;
源自:深圳高价值专利检索信息库;

专利名称:适用于NK细胞培养的血液保存液及其制备方法和应用

专利类型:发明专利

专利申请号:CN202311573137.1

专利申请(专利权)人:深圳泽医细胞治疗集团有限公司
权利人地址:广东省深圳市大鹏新区葵涌街道坝光社区生物家园5号楼一单元201

专利发明(设计)人:白宗科,陈复兴,张月圆

专利摘要:本发明提供一种适用于NK细胞培养的血液保存液及其制备方法和应用,涉及细胞保存技术领域,包括:肝素钠5~50mg/100mL、葡萄糖1~10g/100mL、L‑谷氨酰胺1~10mM、维生素C0.1~10mg/100mL、维生素E 0.1~10mg/100mL、胆固醇0.01~1mg/100mL、甘露醇5~50mg/100mL、甘氨酸0.1~10mg/100mL、甲硫氨酸0.1~10mg/100mL、醋酸赖氨酸0.1~10mg/100mL、缬氨酸0.1~10mg/100mL、异亮氨酸0.1~10mg/100mL、苯丙氨酸0.1~10mg/100mL、亮氨酸0.1~10mg/100mL、色氨酸0.1~10mg/100mL、苏氨酸0.1~10mg/100mL、转铁蛋白0.1~10mg/100mL、胰岛素0.01~1mg/100mL、枸橼酸0.1~1g/100mL、磷酸二氢钠0.1~1g/100mL、腺嘌呤0.01~0.1g/100mL以及基础溶剂。本发明提供的适用于NK细胞培养的血液保存液,保存液能够较长时间维持NK细胞的活性特征,为体外培养可供临床使用的NK细胞提供了保障。

主权利要求:
1.一种适用于NK细胞培养的血液保存液,其特征在于,包括:
肝素钠5~50mg/100mL、葡萄糖1~10g/100mL、L‑谷氨酰胺1~10mM、维生素C0.1~
10mg/100mL、维生素E0.1~10mg/100mL、胆固醇0.01~1mg/100mL、甘露醇5~50mg/100mL、甘氨酸0.1~10mg/100mL、甲硫氨酸0.1~10mg/100mL、醋酸赖氨酸0.1~10mg/100mL、缬氨酸0.1~10mg/100mL、异亮氨酸0.1~10mg/100mL、苯丙氨酸0.1~10mg/100mL、亮氨酸0.1~
10mg/100mL、色氨酸0.1~10mg/100mL、苏氨酸0.1~10mg/100mL、转铁蛋白0.1~10mg/
100mL、胰岛素0.01~1mg/100mL、枸橼酸0.1~1g/100mL、磷酸二氢钠0.1~1g/100mL、腺嘌呤0.01~0.1g/100mL以及基础溶剂,所述适用于NK细胞培养的血液保存液的pH值为7.35~7.45。
2.根据权利要求1所述的适用于NK细胞培养的血液保存液,其特征在于,所述肝素钠为
25mg/100mL、所述葡萄糖为5g/100mL、所述L‑谷氨酰胺为5mM、所述维生素C为2.5mg/100mL、所述维生素E为2.5mg/100mL、所述胆固醇为0.3mg/100mL、所述甘露醇为15mg/100mL、所述甘氨酸为2mg/100mL、所述甲硫氨酸为2mg/100mL、所述醋酸赖氨酸为2mg/100mL、所述缬氨酸为2mg/100mL、所述异亮氨酸为2mg/100mL、所述苯丙氨酸为2mg/100mL、所述亮氨酸为
2mg/100mL、所述色氨酸为1mg/100mL、所述苏氨酸为2mg/100mL、所述转铁蛋白为2mg/
100mL、所述胰岛素为2mg/100mL、所述枸橼酸为0.3g/100mL、所述磷酸二氢钠为0.3g/
100mL,所述腺嘌呤为0.05g/100mL。
3.根据权利要求1~2中任意一项所述的适用于NK细胞培养的血液保存液,其特征在于,所述基础溶剂包括生理盐水。
4.根据权利要求1所述的适用于NK细胞培养的血液保存液,其特征在于,所述适用于NK细胞培养的血液保存液的pH值为7.35~7.45。
5.一种如权利要求1~4中任意一项所述适用于NK细胞培养的血液保存液的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括将所述组分按照预设浓度溶解于基础溶剂中配制。
6.一种适用于NK细胞培养的血液保存液的使用方法,其特征在于,所述方法包括:将待处理血液与如权利要求1~4中任意一项所述适用于NK细胞培养的血液保存液混合,得到待处理液;
将所述待处理液放置于预设温度保存。
7.根据权利要求6所述的适用于NK细胞培养的血液保存液的使用方法,其特征在于,所述待处理血液与所述血液保存液的体积比为100:14。
8.根据权利要求6所述的适用于NK细胞培养的血液保存液的使用方法,其特征在于,所述预设温度为2~10℃。
9.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如权利要求1~4中任意一项所述适用于NK细胞培养的血液保存液,所述试剂盒用于血液保存、PBMC细胞提取、NK细胞扩增、NK细胞培养和外泌体制备中的任意一项或多项。 说明书 : 适用于NK细胞培养的血液保存液及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及细胞保存技术领域,尤其涉及一种适用于NK细胞培养的血液保存液及其制备方法和应用。背景技术[0002] 自然杀伤细胞(NaturalKillerCell,NK细胞)是人体固有免疫系统的重要组成部分。在防御肿瘤和病毒感染中起着关键作用,也是人体对抗有害微生物感染和细胞恶变的第一反应者。NK细胞已经广泛应用于各种肿瘤的防治,NK细胞还参与体内衰老细胞的清除,临床应用证明能有效降低衰老相关标志物指标。为了获得可供使用的NK细胞,需要从血液中分离出(PeripheralBloodMononuclearCells,PBMC),然后通过特定的方法诱导和扩增PBMC中的NK细胞。[0003] 血液保存液是保持血液中细胞活性的关键因素,目前广泛使用的是ACD保存液,它主要由酸性枸橼酸盐和葡萄糖等成分组成。然而,使用ACD保存液的血液在24~28小时后进行PBMC分离和NK细胞培养,会发现NK细胞的数量和质量显著下降,这不仅影响了研究和治疗效果,也造成了血液资源的浪费,影响了血液的综合利用。因此,寻找一种能够有效保护NK细胞活性特征的血液保存液,是NK细胞研究和应用的迫切需求。发明内容[0004] 本发明提供一种适用于NK细胞培养的血液保存液及其制备方法和应用,用于满足现在对能够较长时间保持PBMC中NK细胞活性的血液保存液的需求。[0005] 本发明提供一种适用于NK细胞培养的血液保存液,包括:[0006] 肝素钠5~50mg/100mL、葡萄糖1~10g/100mL、L‑谷氨酰胺1~10mM、维生素C0.1~10mg/100mL、维生素E0.1~10mg/100mL、胆固醇0.01~1mg/100mL、甘露醇5~50mg/100mL、甘氨酸0.1~10mg/100mL、甲硫氨酸0.1~10mg/100mL、醋酸赖氨酸0.1~10mg/100mL、缬氨酸0.1~10mg/100mL、异亮氨酸0.1~10mg/100mL、苯丙氨酸0.1~10mg/100mL、亮氨酸0.1~10mg/100mL、色氨酸0.1~10mg/100mL、苏氨酸0.1~10mg/100mL、转铁蛋白0.1~10mg/100mL、胰岛素0.01~1mg/100mL、枸橼酸0.1~1g/100mL、磷酸二氢钠0.1~1g/100mL、腺嘌呤0.01~0.1g/100mL以及基础溶剂。[0007] 可选的,所述肝素钠为25mg/100mL、所述葡萄糖为5g/100mL、所述L‑谷氨酰胺为5mM、所述维生素C为2.5mg/100mL、所述维生素E为2.5mg/100mL、所述胆固醇为0.3mg/100mL、所述甘露醇为15mg/100mL、所述甘氨酸为2mg/100mL、所述甲硫氨酸为2mg/100mL、所述醋酸赖氨酸为2mg/100mL、所述缬氨酸为2mg/100mL、所述异亮氨酸为2mg/100mL、所述苯丙氨酸为2mg/100mL、所述亮氨酸为2mg/100mL、所述色氨酸为1mg/100mL、所述苏氨酸为2mg/100mL、所述转铁蛋白为2mg/100mL、所述胰岛素为2mg/100mL、所述枸橼酸为0.3g/100mL、所述磷酸二氢钠为0.3g/100mL,所述腺嘌呤为0.05g/100mL。[0008] 可选的,所述基础溶剂包括生理盐水。[0009] 可选的,所述适用于NK细胞培养的血液保存液的pH值为7.0~7.5。[0010] 可选的,所述适用于NK细胞培养的血液保存液的pH值为7.35~7.45。[0011] 本发明提供一种适用于NK细胞培养的血液保存液的制备方法,包括将所述组分按照预设浓度溶解于基础溶剂中配制。[0012] 本发明提供一种适用于NK细胞培养的血液保存液的使用方法,包括将待处理血液与如上所述适用于NK细胞培养的血液保存液混合,得到待处理液;[0013] 将所述待处理液放置于预设温度保存。[0014] 可选的,所述待处理血液与所述血液保存液的体积比为100:14。[0015] 可选的,所述预设温度为2~10℃。[0016] 本发明还提供一种试剂盒,该试剂盒包括如上所述适用于NK细胞培养的血液保存液,所述试剂盒用于血液保存、PBMC细胞提取、NK细胞扩增、NK细胞培养和外泌体制备中的任意一项或多项。[0017] 本发明提供的一种适用于NK细胞培养的血液保存液,通过该适用于NK细胞培养的血液保存液,能够较长时间地维持血液中细胞的活性,在后续分离的PBMC中仍然具有扩增和培养NK细胞的活力,在间隔较长时间再处理血液,例如长途运输、大批量样本需要处理等场景下,实现高质量的保存血液,较长时间维持NK细胞的活性特征,为体外培养可供临床使用的NK细胞提供了保障。此外本发明还提供其制备方法、使用方法,NK细胞培养的血液保存液能够应用于血液保存、PBMC细胞提取、NK细胞扩增、NK细胞培养、外泌体等试剂盒中,通过维持NK细胞的活性,提高上述试剂盒的效能。附图说明[0018] 为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。[0019] 图1是本发明提供的实验2的流式分析结果;[0020] 图2是本发明提供的实验3的杀伤活性统计结果。具体实施方式[0021] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明中的附图,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。[0022] 目前最常使用的血液保存液为ACD保存液,经研究发现,使用ACD保存液在4℃条件下保存的血液,24‑28小时后分离PBMC进行培养NK细胞,培养的NK细胞数量和质量较差,难以应用于科研等需求。经研究,本发明提供一种用于NK细胞培养的适用于NK细胞培养的血液保存液,该适用于NK细胞培养的血液保存液包括:[0023] 肝素钠5~50mg/100mL、葡萄糖1~10g/100mL、L‑谷氨酰胺1~10mM、维生素C0.1~10mg/100mL、维生素E0.1~10mg/100mL、胆固醇0.01~1mg/100mL、甘露醇5~50mg/100mL、甘氨酸0.1~10mg/100mL、甲硫氨酸0.1~10mg/100mL、醋酸赖氨酸0.1~10mg/100mL、缬氨酸0.1~10mg/100mL、异亮氨酸0.1~10mg/100mL、苯丙氨酸0.1~10mg/100mL、亮氨酸0.1~10mg/100mL、色氨酸0.1~10mg/100mL、苏氨酸0.1~10mg/100mL、转铁蛋白0.1~10mg/100mL、胰岛素0.01~1mg/100mL、枸橼酸0.1~1g/100mL、磷酸二氢钠0.1~1g/100mL、腺嘌呤0.01~0.1g/100mL以及基础溶剂。[0024] 肝素钠为抗凝剂,能干扰血凝过程的许多环节,减少采集的血液发生血凝。枸橼酸可避免保存液中的葡萄糖在消毒中焦化。基础溶剂为各个血液提供基础的环境,可采用磷酸缓冲液、生理盐水等溶液。[0025] 葡萄糖、L‑谷氨酰胺、维生素C、维生素E、胆固醇、甘露醇、甘氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和苏氨酸是营养剂,为血液中各个细胞的正常代谢提供营养。转铁蛋白可以和铁离子结合,将铁供给细胞,参与呼吸、DNA合成、氧化还原酶代谢等等生命活动。[0026] 胰岛素是一种蛋白质,可以促使细胞摄取血液中的葡萄糖,促进蛋白质合成和脂肪合成,抑制蛋白质和脂肪分解。胰岛素和转铁蛋白两者一起加入,可以起协同作用,维持细胞的正常代谢。腺嘌呤可以维持细胞能量代谢和细胞信号传导等细胞功能,还可促进红细胞ATP合成,延长红细胞的保存期并增强红细胞放氧功能。磷酸二氢钠的加入便于后续用氢氧化钠溶液调整保存液的pH。[0027] 各个组分的含量可根据血液样品的类型、血液样品来源个体种类的差异、血液样品中细胞成分等因素调整。例如预先通过血涂片等方式确定血液中红细胞数量较多,可以选用0.1g/100ml的腺嘌呤,以为红细胞提供充足的腺嘌呤。[0028] 血液保存液的pH值对血液活性具有较大影响,本实施例中适用于NK细胞培养的血液保存液采用弱碱性环境,pH值为7.0~7.5,最优选为与血液pH值相同的7.35‑7.45。值得一提的是,pH值的选择也与血液保存液的组分含量选择相似,可根据血液来源的个体的具体pH值进行调整。[0029] 基于以上组分、含量和pH值,提供以下3种不同血液保存液,并分为不同实验组。[0030] 实验组1的适用于NK细胞培养的血液保存液包括肝素钠25mg/100mL、葡萄糖5g/100mL、L‑谷氨酰胺5mM、维生素C2.5mg/100mL、维生素E2.5mg/100mL、胆固醇0.3mg/100mL、甘露醇15mg/100mL、甘氨酸2mg/100mL、甲硫氨酸2mg/100mL、醋酸赖氨酸2mg/100mL、缬氨酸2mg/100mL、异亮氨酸2mg/100mL、苯丙氨酸2mg/100mL、亮氨酸2mg/100mL、色氨酸1mg/100mL、苏氨酸2mg/100mL、转铁蛋白2mg/100mL、胰岛素2mg/100mL、枸橼酸0.3g/100mL、磷酸二氢钠0.3g/100mL、腺嘌呤0.05g/100mL,基础溶剂采用0.9%的生理盐水,pH7.4,后续用于4℃环境下血液保存。[0031] 实验组2的适用于NK细胞培养的血液保存液包括肝素钠25mg/100mL、葡萄糖5g/100mL、L‑谷氨酰胺5mM、维生素C2.5mg/100mL、维生素E2.5mg/100mL、胆固醇0.3mg/100mL、甘露醇15mg/100mL、甘氨酸2mg/100mL、甲硫氨酸2mg/100mL、醋酸赖氨酸2mg/100mL、缬氨酸2mg/100mL、异亮氨酸2mg/100mL、苯丙氨酸2mg/100mL、亮氨酸2mg/100mL、色氨酸1mg/100mL、苏氨酸2mg/100mL、转铁蛋白2mg/100mL、胰岛素2mg/100mL、枸橼酸0.3g/100mL、磷酸二氢钠0.3g/100mL、腺嘌呤0.05g/100mL,基础溶剂采用0.9%的生理盐水,pH7.0,后续用于4℃环境下血液保存。[0032] 实验组3的适用于NK细胞培养的血液保存液包括肝素钠25mg/100mL、葡萄糖5g/100mL、L‑谷氨酰胺5mM、维生素C2.5mg/100mL、维生素E2.5mg/100mL、胆固醇0.3mg/100mL、甘露醇15mg/100mL、甘氨酸2mg/100mL、甲硫氨酸2mg/100mL、醋酸赖氨酸2mg/100mL、缬氨酸2mg/100mL、异亮氨酸2mg/100mL、苯丙氨酸2mg/100mL、亮氨酸2mg/100mL、色氨酸1mg/100mL、苏氨酸2mg/100mL、转铁蛋白2mg/100mL、胰岛素2mg/100mL、枸橼酸0.3g/100mL、磷酸二氢钠0.3g/100mL、腺嘌呤0.05g/100mL,基础溶剂采用0.9%的生理盐水,pH7.5,后续用于4℃环境下血液保存。[0033] 实验组4适用于NK细胞培养的血液保存液包括肝素钠25mg/100mL、葡萄糖5g/100mL、L‑谷氨酰胺5mM、维生素C2.5mg/100mL、维生素E2.5mg/100mL、胆固醇0.3mg/100mL、甘露醇15mg/100mL、甘氨酸2mg/100mL、甲硫氨酸2mg/100mL、醋酸赖氨酸2mg/100mL、缬氨酸2mg/100mL、异亮氨酸2mg/100mL、苯丙氨酸2mg/100mL、亮氨酸2mg/100mL、色氨酸1mg/100mL、苏氨酸2mg/100mL、转铁蛋白2mg/100mL、胰岛素2mg/100mL、枸橼酸0.3g/100mL、磷酸二氢钠0.3g/100mL、腺嘌呤0.05g/100mL,基础溶剂采用0.9%的生理盐水,pH7.4,后续用于10℃环境下血液保存。[0034] 本发明还提供一种适用于NK细胞培养的血液保存液的配制方法,将上述组分按照预设浓度溶解于基础溶剂中配制。以0.9%的生理盐水为例,准备一定体积的生理盐水,将肝素钠、葡萄糖、L‑谷氨酰胺、维生素C、维生素E、胆固醇、甘露醇、甘氨酸、甲硫氨酸、醋酸赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、转铁蛋白、胰岛素、枸橼酸、腺嘌呤按照上述浓度添加至胜生理盐水中,并混合溶解。待各成分完全溶解后,添加磷酸二氢钠,以使得溶液pH值范围在7.0~7.5之间,同时磷酸二氢钠浓度在0.1~1g/100mL范围内,得到血液保存液。[0035] 本发明还提供一种适用于NK细胞培养的血液保存液的使用方法。将待处理血液与如如上所述适用于NK细胞培养的血液保存液混合,得到待处理液,然后将待处理液放置于预设温度保存。[0036] 其中,根据血液中各细胞和因子的浓度,待处理血液和适用于NK细胞培养的血液保存液的体积比优选为100:14,根据血液来源个体差异等因素,可调整待处理血液和血液保存液的体积比。[0037] 此外,为方便使用,可预先在采血管中加入固定体积的血液保存液,如14ml,并在采血管中加上114ml的刻度,根据刻度采集血液。[0038] 为延长待处理液的保存时间,应将待处理液存放于预设温度中,预设温度应为低温,如2~10℃,4℃为常用的温度。[0039] 得到待处理液后,可将待处理液用于提取PBMC、NK细胞培养以及对应NK细胞外泌体的制备等操作。例如通过Ficoll法(密度梯度离心法)提取待处理液中的PBMC,然后对PBMC进行培养,扩增NK细胞用于后续的实验,由于血液保存液对PBMC中的NK细胞能进行有效保护,故可得到大量具有活性的NK细胞。对于外泌体而言,NK细胞的外泌体(NK‑derivedExosome,NEO)具备较强的免疫调节功能,在肿瘤组织具有更好的渗透能力,故随着PBMC中的NK细胞的活性的保留,也能收集到大量富含NEO,以用于后续的研究和应用等工作。[0040] 为验证上述实验组1~4的适用于NK细胞培养的血液保存液的效用,本发明实施例还提供了两个对照组,其中对照组1采用传统的PIGPA保存液,对照组2采用传统ACD保存液。实验组和对照组对来源相同的血液进行处理,血液保存液和血液样品的体积比都为14:100,血液保存液和血液样品混合后的待处理液放于相同的环境(其中,实验组4放在10℃,其余组放在4℃),并分别在第0天、第三天和第五天进行以下实验进行检测。[0041] 实验1为细胞存活率检测,检测对象包括实验组和对照组中提取的PBMC,以及对PBMC培养16天后的总细胞。将实验组1~4和对照组1~2中的PBMC细胞和PBMC培养16天后的总细胞进行AO/PI染色,再采用细胞计数仪进行细胞计数,计算出细胞存活率,统计结果如表1和表2所示。[0042] 表1PBMC存活率对比表(%)[0043]组别 保存0天 保存3天 保存5天实验组1 99.01±0.32 97.85±0.56 96.15±0.62实验组2 98.93±1.12 96.75±0.54 95.90±1.17实验组3 99.07±0.45 96.83±0.62 95.70±0.97实验组4 98.52±0.85 95.35±0.88 93.97±1.51对照组1 98.66±0.66 86.63±0.63 74.41±0.88对照组2 98.83±0.42 73.84±1.23 65.85±1.28[0044] 表2总细胞存活率对比表(%)[0045]组别 保存0天 保存3天 保存5天实验组1 94.01±1.10 92.83±0.42 90.68±0.45实验组2 93.02±0.55 90.97±0.73 89.35±0.77实验组3 93.46±1.57 91.19±1.35 87.12±2.56实验组4 94.08±2.61 89.01±1.26 85.08±1.82对照组1 93.92±0.30 58.64±1.45 46.01±1.10对照组2 93.44±0.82 37.64±2.09 21.78±2.12[0046] 由上述表格数据明显看出,在保存至第五天时,实验组的总细胞和PBMC的存活率明显高于两个对照组。故本发明提供的适用于NK细胞培养的血液保存液能够在不同pH和温度条件下,实现对血液样本的长时间高效保存,提高细胞存活率。[0047] 实验2为NK细胞纯度检测。将不同组别提取的PBMC细胞培养,并收集培养后的细胞进行NK细胞纯度检测。本实施例采用的纯度检测方式为流式分析,标签蛋白为CD3和CD56,‑ +NK细胞属于CD3 且CD56细胞,故通过标签蛋白可分析NK细胞的占比,检测结果如图1所示(由于对照组的活细胞数量较少,不足以达到流式分析的数量要求,故检测结果不包含对照组)。[0048] 根据图1分析可得,使用本实施例提供的血液保存液保存五天后的血液,其PBMC培养得到的NK细胞百分率最高的是实验组1(69.0%),最低的是实验组4(65.9%)。故经本发明血液保存液保存5天后的血液提取的PBMC细胞仍然具有扩增培养NK细胞的能力。本发明实施例提供的适用于NK细胞培养的血液保存液在pH7.0~7.5之间,温度2~10℃的环境下仍能都能够取得较好的血液保存效果。[0049] 实验3为NK细胞杀伤活性检测,该检测采用LDH释放实验检测NK杀伤活性。以白血病细胞系K562细胞为靶细胞,以对实验2分选得到的NK细胞为效应细胞,将处于对数期生长的K562细胞离心排散制备成单个细胞悬液。通过AO/PI染色计数和调整,得到细胞浓度为25×10个/mL的细胞悬液。取50ul细胞悬液,同时加入分选后的NK细胞50ul,并同时设立效应细胞及靶细胞自然释放孔、靶细胞最大释放孔及培养基自然释放孔,体积校正对照孔,并设有三个重复的复孔。孵育培养24小时,待反应结束前45分钟,在靶细胞最大释放孔中加入10ul裂解液。孵育结束后,没孔吸取50ulLDH酶反应液和50uL上清液至干净的孔板中,避光反应30分钟,再加入反应终止液50uL,使用酶标仪检测其OD值。杀伤活性计算公示如下:[0050] 杀伤活性(%)=(测定管OD值‑靶细胞自然释放管OD值‑效应细胞自然释放管OD值)/(靶细胞最大释放管OD值‑靶细胞自然释放管OD值)×100%;[0051] 随着NK细胞杀伤活性越高,靶细胞K562释放的LDH越多,OD值越高,故杀伤活性也越高,统计结果如图2所示。[0052] 如图2所示,虽然随着时间的推移,NK细胞的杀伤能力发生了下降,但是皆未低于70%,整体维持在较高的水平,仍可用于后续的工作,同时本发明的适用于NK细胞培养的血液保存液在pH7.0~7.5之间,温度10℃仍然能够取得较好的保存效果。[0053] 本发明还提供一种试剂盒,该试剂盒包括如上所述的适用于NK细胞培养的血液保存液,该试剂盒能够应用于血液保存、PBMC细胞提取、NK细胞扩增、NK细胞培养、通过NK细胞上清液制备外泌体等方面,通过其对血液中NK细胞质量和数量的有效保存,提高PBMC细胞提取、NK细胞扩增和培养、NK细胞的外泌体提取等目的的高效实现。[0054] 最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

专利地区:广东

专利申请日期:2023-11-22

专利公开日期:2024-09-03

专利公告号:CN117546837B


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