一种高选择性灵敏检测一氧化碳的荧光探针、制备方法与应用

专利名称：一种高选择性灵敏检测一氧化碳的荧光探针、制备方法与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211419407.9

专利申请（专利权）人：济南大学
权利人地址：山东省济南市市中区南辛庄西路336号

专利发明（设计）人：方一堃,曲乐扬,谢珂珂,李明珠,孙伟敏,荣晓迪,柳彩云,白健,朱宝存

专利摘要：本发明涉及一种高选择性的一氧化碳荧光探针，以此提供一种有效简便的检测一氧化碳的方法。具体地，本发明的探针为一种罗丹明类化合物，其可作为一氧化碳荧光探针用于对一氧化碳的检测。这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：高选择性地识别一氧化碳；具有较强的抗干扰能力；可以实现对一氧化碳的灵敏性检测；能够准确的对一氧化碳进行定量分析；性质稳定；能够长期保存使用；还可用于生物体和细胞中一氧化碳的检测。

主权利要求：
1.一种用于测量、检测或筛选一氧化碳的荧光探针，其特征在于：化学结构式为：。
2.一种制备权利要求1所述荧光探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2,6‑二羟基萘和4‑二乙氨基酮酸加入到三氟乙酸中，加热回流反应，反应结束后，得产物，将产物与氯丙烯加入到乙腈中，然后回流反应，反应结束后，减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和甲醇的混合体系进行柱色谱分离，得到纯净的荧光探针化合物。
3.一种用于测量、检测或筛选一氧化碳的荧光探针组合物，其包含权利要求1所述荧光探针。
4.如权利要求3所述荧光探针组合物，其特征在于，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、缓冲溶液或其组合。
5.一种用于检测样品中一氧化碳的存在或测定样品中的一氧化碳含量的方法，所述方法为非疾病诊断和治疗目的，其包括：a)使权利要求1所述的荧光探针与样品接触以形成荧光化合物；
b）测定所述荧光化合物的荧光性质。
6.如权利要求5所述方法，所述样品是水样品、化学样品或生物样品。
7.根据权利要求1所述荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针制备应用于检测生物体内一氧化碳的存在或测定生物体内一氧化碳含量的试剂。
8.权利要求1所述荧光探针在细胞荧光成像的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的应用。
9.一种用于测量、检测或筛选一氧化碳的试剂盒，其包含权利要求1所述荧光探针。 说明书 : 一种高选择性灵敏检测一氧化碳的荧光探针、制备方法与
应用技术领域[0001] 本发明涉及罗丹明类化合物作为一氧化碳荧光探针，能够对一氧化碳快速响应特异性识别，或者其可测定样品中一氧化碳在的浓度，并同时可用于细内一氧化碳的检测；本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。背景技术[0002] 在环境中，一氧化碳(CO)是由于煤、石油、汽车尾气等含碳物质不完全燃烧产生的，是一种无色、无臭、无刺激性的有毒气体。其几乎不溶于水，而且在空气中不易与其他物质产生化学反应，故可在空气中停留2～3年之久。因其具有较强的毒性，所以被称之为沉默的杀手。长期暴露于一氧化碳的环境中可能对中枢神经系统产生显著的影响，从而导致抑郁和记忆缺失。而当环境中CO处于低浓度时也会引起头痛和眩晕的症状。同时，CO是可以在人体内产生，是生物体内重要的信号分子，在许多生理和病理过程中扮演着重要的角色。内源性异常的CO代谢会导致许多疾病的发生，比如老年痴呆症、高血压、炎症、心力衰竭等等。发展能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测一氧化碳的分析方法是极其重要和有意义的。[0003] 近年来，已报到道的检测一氧化碳的方法有分光光度比色法、高效液相色谱法、化学发光分析法、荧光探针分析法等，其中荧光探针因其高选择、超灵敏、合成简单等独特的优势而成为研究者关注的焦点。目前已报道的荧光探针分析方法仍存在一定的缺陷，例如灵敏度低、选择性差、合成复杂等，生命体内的其他化合物的存在可能会对一氧化碳的检测构成潜在干扰，并且生理环境中的一氧化碳的含量较低。因此，发展高选择性高灵敏度的荧光探针成为急需研究的课题。发明内容[0004] 本领域急需制备一种合成简单的高选择超灵敏的一氧化碳荧光探针，从而能够有效检测一氧化碳。为此，本发明合成了一类新颖的一氧化碳荧光探针，其合成简单、选择性好、灵敏度高、响应迅速、能够特异性识别一氧化碳。具体而言，本发明提供了一种一氧化碳荧光探针，其为罗丹明类化合物式(Ⅰ)，其结构如下：[0005][0006] 其中：R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10可以相同或不同。[0007] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明的荧光探针是R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10均为氢原子的式(Ⅱ)化合物，其结构式如下：[0008][0009] 本发明还提供了式(Ⅱ)化合物的制备方法，具体制备步骤如下：[0010] 第一步：2,6‑二羟基萘和4‑二乙氨基酮酸加入到三氟乙酸中，加热回流反应，反应结束后，得产物。[0011] 第二步：将第一步反应产物与氯丙烯加入到乙腈中，然后回流反应，反应结束后，减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和甲醇的混合体系进行柱色谱分离，得到纯净的荧光探针化合物。[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，第一步反应温度是90℃，反应时间6小时，2,6‑二羟基萘和4‑二乙氨基酮酸的摩尔比为1:1。[0013] 在本发明的一些具体实施方案中，第二步反应温度为85℃，反应时间是8h，第一步反应产物与氯丙烯的摩尔比是1:2至1:4.[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，第二步反应中第一步反应产物与氯丙烯的摩尔比是1:3。[0015] 本发明还提供了一种用于测量、检测或筛选一氧化碳的荧光探针组合物，其包含式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针。[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。[0017] 本发明还提供了一种用于检测样品中一氧化碳的存在或测定样品中的一氧化碳含量的方法，其包括：[0018] a)使式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针与样品接触以形成荧光化合物；[0019] b)测定所述荧光化合物的荧光性质。[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是水样品、化学样品或生物样品。[0021] 本发明还提供了式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针的应用，所述荧光探针制备应用于检测生物体内一氧化碳的存在或测定生物体内一氧化碳含量的试剂。[0022] 本发明还提供了式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针在细胞荧光成像的应用。[0023] 本发明还提供了用于检测样本中一氧化碳浓度的试剂盒，其包含式(Ⅰ)或式(Ⅱ)荧光探针。[0024] 本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：[0025] (1)响应时间短，灵敏度高[0026] 本发明的荧光探针与一氧化碳反应灵敏，检出限低至37nM，反应快速，20分钟荧光强度值达到最大并保持不变，从而可以实现对一氧化碳的快速检测，尤其是可用于生物体内一氧化碳的检测。[0027] (2)选择性高，抗干扰能力强[0028] 本发明的荧光探针可选择性的与一氧化碳特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他金属离子和生物体内的其他常见氨基酸等成分，本发明荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。[0029] (4)可生理水平条件下应用[0030] 本发明的荧光探针，可以检测、筛选或测量生物体内的一氧化碳，也可以应用于活细胞荧光成像。[0031] (5)稳定性好[0032] 本发明的一氧化碳荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。[0033] (6)合成简单[0034] 本发明的一氧化碳荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。附图说明[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0036] 图1是探针(5μM)加入一氧化碳(0‑70μM)前后的荧光光谱；[0037] 图2是探针(5μM)在630nm处的荧光强度和一氧化碳(0‑0.1μM)的线性关系图；[0038] 图3是探针(5μM)对一氧化碳(70μM)在630nm处的时间动力学谱；[0039] 图4是一氧化碳(70μM)与其他不同离子分析物对探针(5μM)的荧光强度的影响；[0040] 图5是在不同离子分析物存在下探针(5μM)对一氧化碳(70μM)识别后的荧光强度；[0041] 图6是探针(5μM)在HeLa细胞中对一氧化碳的荧光显微成像(如a部分所示)以及相对荧光强度数据(如b所示)。具体实施方式[0042] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。[0043] 实施例1式(Ⅱ)化合物的合成[0044] 具体操作步骤如下：[0045] 实施方案1：[0046] 第一步：摩尔比为1:1的2,6‑二羟基萘和4‑二乙氨基酮酸加入到三氟乙酸中，90℃加热回流反应16小时，反应结束后，得产物2835mg。[0047] 第二步：将438mg(1mmol)第一步反应产物与76mg(1mmol)氯丙烯加入到乙腈中，然后回流反应8小时，反应结束后，减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和甲醇的混合体系(v/v,60:1)进行柱色谱分离，得到红色纯净的荧光探针化合物181mg，第二步反应产率为38％。[0048] 实施方案2：[0049] 第一步：摩尔比为1:1的2,6‑二羟基萘和4‑二乙氨基酮酸加入到三氟乙酸中，90℃加热回流反应16小时，反应结束后，得产物2835mg。[0050] 第二步：将438mg(1mmol)第一步反应产物与152mg(2mmol)氯丙烯加入到乙腈中，然后回流反应16小时，反应结束后，减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和甲醇的混合体系(v/v,60:1)进行柱色谱分离，得到红色纯净的荧光探针化合物200mg，第二步反应产率为42％。[0051] 实施方案3：[0052] 第一步：摩尔比为1:1的2,6‑二羟基萘和4‑二乙氨基酮酸加入到三氟乙酸中，90℃加热回流反应16小时，反应结束后，得产物2835mg。[0053] 第二步：将438mg(1mmol)第一步反应产物与228mg(3mmol)氯丙烯加入到乙腈中，然后回流反应4小时，反应结束后，减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和甲醇的混合体系(v/v,60:1)进行柱色谱分离，得到红色纯净的荧光探针化合物186mg，第二步反应产率为39％。[0054] 实施方案4：[0055] 第一步：摩尔比为1:1的2,6‑二羟基萘和4‑二乙氨基酮酸加入到三氟乙酸中，90℃加热回流反应16小时，反应结束后，得产物2835mg。[0056] 第二步：将438mg(1mmol)第一步反应产物与228mg(3mmol)氯丙烯加入到乙腈中，然后回流反应8小时，反应结束后，减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和甲醇的混合体系(v/v,60:1)进行柱色谱分离，得到红色纯净的荧光探针化合物230mg，第二步反应产率为48％。[0057] 实施例1制备的化合物产品结构表征：1HNMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):1.208(t,J＝7.2Hz,6H),3.383‑3.418(m,4H),4.667(d,J＝5.4Hz,2H),5.335(d,J＝9.6Hz,1H),5.479(d,J＝18.6Hz,1H),6.092‑6.156(m,1H),6.418(d,J＝7.8Hz,1H),6.639(d,J＝15Hz,2H),6.716(d,J＝8.4Hz,1H),7.108(d,J＝1.8Hz,1H),7.168(d,J＝7.2Hz,1H),7.300(d,J＝139Hz,2H),7.589‑7.648(m,2H),8.041(d,J＝7.2Hz,1H),8.517(d,J＝9Hz,1H). CNMR(200MHz,CDCl3)δ(ppm):12.56,44.50,68.87,97.72,107.24,108.78,110.93,118.02,118.91,119.04,121.96,124.07,124.11,124.86,127.17,128.96,129.43,132.90,134.80,+ +135.87,147.66,152.57,153.74,158.03,169.84.HRMS(ESI):CalcdforC31H28NO4 [M]478.2013；Found,478.2018.[0058] 实施例2：测试荧光探针对于一氧化碳的浓度梯度[0059] 配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的一氧化碳(0‑70μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在纯水(10mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图1和图2所示。[0060] 从图1可以清晰的看出，随着一氧化碳浓度的增加，630nm处的荧光强度逐渐增强。并且，由图2可以看出探针(5μM)加入一氧化碳(0‑0.1μM)之后，其630nm处的荧光强度的与一氧化碳浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对一氧化碳进行定量分析。[0061] 实施例3：测试荧光探针的时间动力学[0062] 配制一个探针浓度为5μM的10mL的测试体系，然后将70μM的一氧化碳加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在纯水(10mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图3所示。[0063] 由图3可以清楚地看到，当一氧化碳加入后，630nm处荧光强度在20分钟达到最大值并保持不变，这说明该探针与一氧化碳反应快速，能够为一氧化碳的测定提供快速的分析方法。[0064] 实施例4：测试荧光探针的选择性[0065] 配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、钙离子、钠离子、钾离子、镁离子、亚铁离子、锌离子、铝离子、氯离子、溴离子、碘离子、碳酸氢根离子、亚硫酸根离子、硫氢根离子、硝酸根离子、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸、组氨酸、缬氨酸、半胱氨酸(300μM)、同型半胱氨酸(300μM)、谷胱甘肽(300μM)、一氧化氮、超氧化钾、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、过氧化氢、羟基自由基、次氯酸钠、一氧化碳，除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在纯水(10mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图4所示。[0066] 从图4可以清晰的看出，只有一氧化碳加入的时候才能引起探针荧光强度的强烈变化，而其他分析物的影响几乎可以忽略不计。实验证明，该探针对一氧化碳具有较高的选择性，有利于对一氧化碳的检测分析。[0067] 实施例5：测试荧光探针的抗干扰性能[0068] 配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、钙离子、钠离子、钾离子、镁离子、亚铁离子、锌离子、铝离子、氯离子、溴离子、碘离子、碳酸氢根离子、亚硫酸根离子、硫氢根离子、硝酸根离子、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、脯氨酸、组氨酸、缬氨酸、空白，除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μM)，摇晃均匀后，除了第一个空白组外，其他组分别加入一氧化碳(浓度为70μM)，摇晃均匀后，用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在纯水(10mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图5所示。[0069] 从图5可以清晰的看出，其他金属离子加入对荧光探针检测一氧化碳几乎没有干扰，实验证明，该探针对一氧化碳具有较高的抗干扰能力，有利于对一氧化碳的检测分析。[0070] 实施例6：荧光探针对HeLa细胞中一氧化碳的荧光显微成像[0071] 将HeLa细胞分成三组，先对一组不加探荧光探针的HeLa细胞成像，成像结果如图6中A所示；然后再向细胞中孵育探针(10μM)20分钟，然后细胞成像，成像结果如图6中B所示；再向细胞中孵育探针(10μM)和PdCl2(10μM)20分钟，然后细胞成像，成像结果如图6中C所示。对另一组细胞孵育探针20分钟后，再加入20μM一氧化碳孵育30分钟，然后细胞成像，成像结果如图6中D所示；对另一组细胞孵育探针20分钟后，再加入30μM一氧化碳孵育30分钟，然后细胞成像，成像结果如图6中E所示。通过计算红色通道的荧光强度，可以看出探针对细胞内的一氧化碳有良好的的荧光成像效果。[0072] 从图6可以看出，探针本底荧光强度较低，随着一氧化碳浓度的增强，荧光强度也随之增强，实验结果证明，该探针可以检测HeLa细胞中的一氧化碳。[0073] 虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

专利地区：山东

专利申请日期：2022-11-14

专利公开日期：2024-09-03

专利公告号：CN115894426B