专利名称:ChemDiv L676-1461在制备鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵抑制剂中的应用
专利类型:发明专利
专利申请号:CN202310837589.X
专利申请(专利权)人:重庆大学附属肿瘤医院,重庆理工大学
权利人地址:重庆市沙坪坝区汉渝路181号
专利发明(设计)人:唐玥璐,武英杰,李超,向露,庹彦,王远强
专利摘要:本发明公开了一种ChemDiv L676‑1461在制备鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵抑制剂中的应用,其分子式为:C24H32N4O2S结构式为:#imgabs0#本发明基于计算机辅助药物设计的方法发现化合物ChemDiv L676‑1461,其能抑制鲍曼不动杆菌外排泵对抗生素的摄取、外排作用,同时对生物膜的形成也具抑制作用,能够大大降低抗生素耐药性,对临床耐药鲍曼不动杆菌感染治疗有着重要的意义,极具应用开发前景。
主权利要求:
1.一种ChemDivL676‑1461在制备鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵抑制剂中的应用,其分子式为:C24H32N4O2S
结构式为: 说明书 : ChemDivL676‑1461在制备鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵抑制
剂中的应用技术领域[0001] 本发明属于抗菌外排泵抑制剂技术领域,具体涉及一种ChemDivL676‑1461在制备鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵抑制剂中的应用。背景技术[0002] 鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,AB)为不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性杆菌,广泛存在于水、土壤、医院环境中,是引起医院内感染的重要致病菌,能引起身体多个组织器官感染,如泌尿系感染、呼吸相关性肺炎、伤口感染、软组织感染等。近年来,由于抗生素的不合理使用,鲍曼不动杆菌耐药菌株的检出率在全球范围内急剧增加,多重耐药鲍曼不动杆菌(Multidrug‑resistanceAcinetobacterbaumannii,MDR‑AB)的耐药情况越演越烈。[0003] 由于抗菌药物的广泛滥用,导致鲍曼不动杆菌几乎所有的抗生素都可以产生耐药性,给临床治疗工作带来极大的挑战。鲍曼不动杆菌的耐药机制类型复杂多样,主要分为固有耐药和获得性耐药两类,包括β‑内酰胺酶的产生、外排泵的过表达、药物作用靶位发生改变、蛋白孔通道的表达下降,生物被膜的形成等。[0004] (1)β‑内酰胺酶的产生[0005] β‑内酰胺酶是最普遍的一种蛋白质,其能够水解该类抗生素所具有的β‑内酰胺环,使其断裂而失去抗菌活性,是目前鲍曼不动杆菌中重要的耐药机制之一。根据Ambler分类主要分为A、B、C、D共4个类别,即A类超广谱β‑内酰胺酶(ESBLs)、B类金属酶、C类头孢菌素酶(AmpC)、D类OXA型酶。与鲍曼不动杆菌产生耐药性有关的主要包括产生A类酶、B类酶、D类酶3类,少见产C类酶。[0006] (2)外排泵的过度表达[0007] 外排泵的过度表达是鲍曼不动杆菌多重耐药的主要机制之一,会使菌体内的药物含量减少,导致抗菌药物无法发挥抗菌效果而引起耐药。目前已知有五个家族的外排泵与细菌耐药性增加有关:ATP结合盒式蛋白家族(ATPbindingcassettesuperfamily,ABC)、耐药结节分化家族(Resistancenodulationdivisionfamily,RND)、小多耐药家族(smallmultidrugresistancefamily,SMR)、多药与毒性化合物外排家族(MultidrugAndToxiccompoundExtrusionfamily,MATE)和主要易化因子超家族(Majorfacilitatorsuperfamily,MFS)。研究报道,耐药结节分化家族是引起不动杆菌属多重耐药最重要的外排系统,主要包括AdeABC、AdeFGH和AdeIJK外排泵,其中AdeABC外排泵是被临床研究最早的外排系统,也是产生耐药的最主要因素。[0008] (3)药物作用靶位发生改变[0009] 药物作用靶位经过修饰或基因突变后,会引起药物与靶点之间的亲和力下降,导致细菌耐药的产生。典型的青霉素结合蛋白(Penicillin‑BindingProteins,PBPs),是碳青霉烯类抗生素的产生作用的靶点,主要通过抑制胞壁粘肽合成酶,从而阻碍细胞壁粘肽合成,使细菌胞壁缺损,菌体膨胀致使细菌胞浆渗透压改变和细胞溶解而杀灭细菌。PBPs通过改变药物作用位点,降低了与碳青霉烯类抗生素的结合能力,鲍曼不动杆菌的抗菌能力增强,导致CRAB的产生。[0010] (4)外膜蛋白的缺失或改变[0011] 外膜孔通道蛋白是细菌进行各种物质交换的通道,同时外膜蛋白参与各种抗菌药物的转运,其缺失或改变是引起多重耐药鲍曼不动杆菌的重要耐药机制之一。外膜蛋白基因发生改变时,蛋白孔通道的表达下降,药物通过的孔道便会发生阻塞或消失,使细菌外膜通透性下降,阻碍药物进入菌体,导致细菌产生耐药。例如,外膜蛋白A(OutermembraneproteinA,OmpA)是革兰阴性菌外膜蛋白的主要组成部分,对鲍曼不动杆菌的耐药性起重要作用,它可以改变细胞外膜的通透性,结合细胞表面的特定成分侵入引起靶细胞凋亡。[0012] (5)生物膜的形成[0013] 生物膜是一种物理屏障,是由细菌细胞群被自身产生的细胞外聚合物,如多糖、蛋白质、核酸和脂类等物质包裹所形成的膜结构,可以增强细菌对抗菌药物的抵抗力。鲍曼不动杆菌较强的黏附力使其容易在医院环境及各类医疗器械上形成生物膜产生耐药性,主要机制是:生物膜内的高密度细菌能够在一定程度上阻止抗菌药物进入细胞基质,使抗菌药物作用难度加大,细菌能产生较强的耐药力和免疫逃逸能力。另外,生物膜内缺乏营养空气等条件,使细菌生长发育缓慢,对抗生素敏感能力减弱。[0014] 鲍曼不动杆菌外排泵‑AdeABC[0015] 外排泵(Effluxpumps,EP)是指细菌将胞内的药物或毒性物质排出胞外的蛋白转运系统,需要进行质子交换或水解ATP提供能量。在五大外排系统中,RND家族外排系统对鲍曼不动杆菌多重耐药的形成发挥着重要作用,主要涉及AdeABC、AdeFGH、AdeIJK[22,23]。该家族的外排系统主要由内膜转运蛋白(IMP)、周质融合蛋白(MFP)和外膜外排蛋白(OEP)组成,IMP和OEP呈同源三聚体结构,MFP呈六聚体结构。IMP利用质子浓度梯度提供能量,通过质子/底物反转运机制将底物外排。在RND家族中,外排泵AdeABC是最主要的成员,是在鲍曼不动杆菌首个被发现,也是近年来研究最多的外排系统,它能够排出β‑内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类等多种抗菌药物,且AdeB外排基因的过表达甚至可能导致鲍曼不动杆菌对临床首选药物—碳青霉烯类抗生素产生耐药。[0016] AdeABC是膜融合蛋白(AdeA)、多药物转运蛋白(AdeB)和外膜通道蛋白(AdeC)组成的一个三联体,在外排过程中,AdeA主要是协调作用,它能稳定外膜蛋白的结构,并使细菌细胞外膜与内膜尽可能接近;AdeB是外排泵主要功能元件,具有识别和摄取药物作用,并通过AdeC将其主动转运至细胞膜外。AdeABC操纵子位于染色体DNA中,在鲍曼不动杆菌中保持固有的低表达,其表达受到调控基因(AdeRS)的严格调控[29]。AdeRS它是一个经典的二元调控系统,AdeS为信号识别蛋白质,AdeR为DNA结合蛋白质。由AdeABC操纵子上游的AdeRS操纵子编码,并向相反方向转录,二者共同调控AdeABC基因的表达。AdeABC外排泵的过表达会增加对抗生素的外排作用,减少胞内抗生素的累积,从而使得鲍曼不动杆菌的耐药性及多重耐药性增加。研究表明鲍曼不动杆菌耐药性与AdeB基因高表达有关,并且AdeABC可与外膜蛋白共同介导碳青酶烯类抗生素耐药。2018年,张彦鹏等人通过实时荧光定量检测外排泵基因表达情况,证实鲍曼不动杆菌外排泵基因AdeB过度表达与碳青霉烯类抗生素的耐药机制关系密切。因此,针对目前严重的细菌耐药问题,我们可以基于靶点AdeB开发新型药物,抑制外排泵的过表达,解决鲍曼不动杆菌耐药及多重耐药等问题。[0017] 过去十年中,主动外排是抗生素耐药性的一个主要原因,是抗感染治疗最重要的趋势之一。外排系统具有的底物广泛性使得这种现象几乎影响到所有种类的抗生素。通常表现为外排基因的过表达引起药物外排增加,胞内药物浓度下降,临床疗效降低,从而介导多药耐药表现型的产生,是多药耐药产生的重要机制。外排泵抑制剂(EffluxPumpsInhibitors,EPIs)可以抑制耐药细菌对药物的外排,恢复其对药物的敏感提高耐药细菌的治疗效果[33,34]。[0018] 目前已经发现多种化合物可以抑制外排泵的外排作用,以主动外排系统不同的供能方式,可分为ATP水解能驱动型、跨膜质子梯度能驱动型及其他类天然化合物抑制剂。[0019] 1)ATP水解能驱动型[0020] 利血平(Reserpine,RES),是一种具有降血压活性的小分子生物碱,是首个被发现对细菌外排有抑制作用的化合物。Neyfakh等人报道利血平对细菌外排有抑制作用,能提高金黄色葡萄球菌对诺氟沙星、环丙沙星等外排泵底物的敏感性,且对细菌固有的或抗生素诱导的外排泵均有抑制作用,同时能减少耐药菌株的出现。这一研究为解决耐药菌感染问题注入了新的能源,为后续外排泵抑制剂的发现给出了新导向。[0021] 类似地,用于治疗高血压等疾病维拉帕米(Verapami,VER),是一种电压门控Ⅰ型钙通道阻滞剂,是外排转运蛋白P‑糖蛋白和细胞色素P4503A4酶(CYP3A4)的特异性抑制剂。据报道,它能够通过阻断结核分枝杆菌的外排泵,降低各种抗分枝杆菌药物的抑菌浓度,与一些膜活性剂类似,维拉帕米破坏膜功能并诱导膜应激反应,从而与抗结核杆菌药物产生协同作用,但其外排泵抑制机制尚未完全阐明。[0022] (2)跨膜质子梯度能驱动型[0023] 苯丙氨酸‑精氨酸β‑萘酰胺(Phenylalanylarginylβ‑naphthylamide,PAβN)作为广谱抑制剂,对各种革兰氏阴性细菌的耐药‑结瘤‑分裂(RND)泵有效,恢复菌株的抗生素敏感性。特别是能有效减少铜绿假单胞菌的MexAB‑OprM,MexCD‑OprJ和MexEF‑OprN3个种RND泵对氟喹诺酮等的外排作用,也对大肠埃希菌的AcrAB‑TolC泵同样具有抑制作用。Opperman等报道其抑制作用可能是运输过程中与药物竞争结合位点的结果。Misra等最终认为PAβN的主要作用机制是抑制外排泵活性。PAβN对多种外排系统均有较好的抑制作用,但其结构中的阳离子基团,会导致药物在组织中长时间的积聚,引起严重的肾毒性。尽管有试图通过对其结构进行修饰改善其药物特性,但并没有取得实质性进展。此外,还有同样还具有在逆转多粘菌素耐药性方面表现出独特的生物活性的外排抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(Carbonylcyanide3‑chloropenylhydrazone,CCCP)也是类似的情况。[0024] (3)其他类天然化合物型[0025] 粉防己碱(Tetrandrine,TET)是一种双苄基异喹啉生物碱,从传统中草药粉防己碱中提取,已被用于治疗癌症、炎症、哮喘和高血压。与维拉帕米类似,粉防己碱是一种典型的天然L‑Ca2+型钙通道和P‑糖蛋白抑制剂。Zhang等发现粉防己碱与异烟肼(INH)和乙胺丁醇(EMB)联合使用,可降低多重耐药结合分支杆菌的最低抑菌浓度,且有助于减少药物剂量和副作用。[0026] 另外,小檗碱(Berberine,BBR)是广泛存在于小檗属植物中的两亲性异喹啉生物碱,具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗胆固醇和抗糖尿病多种药理作用,也是目前公认的外排泵底物。与抗生素联合用药,小檗碱的胞内浓度增大,且由于竞争性抑制外排作用,抗生素效应也有所增强,最终会使得整体抗菌效果增强。鉴于小檗碱溶解度有限,胃肠道吸收差,加之严重的首过代谢及P‑糖蛋白介导的外排而导致血浆水平低下。因此,口服小檗碱如何在体内发挥如此广泛而显著的药理作用一度令人困惑。[0027] 随着鲍曼不动杆菌的感染与多药耐药的日益增强,外排泵成为了对抗耐药的一个关键因素。目前报道的外排泵抑制剂多是从现有药物中进行筛选,尽管这些抑制剂能提高抗菌药物敏感性,但其存在的不良反应多、生物活性低等缺点限制了其作为抗菌药物增效剂用于抗感染治疗。外排泵抑制剂的认识为解决耐药菌感染问题提供了新的思路并奠定了一定的理论基础,且外排泵不仅与多种抗生素药物的外排相关,还参与菌株运动以及产生毒性等生理活动,其抑制剂的研发有望成为解决耐药及多重耐药问题的关键。因此,基于外排系统的潜在靶点开发新型外排泵抑制剂已受到越来越多研究者的关注。发明内容[0028] 为了解决上述技术问题,本发明的目的在于提供一种ChemDivL676‑1461在制备鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵抑制剂中的应用,其分子式为:C24H32N4O2S[0029] 结构式为: 本发明基于计算机辅助药物设计的方法发现化合物ChemDivL676‑1461,其能抑制鲍曼不动杆菌外排泵对抗生素的摄取、外排作用,同时对生物膜的形成也具抑制作用,能够大大降低抗生素耐药性,对临床耐药鲍曼不动杆菌感染治疗有着重要的意义,极具应用开发前景。附图说明[0030] 图1为化合物对接构象图。[0031] 图2为对照化合物CCCP与蛋白AdeB复合体的模拟结果。[0032] 图3为化合物ChemDivL676‑1461与蛋白AdeB复合体的模拟结果。[0033] 图4为鲍曼不动杆菌和多重耐药鲍曼不动杆菌的生长曲线。[0034] 图5为药物敏感实验。[0035] 图6为化合物对HSF细胞的体外毒性作用。[0036] 图7为12个化合的ADME\T预测结果。[0037] 图8为12个复合体系在MD模拟过程中的RMSF,SASA和Rg结果。具体实施方式[0038] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述。[0039] 本发明选取的鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵的主要元件AdeB作为靶标蛋白,其晶体结构(PDBID:7KGG,分辨率: )从PDB蛋白数据库中获得(http://www.rcsb.org/pdb)。本发明的化合物选自:ChemDiv和Chembridge数据库,ChemDivL676‑1461小分子化合物主要源于数据库:ChemDiv。[0040] 其分子式为:C24H32N4O2S[0041] 结构式为:[0042] 实施例1[0043] ChemDivL676‑1461化合物与受体蛋白分子对接[0044] 采用的软件SYBYL‑X2.0(上海源资信息科技有限公司)、DiscoverStudio(https://discover.3ds.com/d)、AMBER、Origin2016及可视化PyMoL等执行虚拟筛选、分子对接和分子模拟研究。[0045] 1)受体蛋白的预处理[0046] 基于SYBYL‑X2.1.1软件中的Surflex‑Dock模块,对PDB蛋白数据库中获得的AdeB晶体结构进行预处理。首先观察受体蛋白的二级结构,并进入PrepareProteinStructures蛋白准备模块提取复合物中的配体分子;然后利用RemoveSubstructure和AnalyzeSelectedStructure两个模块,完成晶体蛋白中水分子的移除、氨基酸残基的修复等处理。最后以pdb格式保存预处理完成的受体蛋白。[0047] 2)配体的预处理[0048] 利用SYBYL‑X2.1.1软件对包括ChemDivL676‑1461的12个化合物(见表1)进行力场加载、能量最小化等预处理并保存配体文件。[0049] (3)分子对接[0050] 通过Surflex‑Dock模块载入已预处理的受体蛋白,并基于提取的共晶配体创建对接配置文件。主要利用DockingMode中的Surflex‑DockScreen(SFXC)和Surflex‑DockGeomX(SFXC)2个模式完成。首先采用刚性对接模块(Surflex‑dock)对分子进行初步筛选,获得筛选的表1中的12个化合物,接着对初筛获得的化合物类药性进行评估,并利用Surflex‑DockGeomX模块对类药性合格的化合物进行高精度对接。再对该化合物进行分子动力学模拟和结合自由能评估。[0051] 4)类药性评估[0052] 利用软件DiscoverStudio将分子初筛获得的化合物ChemDivL676‑1461进行类药性评估。将化合物加载分子窗口界面,并利用SmallMolecules模块中的FilterLigands工具对小分子化合物进行过滤。该方法主要基于Lipinski和Veber规则对成药性进行评估,需要满足化合物分子量≤500Da、脂水分配系数LogP≤5、氢键供体数≤5、氢键受体数≤10及可旋转键数≤10等要求。[0053] 5)分子动力学模拟[0054] 在MD模拟之前,我们获取了脂质双分子层中蛋白质的空间排列的相关数据从OPM网站(https://opm.phar.umich.edu)。并利用CHARMM‑GUIweb服务器将完整的AdeB蛋白结构嵌入鲍曼不动杆菌内膜中,尺寸约为111×111×111nm(www.charmm‑gui.org)。我们选择鲍曼内膜成分的简化版,其由80%1‑棕榈酰‑2‑油酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(POPE),和20%1‑棕榈酰‑2‑油酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸甘油(POPG)组成。[0055] 使用PMEMD.mpi和PMEMD.cuda模块。首先将受体蛋白AdeB和化合物分别加载ff14SB力场和Amber力场(GAFF),将复合体系的初始构象插入具有TIP3P溶剂化模型的水箱中,立方体盒子的载体为112×112×112nm,并在周期性边界条件下添加钠离子是整个系统电荷中和。接着,为了避免分子间存在的不利碰撞复合物,使用共轭梯度算法和最陡下降法进行5000个循环的最小化处理,并通过NVT和NPT模拟使复合体系的温度和气压分别稳定在300k和1atm(时间步长为2fs)。最后,每个复合体系执行100ns的动力学模拟,且每100ps保存一次模拟系统的运动轨迹。[0056] 6)结合自由能计算[0057] 基于动力学模拟的轨迹文件,利用MM/GBSA的方法计算候选化合物与AdeB靶标之间的结合自由能,并分解各个氨基酸残基的能量贡献,其计算公式如下:[0058] ΔGbind=ΔEMM+ΔGsol–TΔS式(2‑1)[0059] ΔGsol=ΔGGB+ΔGSA式(2‑2)[0060] ΔEMM=ΔEinternal+ΔEelectrostatic+ΔEvdw式(2‑3)[0061] 其中ΔGbind为结合能,ΔEMM为真空中分子机械能之和,其能量贡献来源包括静电能、范德华能和内能;ΔGsol是溶剂化作用的能量,包括极性溶剂化能量(ΔGGB)和非极性溶剂化能量(ΔGSA);TΔS为配体结合构象熵的变化,T是绝对温度,ΔS是分子的熵。[0062] 7)ADME\T特性预测[0063] 利用DiscoverStudio软件从理论上对该化合物的ADME\T特性进行预测,主要包括吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)、排泄(Excretion)指标等。在ADME\TDescriptors模块中,我们选择ADME\T的描述符水溶解度(Aqueoussolubility),细胞色素P450抑制作用(CytochromeP450inhibition),血脑屏障渗透性(BBB),人体肠道吸收(HIA),肝毒性(Hepatotoxicity)和血浆蛋白结合率(PPB),预测化合物的药动学性质。[0064] 从对接得分来看,ChemDivL676‑2179、ChemDivL676‑1461的结果明显优与对照药物CCCP(TotalScore=3.802),ChembridgeL676‑2179拥有高的对接分数(TotalScore=7.214),ChemDivL676‑1461次之,表明该选化合物也可能具更良好的生物活性。[0065] 表112个化合物的化学结构及对接得分[0066][0067][0068][0069] 图1显示了12个化合物对接构象,12个化合物均位于靶标蛋白AdeB的活性口袋内,表明这些化合物与受体蛋白在空间结构上形成较好的契合。ChemDivL676‑1461与受体蛋白在空间结构上也能形成较好的契合。此外,结合位点处存在的重要氨基酸残基Met570、Met656、Val658、Phe612、Glu710、Trp708和Met706,他们在化合物与靶标蛋白之间的相互结合中起着关键的作用。[0070] 8)类药性预测结果[0071] 基于DiscoverStudio预测化合物的类药性预测,得到该化合物评估结果见表2,他的分子量、脂水分配系数、氢键供体数、氢键受体数及可旋转键数基本都在合理范围内。因此,进行后续的分子动力学模拟,以探索靶标与候选化合物的结合机制等研究。[0072] 表2化合物的药物性质[0073][0074] 9)分子动力学模拟的结果[0075] 利用AMBER软件对蛋白与候选化合物的复合物进行100ns分子动力学模拟,获取化合物与蛋白稳定结合的构象,从而深入研究化合物与蛋白形成的相互作用模式和关键氨基酸残基的能量贡献。对照化合物CCCP与蛋白AdeB复合体的模拟结果见图2。图2a为AdeB/CCCP复合物动力学模拟的均方根偏差(RMSD),模拟开始时,CCCP在~0.5和 附近上下波动,85ns后平衡在 附近;而AdeB蛋白由于其结构中的无规则卷曲区域太多,导致RMSD值较高,从初始波动位置 缓慢上升,经过30ns后达到 之后保持稳定在该值附近波动,表明复合体系达到了稳定状态。图2b为AdeB/CCCP复合物关键氨基酸残基的结合自由能贡献图,位于结合位点处的10个残基Val707、Val658、Trp708、Ser572、Pro660、Phe612、Met706、Met656、Met570和Ile821有着重要的能量贡献,其中Val658和Pro660分别为‑6.941kcal/mol和‑4.190kcal/mol。图2c为AdeB/CCCP复合物的氢键分析结果,整个动态模拟过程中AdeB/CCCP复合物形成了1‑2个氢键。图2e和图2f为AdeB/CCCP复合物最低能量构象的相互作用模式,化合物CCCP与AdeB蛋白残基Val658 分别形成一个氢键和一个疏水相互作用;与残基Leu659 Pro660 Pro661 形成了3个疏水相互作用。此外,它与Met561 形成了卤键(halogen),与Met706 形成一个Pi‑硫(Pi‑Sulfur)。[0076] 化合物ChemDivL676‑1461与AdeB复合体的模拟结果见图3。在100ns模拟过程中,ChemDivL676‑1461的RMSD在10ns后进入稳定波动状态,一直保持在 (图3a)。AdeB蛋白的RMSD在0~50ns时波动在 附近,之后保持在 附近小幅度波动,最终达到了稳定波动状态。图3b为他们残基的能量分解结果,与对照化合物有着相同的关键残基且其能量贡献结果可观。其中,残基Trp708、Met656与ChemDivL676‑1461的相互作用能分别约为‑6.194kcal/mol和‑6.853kcal/mol。该复合体的氢键数与CCCP相似,保持在1‑2个左右(图3c)。AdeB/ChemDivL676‑1461复合物的最低能量构象的相互作用模式图3e显示,化合物ChemDivL676‑1461与AdeB蛋白残基Phe704 Met706 形成2个碳氢键;与Val658 Met706 Met656 Phe669Trp708 Leu659 Phe612 形成了11个疏水相互作用;另外与Phe704 还存在一个Pi‑Sigma键。[0077] 10)RMSF、RG及SASA的结果[0078] 为了进一步评估12个复合体系统稳定性,我们计算了分子动力学模拟轨迹的均方根涨落(RMSF)、回转半径(Rg)、溶剂可及表面积(SASA),结果如图8所示。图8是12个复合体系的AdeB受体蛋白RMSF图,直观显示了骨架结构的灵活性和结构的局部运动特性。显然,在模拟过程中,由于ChemDivC200‑6341和ChemDiv3379‑1103不能与受体蛋白很好地结合,引起了蛋白出现了较大的震动,导致复合体AdeB/ChemDivC200‑6341和AdeB/ChemDiv3379‑1103的氨基酸残基RMSF波动较大。而另外10个复合体大部分残基的RMSF值均低于且受体蛋白均有着相似的波动轨迹,表明与这些化合物结合的蛋白AdeB具有良好的动态稳定性。而回转半径表征了颗粒结合的紧密性,并可以反映蛋白质在空间分布中的延展性,当颗粒结合的紧密度较大时,相应的Rg值较小,其结果见图8c。12个系统的骨架原子的Rg值基本上分别稳定在约 到 之间,这意味着在模拟期间蛋白质的延展性良好。图8b为复合物的溶剂可及表面积随时间变化情况,12个复合物的疏水氨基酸残基的SASA值稳定在 附近,表明隐藏在蛋白质内部的疏水氨基酸的数量基本不变,且蛋白质的结构在模拟时间内是稳定的。[0079] 11)结合自由能计算的结果[0080] 由于药物作用还与结合亲和力紧密相关,而结合自由能可以用来表示配‑受体之间的相互作用能力。因此,采用MM/GBSA方法计算了12个复合体的结合自由能,主要包括静电相互作用、范德华力以及复合物之间产生的其他作用力。结果见表3[0081] 12个候选抑制剂的结合能强弱表现为:ChemDivL676‑2179>ChemDivL676‑1461>Chembridge53717615>ChemDivC200‑6341>Chembridge93546223>ChemDivT482‑1954>ChemDiv6809‑0355>ChemDivD072‑0756>ChemDiv2641‑1576>ChemDivF432‑0587>ChemDivD621‑0003>ChemDiv3379‑1103。相比CCCP的结合能(ΔGBind=‑28.94Kcal/mol),化合物ChemDivL676‑2179、ChemDivL676‑1461和Chembridge53717615有着显著优秀的结合能,分别为‑42.083Kcal/mol、‑40.978Kcal/mol和‑36.568Kcal/mol。这表明他们与受体蛋白结合更容易,可能具更优秀的潜在生物活性。[0082] 表3结合自由能计算的结果(Kcal/mol)[0083][0084][0085] 12)ADME\T预测的结果[0086] 我们对12个候选化合物的进行ADME\T预测分析,结果如图7所示。除了化合物Chembridge93546223外,其余化合物均在限定椭圆范围之中,这表明他们满足类药五原则的要求,即11个均具有良好的ADME\T特性,ChemDivL676‑1461符合化合物成药性特征。因此,我们将这一系列化合物作为有潜力的外排抑制剂进行合成研究,并通过体外活性实验去验证其潜在的生物活性。[0087] 实施例2[0088] 生物活性评价[0089] 1)材料[0090] (1)实验菌株:野生型鲍曼不动杆菌(AcinetobacterbaumnniiGDMCC‑11336)购于广东省微生物菌种保藏中心,耐药型鲍曼不动杆菌由陆军军医大学提供。[0091] (2)细胞株:HSF细胞(人正常表皮成纤维细胞)实验室保存(重庆大学肿瘤医院)。[0092] 2)溶液配制[0093] (1)固体培养基的配制:以NA固体粉末:蒸馏水=33g:1000mL的比例配置所需用量,高压灭菌后,待冷却至40℃左右倾倒于平板中,凝固备用。[0094] (2)液体培养基的配制:以MH肉汤固体粉末:蒸馏水=24g:1000mL的比例配置所需用量,高压灭菌冷却后使用。[0095] (3)磷酸盐缓冲液的配制:取1包磷酸盐缓冲液粉末,完全溶于1L二级水,121℃高压蒸汽灭菌20min后分装备用。[0096] (4)DMEM完全培养基:DMEM培养基(90mL)+10%的胎牛血清(10mL)+0.1%的双抗(1mL)。[0097] (5)化合物的配制:取适量CCCP、候选抑制剂、亚胺培南、头孢拉啶、左氧氟沙星、阿米卡星、四环素、阿奇霉素、庆大霉素溶解于二甲基亚砜(细胞级别)或者灭菌水中配置成母液,分装保存于‑80℃冰箱,使用时用培养基稀释至所需浓度。[0098] 3)实验方法[0099] a菌液的制备[0100] (1)细菌复苏:从‑80℃冰箱中取出冻存菌液解冻,在生物安全柜中稀释菌液,并用接种环蘸取细菌稀释液在NA培养基上划线,将平板倒置于培养箱中37℃恒温培养16‑18h。[0101] (2)活化:用接种环挑取上述于平板划线法所得单菌落,至装有100mL肉汤培养基中,放入恒温振荡器(37℃,180rpm)中振荡过夜,此活化步骤至少连续操作两次。[0102] (3)菌液制备:挑取单个菌落接种至MH肉汤培养基中,于恒温振荡培养箱37℃180rpm/min过夜培养16‑18h。转移至2mL离心管中8000rpm/min离心,洗涤3次之后,用新鲜的肉汤液体培养基重悬。将菌液浓度均调整为0.5麦氏单位(1×108CFU/mL),再用肉汤稀释至所需实验浓度1×105CFU/mL备用。[0103] b生长曲线的测定[0104] 为了研究细菌的生长速度,获取实验所需的处于生长对数期的菌液,测定了2株鲍曼不动杆菌的生长曲线。将两种菌株的单个菌落分别接种至含100mL肉汤培养基的锥形瓶中,使用无菌滤膜封口,放入恒温振荡器(37℃,180rpm)中培养,分别于0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h取样,使用酶标仪测定菌液的600nm下的吸光度,设三组平行实验。以吸光度值为纵坐标,时间为横坐标,采用软件Origin2016绘制细菌的生长曲线。[0105] c最小抑菌浓度测定[0106] 将制备的处于对数生长期的菌液稀释至1×105CFU/mL,在96孔细胞培养板中加入50μL。对照药物CCCP的母液稀释至2560μM,采用二倍稀释法加入50μL不同浓度的药液(2560、1280、640、320、160、80、40、20、10μM),每组浓度设置三个平行组,将MH肉汤培养基设为阴性对照,菌液作为生长对照。37℃恒温过夜培养16h后,观察每组孔中肉汤培养基的浑浊情况,无细菌生长的最低浓度为CCCP的MIC值。采用相同方法检测候选抑制剂对2株鲍曼不动杆菌的MIC值,并以1/4×MIC浓度作为候选抑制剂和CCCP的工作浓度。[0107] 4)外排泵抑制实验[0108] 将7种抗生素的母液稀释至2560μM,同样采用二倍稀释法加入50μL不同浓度的不同浓度的抗生素(2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μM)于96孔板,再加入50μLCCCP和50μL1×105CFU/mL菌液,每孔中CCCP的终浓度为80μM。将肉汤培养基设为阴性对照,菌液作为生长对照,每组设置三个平行以保证结果的准确性,置于恒温培养箱37℃过夜培养16h,观察实验结果。同样,采用上述方法完成候选抑制剂的外排泵抑制实验。结果判断按照CLSIM100版标准,当加入外排泵抑制剂CCCP后,MIC值降低4倍及以上判定为外排泵表型阳性,值得注意的是MIC试验与外排泵抑制实验同时进行。[0109] 5)细胞毒性实验[0110] 细胞毒性实验是检测化合物对正常细胞的增殖影响,能有效降低药物在体内产生的副作用。本研究使用CCK‑8检测法对候选抑制剂的细胞毒性进行评估,使用的细胞株为人正常表皮成纤维细胞。具体实验步骤如下:[0111] (1)细胞复苏[0112] 取出液氮罐中的HSF细胞株的冻存管,并置于细胞间水浴锅中37℃快速解冻,即1min内全部融化,瓶口喷散75%酒精放至超净工作台中。将冻存管内细胞悬液转入10mL离心管内,并加入适量DMEM培养基(约3‑6mL)。转速设置为1000rpm,离心5min后倒掉上清液,加入适量DMEM完全培养基,将细胞轻轻吹打均匀,转入培养瓶内,划8字轻轻混匀细胞液后,喷洒75%酒精,放入CO2培养箱中37℃培养。细胞贴壁后按上述方法离心更换细胞培养液。[0113] (2)细胞传代[0114] 培养瓶内细胞覆盖率达到80%以上之后进行传代。将培养瓶内多余培养基倒掉;培养瓶内加入3mL的PBS,轻轻摇晃30s左右后倒掉。加入2mL的胰酶,放入培养箱内等待3min左右。显微镜下观察,细胞已经全部成圆形,轻轻拍打培养瓶底部,能够明显看到细胞分散即可。再加入4mL培养基终止消化,并用枪头轻轻吹打瓶底混均,接种在3瓶含7mL新鲜培养基的培养皿中,放回恒温箱(37℃,5%CO2)中继续培养。[0115] (3)细胞冻存[0116] 培养瓶内细胞覆盖率达到80%以上之后,并且不需要传代或实验。可将细胞按照上述PBS洗涤、胰酶消化、离心,加入1mL细胞冻存液,转入1mL冻存管内冻存,‑80℃过夜后再放置于液氮罐中保存。[0117] (4)CCK‑8法检测:[0118] 按上述方法培养至第3代后细胞,PBS洗涤、胰酶消化、离心,用2mLDMEM完全培养基重悬细胞悬液备用,密度为5×104个/mL。首先加入90μL细胞悬液于96孔板各孔内,然后放置于恒温培养箱(37℃,5%CO2)中培养12h后;向每孔中加入10μL一系列不同浓度(10、20、40、80、160、320μM)的药液,加入等体积DMEM完全培养基作为对照组。将其放回培养箱中孵育10h后,向各孔内加入分别10μLCCK‑8溶液,于培养箱中继续培养2h,使用多功能酶标仪测定其OD450值。每组设置三个平行组,空白组为只含有DMEM完全培养基和CCK‑8溶液;阳性对照孔中内不加药液,加入等体积DMEM完全培养基。候选抑制剂对于细胞的抑制率计算公式:[0119][0120] 实验中数据均进行多次重复试验,使用GraphPadPrism9.0软件进行数据统计学分析,当差异显著时P<0.05,表示差异有显著性统计学意义。(P<0.05,标记“*”;0.05
[0121] 实验结果:[0122] 1)生长曲线[0123] 采用酶标仪在波长为OD600nm下测定鲍曼不动杆菌和多重耐药鲍曼不动杆菌的生长曲线。实验结果如图4所示,2株菌株生长趋势基本一致,其中1~3h为生长延缓期,4h后进入对数生长期。实验通常采用生长对数期的菌液,以确保实验结果的可靠性。因此,本研究选用培养12‑16h后的菌液的菌液进行后续实验研究。[0124] 2)最小抑菌浓度[0125] 采用微量稀释法定量测定候选化合物ChemDivL676‑1461对鲍曼不动杆菌和多重耐药鲍曼不动杆菌的MIC值,结果如表4所示。CCCP对2菌株的MIC值为320μM,ChemDivL676‑1461对2菌株的MIC值为640μM,确定了该化合物的工作浓度为160μM,CCCP的工作浓度为80μM。同时采用药敏纸片法评估候选化合物ChemDivL676‑1461的药物敏感性,结果如图5所示。3倍工作浓度下,图5中ChemDivL676‑2179,ChemDivL676‑1461和Chembridge53717615均没有产生明显的抑菌圈,这满足外排泵抑制剂的要求。因此。[0126] 表4最小抑菌浓度测定结果[0127][0128] 3)外排泵抑制实验[0129] 选择具有不同作用机制的7种抗生素亚胺培南、头孢拉啶、左氧氟沙星、阿米卡星、阿奇霉素、四环素和庆大霉素与化合物ChemDivL676‑1461进行外排抑制实验测定,其结果见表5。对于鲍曼不动杆菌,候选化合物与左氧氟沙星、阿米卡星、阿奇霉素、四环素和庆大霉素联合外排表现型均为阳性,而与亚胺培南和头孢拉啶外排表现型均为阴性。对于多重耐药鲍曼不动杆菌,阿米卡星:ChemDivL676‑1461对多重耐药菌株外排表现型为阳性;四环素、阿奇霉素和庆大霉素:ChemDivL676‑1461对多重耐药菌株外排表现型均为阳性,且都远优于对照组CCCP。综上所述,候选化合物ChemDivL676‑1461对不同耐药机制的抗生素均表现出不同程度的外排效果,优于对照组CCCP。[0130] 表5候选化合物对鲍曼敏感菌株和多重耐药菌株的外排抑制的活性测定[0131][0132][0133] 注:IPM:Imipenem,RAD:Cephradine,LEV:Levofloxacin,AMK:Amikacin,TC:Tetracycline,[0134] AZM:Azithromycin,andGM:gentamicin[0135] 4)细胞毒性[0136] 采用CCK‑8法探究3种候选化合物对正常细胞的毒性作用,细胞株采用人正常表皮成纤维细胞,研究结果如图6所示。从整体上看,随着化合物浓度的增加,细胞抑制作用也呈现出上升的趋势。化合物ChemDivL676‑2179和ChemDivL676‑1461在低浓度下(10~40μM)细胞存活率约大于70%,表明该浓度下化合物的细胞毒性较小,优于对照组CCCP;在高浓度160μM时,细胞存活率为10%~30%之间,表现出与CCCP相当的毒性作用,此浓度下,对照组CCCP的细胞存活率37.85%。Chembridge53717615在低浓度10和20μM时具有促进细胞增殖的作用;而在高浓度160μM时细胞存活率仍在80%以上,表明其对细胞的生长影响较小,药物安全性较高。[0137] 本发明不局限于上述实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
专利地区:重庆
专利申请日期:2023-07-10
专利公开日期:2024-09-03
专利公告号:CN116763790B