专利名称:鸡内金UPLC特征图谱的构建方法、应用
专利类型:实用新型专利
专利申请号:CN202211398371.0
专利申请(专利权)人:广东一方制药有限公司
权利人地址:广东省佛山市南海区里水镇旗峰工业开发区
专利发明(设计)人:邱韵静,李国卫,童培珍,庞伟,邢菊玲,刘潇晗,杨晓东,何嘉莹,索彩仙,孙冬梅,陈向东
专利摘要:本申请涉及一种鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,包括如下步骤:制备参照物溶液,包括制备鸡内金对照药材参照物溶液以及制备对照品参照物溶液,所述对照品包括吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素;制备鸡内金样品的供试品溶液,所述鸡内金样品为鸡内金药材、鸡内金标准汤剂或鸡内金配方颗粒;将所述参照物溶液、所述鸡内金样品的供试品溶液通过超高效液相色谱进行检测。上述方法可用于区别鉴定鸡内金与家鸡的其它不同部位或其他禽类伪品。
主权利要求:
1.一种鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:制备参照物溶液,包括制备鸡内金对照药材参照物溶液以及制备对照品参照物溶液,所述对照品包括吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素;
制备鸡内金样品的供试品溶液,包括:称取所述鸡内金样品,加入醇类溶剂加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解;所述鸡内金样品为鸡内金药材、鸡内金标准汤剂或鸡内金配方颗粒;将所述参照物溶液、所述鸡内金样品的供试品溶液通过超高效液相色谱进行检测;
所述超高效液相色谱进行检测的色谱条件包括:
(1)流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为体积比(4~5):1的乙腈和水,所述流动相B为体积分数0.05%~0.15%的磷酸水溶液;洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱的程序包括:
0分钟~13分钟,所述流动相A的体积百分比由14%上升至16%,所述流动相B的体积百分比由86%下降至84%,
13分钟~18分钟,所述流动相A的体积百分比由16%上升至23%,所述流动相B的体积百分比由84%下降至77%,
18分钟~29分钟,所述流动相A的体积百分比由23%上升至27%,所述流动相B的体积百分比由77%下降至73%,
29分钟~33分钟,所述流动相A的体积百分比由27%上升至37%,所述流动相B的体积百分比由73%下降至63%,
33分钟~37分钟,所述流动相A的体积百分比由37%上升至60%,所述流动相B的体积百分比由63%下降至40%,
37分钟~50分钟,所述流动相A的体积百分比由60%上升至90%,所述流动相B的体积百分比由40%下降至10%;和(2)色谱柱选自C18色谱柱。
2.根据权利要求1所述的鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,其特征在于,所述磷酸水溶液体积分数为0.1%。
3.根据权利要求1所述的鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,其特征在于,所述鸡内金对照药材参照物溶液的制备包括如下步骤:称取鸡内金对照药材,加入甲醇加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。
4.根据权利要求1所述的鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,其特征在于,所述对照品参照物溶液的制备包括如下步骤:分别精密称定各所述对照品,加入甲醇制成含有各所述对照品的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,其特征在于,通过超高效液相色谱进行检测的色谱条件满足以下条件中的至少一个:(1)流速为每分钟0.2ml~0.4ml;
(2)柱温为28℃~32℃;
(3)检测波长为250nm~270nm;
(4)进样体积为1μl~2μl。
6.根据权利要求1~5任一项所述的鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,其特征在于,所述特征图谱包括9个特征峰,其中包括吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素的特征峰。
7.一种区分鸡内金与家鸡的其它不同部位或其他禽类伪品的方法,其特征在于,包括如下步骤:制备鸡内金对照药材参照物溶液;
制备待测样品的供试品溶液,包括:称取所述待测样品,加入醇类溶剂加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解;所述待测样品为鸡内金、家鸡的其它不同部位的伪品或其他禽类伪品;
将所述鸡内金对照药材参照物溶液、所述待测样品的供试品溶液通过超高效液相色谱进行检测;
所述超高效液相色谱进行检测的色谱条件包括:
(1)流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为体积比(4~5):1的乙腈和水,所述流动相B为体积分数0.05%~0.15%的磷酸水溶液,洗脱方式为梯度洗脱,所述梯度洗脱的程序包括:
0分钟~13分钟,所述流动相A的体积百分比由14%上升至16%,所述流动相B的体积百分比由86%下降至84%,
13分钟~18分钟,所述流动相A的体积百分比由16%上升至23%,所述流动相B的体积百分比由84%下降至77%,
18分钟~29分钟,所述流动相A的体积百分比由23%上升至27%,所述流动相B的体积百分比由77%下降至73%,
29分钟~33分钟,所述流动相A的体积百分比由27%上升至37%,所述流动相B的体积百分比由73%下降至63%,
33分钟~37分钟,所述流动相A的体积百分比由37%上升至60%,所述流动相B的体积百分比由63%下降至40%,
37分钟~50分钟,所述流动相A的体积百分比由60%上升至90%,所述流动相B的体积百分比由40%下降至10%;
(2)色谱柱选自C18色谱柱。
8.根据权利要求7所述的区分鸡内金与家鸡的其它不同部位或其他禽类伪品的方法,其特征在于,所述磷酸水溶液体积分数为0.1%。
9.根据权利要求7所述的区分鸡内金与家鸡的其它不同部位或其他禽类伪品的方法,其特征在于,所述鸡内金对照药材参照物溶液的制备包括如下步骤:称取鸡内金对照药材,加入甲醇加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。
10.根据权利要求7~9任一项所述的区分鸡内金与家鸡的其它不同部位或其他禽类伪品的方法,其特征在于,通过超高效液相色谱进行检测的色谱条件满足以下条件中的至少一个:(1)流速为每分钟0.2ml~0.4ml;
(2)柱温为28℃~32℃;
(3)检测波长为250nm~270nm;
(4)进样体积为1μl~2μl。 说明书 : 鸡内金UPLC特征图谱的构建方法、应用技术领域[0001] 本申请涉及中药材分析检测技术领域,特别是涉及一种鸡内金UPLC特征图谱的构建方法、应用。背景技术[0002] 《中国药典》2020年版中收载了鸡内金,规定其为雉科动物家鸡GallusgallusdomesticusBrisson的干燥沙囊内壁。杀鸡后,取出鸡肫,立即剥下内壁,洗净,干燥,即得鸡内金。但《中国药典》2020年版中只记载了鸡内金的性状及浸出物、检查项,并未规定其特征图谱或其他鉴别方法,为能够全面准确地控制鸡内金药材的质量,为鸡内金配方颗粒的生产和质量控制标准规范奠定基础,有必要对其质量标准进行深入系统的研究。[0003] 据文献报道,鸡内金功效为消食运脾、固精止遗、化坚消石,多用于食积不化、消化不良、小儿疳积、肾虚遗精、遗尿、泌尿系或肝胆结石及癥瘕痞块。鸡内金主要化学成分有蛋白质、氨基酸、多糖及金属元素等,另有文献采用HPLC‑QTOF‑MS/MS的方法,发现鸡内金中含有胆酸类、核苷类及异黄酮类成分。现代药理学研究证实,鸡内金具有调节消化系统功能、血液系统功能,改善血液流变学,抑制肌瘤生长等药理作用。[0004] 经查阅与鸡内金特征图谱、含量测定有关的文献,发现相关研究多数均以核苷类成分或氨基酸类成分作为指标,该类成分在动物类中药专属性较差,无法区分鸡内金与其混伪品鸭内金、鸽内金、鹅内金,也无法区分鸡内金与家鸡的其它不同部位。发明内容[0005] 基于此,有必要提供一种可用于区分鸡内金与家鸡的其它不同部位、鸡内金伪品的鸡内金UPLC特征图谱的构建方法、应用。[0006] 本申请一实施例提供了一种鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,包括如下步骤:[0007] 制备参照物溶液,包括制备鸡内金对照药材参照物溶液以及制备对照品参照物溶液,所述对照品包括吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素;[0008] 制备鸡内金样品的供试品溶液,所述鸡内金样品为鸡内金药材、鸡内金标准汤剂或鸡内金配方颗粒;[0009] 将所述参照物溶液、所述鸡内金样品的供试品溶液通过超高效液相色谱进行检测。[0010] 在其中一个实施例中,所述鸡内金对照药材参照物溶液的制备包括如下步骤:[0011] 称取鸡内金对照药材,加入甲醇加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。[0012] 在其中一个实施例中,所述对照品参照物溶液的制备包括如下步骤:[0013] 分别精密称定各所述对照品,加入甲醇制成含有各所述对照品的混合溶液。[0014] 在其中一个实施例中,所述供试品溶液的制备包括如下步骤:[0015] 称取所述鸡内金样品,加入醇类溶剂加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。[0016] 在其中一个实施例中,通过超高效液相色谱进行检测的色谱条件满足以下条件中的至少一个:[0017] (1)色谱柱选自C18色谱柱;[0018] (2)洗脱方式为梯度洗脱;流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为体积比(4~5):1的乙腈和水,所述流动相B为体积分数0.05%~0.15%的磷酸水溶液;[0019] (3)流速为每分钟0.2ml~0.4ml;[0020] (4)柱温为28℃~32℃;[0021] (5)检测波长为250nm~270nm;[0022] (6)进样体积为1μl~2μl。[0023] 在其中一个实施例中,所述梯度洗脱的程序包括:[0024] 0分钟~13分钟,所述流动相A的体积百分比由14%上升至16%,所述流动相B的体积百分比由86%下降至84%;[0025] 13分钟~18分钟,所述流动相A的体积百分比由16%上升至23%,所述流动相B的体积百分比由84%下降至77%;[0026] 18分钟~29分钟,所述流动相A的体积百分比由23%上升至27%,所述流动相B的体积百分比由77%下降至73%;[0027] 29分钟~33分钟,所述流动相A的体积百分比由27%上升至37%,所述流动相B的体积百分比由73%下降至63%;[0028] 33分钟~37分钟,所述流动相A的体积百分比由37%上升至60%,所述流动相B的体积百分比由63%下降至40%;[0029] 37分钟~50分钟,所述流动相A的体积百分比由60%上升至90%,所述流动相B的体积百分比由40%下降至10%。[0030] 在其中一个实施例中,所述特征图谱包括9个特征峰,其中包括吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素的特征峰。[0031] 本申请一实施例还提供了一种区分鸡内金与家鸡的其它不同部位或其他禽类伪品的方法,包括如下步骤:[0032] 制备鸡内金对照药材参照物溶液;[0033] 制备待测样品的供试品溶液;所述待测样品为鸡内金、家鸡的其它不同部位的伪品或其他禽类伪品;[0034] 将所述鸡内金对照药材参照物溶液、所述待测样品的供试品溶液通过超高效液相色谱进行检测。[0035] 在其中一个实施例中,所述鸡内金对照药材参照物溶液的制备包括如下步骤:[0036] 称取鸡内金对照药材,加入甲醇加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。[0037] 在其中一个实施例中,所述供试品溶液的制备包括如下步骤:[0038] 称取所述待测样品,加入醇类溶剂加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。[0039] 在其中一个实施例中,通过超高效液相色谱进行检测的色谱条件满足以下条件中的至少一个:[0040] (1)色谱柱选自C18色谱柱;[0041] (2)洗脱方式为梯度洗脱;流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为体积比(4~5):1的乙腈和水,所述流动相B为体积分数0.05%~0.15%的磷酸水溶液;[0042] (3)流速为每分钟0.2ml~0.4ml;[0043] (4)柱温为28℃~32℃;[0044] (5)检测波长为250nm~270nm;[0045] (6)进样体积为1μl~2μl。[0046] 在其中一个实施例中,所述梯度洗脱的程序包括:[0047] 0分钟~13分钟,所述流动相A的体积百分比由14%上升至16%,所述流动相B的体积百分比由86%下降至84%;[0048] 13分钟~18分钟,所述流动相A的体积百分比由16%上升至23%,所述流动相B的体积百分比由84%下降至77%;[0049] 18分钟~29分钟,所述流动相A的体积百分比由23%上升至27%,所述流动相B的体积百分比由77%下降至73%;[0050] 29分钟~33分钟,所述流动相A的体积百分比由27%上升至37%,所述流动相B的体积百分比由73%下降至63%;[0051] 33分钟~37分钟,所述流动相A的体积百分比由37%上升至60%,所述流动相B的体积百分比由63%下降至40%;[0052] 37分钟~50分钟,所述流动相A的体积百分比由60%上升至90%,所述流动相B的体积百分比由40%下降至10%。[0053] 上述鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,可以得到9个特征峰并指认其中的吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素等5个异黄酮类成分的特征峰,特征峰数量多,且上述方法对鸡内金药材及其提取物均可适用,能够较为特征性且全面性地反映鸡内金药材及其提取物等鸡内金样品的质量,便于对鸡内金药材及其提取物的质量进行评价和监控,同时,该特征图谱构建方法精密度高、准确度高、稳定性好、重现性好,便于大规模推广应用。上述方法可用于区别鉴定鸡内金与家鸡的其它不同部位、以及用于区别鉴定鸡内金与鸭内金、鸽内金和鹅内金等伪品。附图说明[0054] 图1为实施例1鸡内金配方颗粒UPLC特征图谱专属性考察色谱图;[0055] 图2为实施例1鸡内金配方颗粒UPLC特征图谱重复性及中间精密度考察色谱图;[0056] 图3为实施例1鸡内金配方颗粒UPLC特征图谱不同柱温耐用性考察色谱图;[0057] 图4为实施例1鸡内金配方颗粒UPLC特征图谱不同流速耐用性考察色谱图;[0058] 图5为实施例1鸡内金配方颗粒UPLC特征图谱不同色谱柱耐用性考察色谱图;[0059] 图6为实施例1鸡内金配方颗粒UPLC特征图谱各特征峰指认光谱图;[0060] 图7为实施例1不同批次鸡内金配方颗粒UPLC特征图谱叠加色谱图;[0061] 图8为实施例1不同批次鸡内金药材UPLC特征图谱叠加色谱图;[0062] 图9为实施例1不同批次鸡内金标准汤剂UPLC特征图谱叠加色谱图;[0063] 图10为实施例2鸡内金对照药材与鹅内金对照药材UPLC对比色谱图;[0064] 图11为实施例2鸡内金对照药材与鸭内金对照药材UPLC对比色谱图;[0065] 图12为实施例2鸡内金对照药材与鸽内金对照药材UPLC对比色谱图;[0066] 图13为实施例3鸡内金对照药材与家鸡的其它不同部位UPLC对比色谱图;[0067] 图14为对比例1鸡内金对照药材与家鸡的其它不同部位氨基酸UPLC特征图谱对比色谱图。具体实施方式[0068] 为了便于理解本申请,下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的较佳实施例。但是,本申请可以以许多不同的形式来实现,并不限于本申请所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。[0069] 除非另有定义,本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请。本申请所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。[0070] 本申请中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。[0071] 本申请一实施例提供了一种鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,包括如下步骤:[0072] 制备参照物溶液,包括制备鸡内金对照药材参照物溶液以及制备对照品参照物溶液,对照品包括吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素;[0073] 制备鸡内金样品的供试品溶液,鸡内金样品为鸡内金药材、鸡内金标准汤剂或鸡内金配方颗粒;[0074] 将参照物溶液、鸡内金样品的供试品溶液通过超高效液相色谱进行检测。[0075] 上述鸡内金UPLC特征图谱的构建方法,可以得到9个特征峰并指认其中的吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素等5个异黄酮类成分特征峰,特征峰数量多,且上述以异黄酮类成分作为特征峰的特征图谱构建方法对鸡内金药材及其提取物均可适用,能够较为特征性且全面性地反映鸡内金药材及其提取物的质量,便于对鸡内金药材及其提取物的质量进行评价和监控,同时,该特征图谱构建方法精密度高、准确度高、稳定性好、重现性好,便于大规模推广应用。[0076] 在其中一个实施方式中,鸡内金对照药材参照物溶液的制备包括如下步骤:[0077] 称取鸡内金对照药材,加入甲醇加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。[0078] 在其中一个实施方式中,鸡内金对照药材参照物溶液的制备包括如下步骤:[0079] 称取鸡内金对照药材1.8g~2.2g,加入甲醇40ml~60ml,加热回流25分钟~35分钟,放冷,摇匀,滤过,蒸干,加水溶解并定容至5ml~10ml,加入乙酸乙酯萃取1次~3次,萃取时每次加入的乙酸乙酯为18ml~22ml,收集乙酸乙酯层萃取产物,蒸干,用甲醇溶解并定容至5ml~10ml。[0080] 在其中一个实施例方式中,鸡内金对照药材参照物溶液的制备包括如下步骤:[0081] 称取鸡内金对照药材2g,加入甲醇50ml,加热回流30分钟,放冷,摇匀,滤过,蒸干,加水溶解并定容至10ml,加入乙酸乙酯萃取2次,萃取时每次加入的乙酸乙酯为20ml,收集乙酸乙酯层萃取产物,蒸干,用甲醇溶解并定容至5ml。[0082] 在其中一个实施方式中,对照品参照物溶液的制备包括如下步骤:[0083] 分别精密称定各对照品,加入甲醇制成含有各对照品的混合溶液。[0084] 在其中一个实施方式中,对照品参照物溶液中每1ml甲醇含各对照品23μg~27μg。[0085] 在其中一个实施方式中,对照品参照物溶液中每1ml甲醇含各对照品25μg。[0086] 在其中一个实施方式中,供试品溶液的制备包括如下步骤:[0087] 称取鸡内金样品,加入醇类溶剂加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。[0088] 在其中一个实施方式中,供试品溶液的制备包括如下步骤:[0089] 称取鸡内金样品,加入醇类溶剂40ml~60ml,加热回流25分钟~35分钟,放冷,摇匀,滤过,蒸干,加水溶解并定容至5ml~10ml,加入乙酸乙酯萃取1次~3次,萃取时每次加入的乙酸乙酯为18ml~22ml,收集乙酸乙酯层萃取产物,蒸干,用甲醇溶解并定容至5ml~10ml。[0090] 在其中一个实施方式中,供试品溶液的制备包括如下步骤:[0091] 称取鸡内金样品,加入醇类溶剂50ml,加热回流30分钟,放冷,摇匀,滤过,蒸干,加水溶解并定容至10ml,加入乙酸乙酯萃取2次,萃取时每次加入的乙酸乙酯为20ml,收集乙酸乙酯层萃取产物,蒸干,用甲醇溶解并定容至5ml。[0092] 可选地,鸡内金样品选自鸡内金药材,称取鸡内金样品1.8g~2.2g。进一步地,鸡内金样品选自鸡内金药材,称取鸡内金样品2g。[0093] 可选地,鸡内金样品选自鸡内金药材,醇类溶剂选自甲醇。[0094] 可选地,鸡内金样品选自鸡内金标准汤剂,称取鸡内金样品0.1g~0.5g。进一步地,鸡内金样品选自鸡内金标准汤剂,称取鸡内金样品0.3g。[0095] 可选地,鸡内金样品选自鸡内金标准汤剂,醇类溶剂选自甲醇。[0096] 可选地,鸡内金样品选自鸡内金配方颗粒,称取鸡内金样品0.8g~1.2g。进一步地,鸡内金样品选自鸡内金配方颗粒,称取鸡内金样品1g。[0097] 可选地,鸡内金样品选自鸡内金配方颗粒,醇类溶剂选自体积分数40%~60%的乙醇。进一步地,鸡内金样品选自鸡内金配方颗粒,醇类溶剂选自体积分数50%的乙醇。[0098] 在其中一个实施方式中,通过超高效液相色谱进行检测的色谱条件满足以下条件中的至少一个:[0099] (1)色谱柱选自C18色谱柱。[0100] 进一步地,色谱柱选自AgilentZorbaxSBC18色谱柱、WatersHSST3色谱柱或AgilentEcilpsePlusC18色谱柱。优选地,色谱柱选自AgilentZorbaxSBC18色谱柱。进一步优选地,色谱柱选自AgilentZorbaxSBC18色谱柱,柱长为100mm,内径为2.1mm,粒径为1.8μm。[0101] (2)洗脱方式为梯度洗脱;流动相包括流动相A和流动相B,流动相A为体积比(4~5):1的乙腈和水,流动相B为体积分数0.05%~0.15%的磷酸水溶液。[0102] 进一步地,梯度洗脱例如可以的程序包括:[0103] 0分钟~13分钟,流动相A的体积百分比由14%上升至16%,流动相B的体积百分比由86%下降至84%;[0104] 13分钟~18分钟,流动相A的体积百分比由16%上升至23%,流动相B的体积百分比由84%下降至77%;[0105] 18分钟~29分钟,流动相A的体积百分比由23%上升至27%,流动相B的体积百分比由77%下降至73%;[0106] 29分钟~33分钟,流动相A的体积百分比由27%上升至37%,流动相B的体积百分比由73%下降至63%;[0107] 33分钟~37分钟,流动相A的体积百分比由37%上升至60%,流动相B的体积百分比由63%下降至40%;[0108] 37分钟~50分钟,流动相A的体积百分比由60%上升至90%,流动相B的体积百分比由40%下降至10%。[0109] 进一步地,流动相A中乙腈和水的体积比例如可以但不限于是4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1、5:1等等。优选地,流动相A中乙腈和水的体积比为4:1。[0110] 进一步地,流动相B中磷酸水溶液的体积分数例如可以但不限于是0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%等等。优选地,流动相B中磷酸水溶液的体积分数为0.1%。[0111] (3)流速为每分钟0.2ml~0.4ml。[0112] 进一步地,流速例如可以但不限于是每分钟0.2ml、0.25ml、0.3ml、0.35ml、0.4ml等等。优选地,流速为每分钟0.3ml。[0113] (4)柱温为28℃~32℃。[0114] 进一步地,柱温例如可以但不限于是28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等等。优选地,柱温为30℃。[0115] (5)检测波长为250nm~270nm。[0116] 进一步地,检测波长例如可以但不限于是250nm、255nm、260nm、265nm、270nm等等。优选地,检测波长为260nm。[0117] (6)进样体积为1μl~2μl。[0118] 进一步地,进样体积例如可以但不限于是1μl、1.2μl、1.4μl、1.6μl、1.8μl、2μl。[0119] 进一步地,参照物溶液的进样体积为1μl。[0120] 进一步地,鸡内金样品选自鸡内金药材,鸡内金样品溶液的进样体积为2μl。[0121] 进一步地,鸡内金样品选自鸡内金标准汤剂,鸡内金样品溶液的进样体积为2μl。[0122] 进一步地,鸡内金样品选自鸡内金配方颗粒,鸡内金样品溶液的进样体积为1μl。[0123] 在其中一个实施方式中,特征图谱包括9个特征峰,其中包括吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素的特征峰。[0124] 本申请一实施方式还提供了一种区分鸡内金与家鸡的其它不同部位或其他禽类伪品的方法,包括如下步骤:[0125] 制备鸡内金对照药材参照物溶液;[0126] 制备待测样品的供试品溶液;待测样品为鸡内金、家鸡的其它不同部位的伪品或其他禽类伪品;[0127] 将鸡内金对照药材参照物溶液、待测样品的供试品溶液通过超高效液相色谱进行检测。[0128] 在其中一个实施方式中,其他禽类伪品包括鸭内金、鸽内金以及鹅内金中的一种或几种。[0129] 在其中一个实施方式中,鸡内金对照药材参照物溶液的制备包括如下步骤:[0130] 称取鸡内金对照药材,加入甲醇加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。[0131] 在其中一个实施方式中,供试品溶液的制备包括如下步骤:[0132] 称取所述待测样品,加入醇类溶剂加热回流提取,将提取液蒸干后加水溶解,采用乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯层萃取物,蒸干,用甲醇溶解。[0133] 在其中一个实施方式中,通过超高效液相色谱进行检测的色谱条件满足以下条件中的至少一个:[0134] (1)色谱柱选自C18色谱柱;[0135] (2)洗脱方式为梯度洗脱;流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为体积比(4~5):1的乙腈和水,所述流动相B为体积分数0.05%~0.15%的磷酸水溶液;[0136] (3)流速为每分钟0.2ml~0.4ml;[0137] (4)柱温为28℃~32℃;[0138] (5)检测波长为250nm~270nm;[0139] (6)进样体积为1μl~2μl。[0140] 在其中一个实施方式中,所述梯度洗脱的程序包括:[0141] 0分钟~13分钟,所述流动相A的体积百分比由14%上升至16%,所述流动相B的体积百分比由86%下降至84%;[0142] 13分钟~18分钟,所述流动相A的体积百分比由16%上升至23%,所述流动相B的体积百分比由84%下降至77%;[0143] 18分钟~29分钟,所述流动相A的体积百分比由23%上升至27%,所述流动相B的体积百分比由77%下降至73%;[0144] 29分钟~33分钟,所述流动相A的体积百分比由27%上升至37%,所述流动相B的体积百分比由73%下降至63%;[0145] 33分钟~37分钟,所述流动相A的体积百分比由37%上升至60%,所述流动相B的体积百分比由63%下降至40%;[0146] 37分钟~50分钟,所述流动相A的体积百分比由60%上升至90%,所述流动相B的体积百分比由40%下降至10%。[0147] 上述鸡内金UPLC特征图谱的构建方法主要检测鸡内金中的异黄酮类成分,异黄酮属于黄酮类化合物,黄酮类化合物可以调节人体肠道菌群,可以对健康产生积极的影响,黄酮类物质能够在抑制有害菌(肠杆菌、链球菌等)的同时增加双歧杆菌等益生菌的丰度,有利于改善炎症性肠病,且异黄酮苷元及其代谢物可以调整肠道中的一些关键微生物种类,能够发挥益生作用。因此,鸡内金中异黄酮类成分与其调节消化系统功能的药理作用一致,本申请所建立的UPLC特征图谱以鸡内金中异黄酮类成分作为主要特征峰谱,针对鸡内金药材、标准汤剂及其配方颗粒等不同的药材及其提取物均适用,能够较为特征性和全面性地反映鸡内金药材及其提取物的质量,便于对鸡内金药材及其提取物的质量进行评价和监控。同时,上述特征图谱的构建方法具有9个峰,且能够指认其中5个特征峰,准确度高,且上述方法精密度高、稳定性好、重现性好,便于大规模推广应用。[0148] 以下通过具体实施例对本申请的鸡内金UPLC特征图谱的构建方法、应用作进一步详细的说明。[0149] 实施例1[0150] 1.仪器、试剂与试药[0151] 仪器:WatersH‑class超高效液相色谱仪(沃特世公司),ThermoVanquish超高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司),AgilentZorbaxSBC18(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱,WatersHSST3(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱,AgilentEcilpsePlusC18(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱,万分之一天平(ME204E,梅特勒‑托利多公司),百万分之一天平(XP26,梅特勒‑托利多公司),数控超声波清洗器(KQ500D,昆山市超声仪器有限公司),恒温水浴锅(HWS28型,上海一恒科技有限公司),电热恒温鼓风干燥箱(DHG‑9146A,精宏仪器公司),超纯水系统(Milli‑QDirect,默克股份有限公司)。[0152] 试剂:乙酸乙酯(西陇科学股份有限公司)、甲醇(西陇科学股份有限公司)、乙醇(西陇科学股份有限公司)为分析纯;磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、乙腈(默克股份有限公司)为UPLC色谱级,水为超纯水(实验室自制)。[0153] 试药:染料木苷(批号:111709‑201702,含量:99.9%,中国食品药品检定研究院);染料木素(批号:111704‑201703,含量:99.5%,中国食品药品检定研究院);大豆苷元(批号:111502‑202003,含量:99.3%,中国食品药品检定研究院);黄豆黄素(批号:ST03980120,含量:98.0%,上海诗丹德标准技术服务有限公司);吲哚‑3‑甲醛(批号:ST58860120,含量:98.0%,上海诗丹德标准技术服务有限公司);鸡内金对照药材(批号:121153‑202003,中国食品药品检定研究院);鸡内金配方颗粒(批号:KL01、KL02、KL03;来源:广东一方制药有限公司),鸡内金药材、鸡内金标准汤剂的来源信息见下表1;伪品鸭内金、鸽内金、鹅内金的来源、家鸡其他部位鸡骨、鸡肉、鸡皮、鸡胗、鸡内脏的来源信息见下表2。[0154] 表1.鸡内金药材、标准汤剂来源信息表[0155][0156] 表2.其他药材来源信息表[0157][0158][0159] 2、方法与结果[0160] 2.1参照物溶液制备[0161] 2.1.1鸡内金对照药材参照物溶液:取鸡内金对照药材2.0g,置具塞锥形瓶中,加入甲醇50ml,加热回流30分钟,放冷,摇匀,滤过,蒸干,加水溶解并定容至10ml,加20ml乙酸乙酯萃取2次,收集乙酸乙酯层,蒸干,用甲醇溶解并定容至5ml。[0162] 2.1.2对照品参照物溶液:分别取对照品吲哚‑3‑甲醛、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素适量,精密称定,加入甲醇制成每1ml含各对照品25μg的混合溶液。[0163] 2.2鸡内金样品的供试品溶液的制备[0164] 2.2.1鸡内金药材供试品溶液:称取鸡内金药材粉末(过三号筛)约2.0g,置具塞锥形瓶中,加入甲醇50ml,加热回流30分钟,放冷,摇匀,滤过,蒸干,加水溶解并定容至10ml,加20ml乙酸乙酯萃取2次,收集乙酸乙酯层溶液,蒸干,用甲醇溶解并定容至5ml,即得。[0165] 2.2.2鸡内金标准汤剂供试品溶液:取鸡内金标准汤剂适量,研细,称取约0.3g,置具塞锥形瓶中,加入甲醇50ml,加热回流30分钟,放冷,摇匀,滤过,蒸干,加水溶解并定容至10ml,加20ml乙酸乙酯萃取2次,收集乙酸乙酯层溶液,蒸干,用甲醇溶解并定容至5ml,即得。[0166] 2.2.3鸡内金配方颗粒供试品溶液:取鸡内金配方颗粒适量,研细,称取约1.0g,置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇50ml,加热回流30分钟,放冷,摇匀,滤过,蒸干,加水溶解并定容至10ml,加20ml乙酸乙酯萃取2次,收集乙酸乙酯层溶液,蒸干,用甲醇溶解并定容至5ml,即得。[0167] 2.3超高效液相色谱检测[0168] 2.3.1色谱条件[0169] 采用AgilentZorbaxSBC18(100mm×2.1mm,1.8μm)色谱柱;以乙腈‑水(4:1)为流动相A,以体积分数0.1%磷酸水溶液为流动相B,按下表3中的规定进行梯度洗脱;流速为每分钟0.3ml;柱温为30℃;检测波长为260nm;[0170] 进样量:参照物溶液的进样体积为1μl,鸡内金药材供试品溶液的进样体积为2μl,鸡内金标准汤剂供试品溶液的进样体积为2μl,鸡内金配方颗粒供试品溶液的进样体积为1μl。[0171] 表3.梯度洗脱表[0172][0173] 2.4测定方法[0174] 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液,注入超高效液相色谱仪,测定,即得。[0175] 3、方法学考察[0176] 3.1专属性考察[0177] 将空白溶液、对照品参照物溶液、鸡内金配方颗粒供试品溶液各1μl注入超高效液相色谱仪,参照2.3.1的色谱条件进行分析。[0178] 结果如图1所示,鸡内金配方颗粒供试品溶液色谱中各特征峰在与对照品参照物溶液色谱相应的保留时间处有相同的色谱峰,且阴性无干扰,说明该方法专属性良好。[0179] 3.2精密度考察[0180] 取同一批鸡内金配方颗粒(KL01),参照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,并参照“2.3.1”项下的色谱条件连续进样6次,以峰6为参照峰S,记录各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积,并计算RSD值,结果各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2%,表明仪器精密度良好。[0181] 3.3重复性考察[0182] 取同一批鸡内金配方颗粒(KL01),参照“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,并参照“2.3.1”项下的色谱条件进样测定,以峰6为参照峰S,记录各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积,并计算RSD值,结果各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%,表明该方法重复性良好。[0183] 3.4稳定性考察[0184] 取同一批鸡内金配方颗粒(KL01),参照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,分别于0,2,6,10,14,18,22小时参照“2.3.1”项下的色谱条件进样测定,以峰6为参照峰S,记录各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积,并计算RSD值,结果各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%,表明供试品溶液在22小时内稳定性良好。[0185] 3.5中间精密度考察[0186] 由不同的分析人员在不同日期于不同的仪器上操作,取同一批鸡内金配方颗粒(KL01),参照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,并参照“2.3.1”项下色谱条件进样分析,以峰6为参照峰S,记录各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积,并计算RSD值。[0187] 结果如图2所示,相对保留时间和相对峰面积与重复性试验6个数据的RSD值在均小于5.0%,说明该方法中间精密度良好。[0188] 3.6耐用性考察[0189] (1)不同柱温考察[0190] 取同一批鸡内金配方颗粒(KL01),参照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,除柱温分别为28℃、30℃和32℃外,其他色谱条件均参照“2.3.1”项下的规定,进样分析,以峰6为参照峰S,计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积,并计算RSD值。[0191] 结果如图3显示,相对保留时间和相对峰面积的RSD值在均小于3.0%,说明该方法不同柱温耐用性良好。[0192] (2)不同流速考察[0193] 取同一批鸡内金配方颗粒(KL01),参照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,除流速分别为0.28ml/min、0.30ml/min和0.32ml/min外,其他色谱条件均参照“2.3.1”项下的规定,进样分析,以峰6为参照峰S,计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积,并计算RSD值。[0194] 结果如图4显示,相对保留时间和相对峰面积的RSD值在均小于3.0%,说明该方法对不同流速耐用性良好。[0195] (3)不同色谱柱考察[0196] 取同一批鸡内金配方颗粒(KL01),参照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,除色谱柱分别为AgilentZorbaxSBC18(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱,WatersHSST3(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱,AgilentEcilpsePlusC18(2.1mm×100mm,1.8μm)外,其他色谱条件均参照“2.3.1”项下的规定,进样分析,以峰6为参照峰S,计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积,并计算RSD值。[0197] 结果如图5所示,因峰8峰面积较小不同色谱柱对其相对峰面积影响较大,除峰8外,其余峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值在均小于5.0%,说明该方法对不同色谱柱耐用性良好。[0198] 3.7特征峰的指认[0199] 取同一批鸡内金配方颗粒(KL01),参照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,参照“2.3.1”项下色谱条件分别吸取供试品溶液与对照品参照物溶液进样分析,比对特征峰的保留时间与光谱图。[0200] 结果如图6所示,确定峰5为吲哚‑3‑甲醛,峰6为染料木苷,峰7为大豆苷元,峰8为黄豆黄素,峰9为染料木素。[0201] 3.8鸡内金配方颗粒样品测定[0202] 分别取3批鸡内金配方颗粒(批号:KL01、KL02、KL03),参照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,分别精密吸取上述供试品溶液和鸡内金对照药材参照物溶液,参照“2.3.1”项下色谱条件进样测定,3批样品特征图谱叠加图如图7所示。以染料木苷色谱峰为参照峰S,计算各特征峰与S峰的相对保留时间、相对峰面积以及RSD值,计算结果见如表4~表5。[0203] 表4.3批鸡内金配方颗粒特征图谱(相对保留时间)[0204][0205][0206] 表5.3批鸡内金配方颗粒特征图谱(相对峰面积)[0207][0208] 由表4和表5可见,不同批次的鸡内金配方颗粒供试品溶液经超高效液相色谱检测,均能得到相近的特征图谱,且相对保留时间的RSD值均小于1%,表明该方法对鸡内金配方颗粒的检测结果准确度高。[0209] 3.9鸡内金药材样品测定[0210] 分别取鸡内金药材粉末(过三号筛),参照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液,分别精密吸取上述供试品溶液和鸡内金对照药材参照物溶液,参照“2.3.1”项下色谱条件进样测定,18批样品特征图谱叠加图如图8所示。以染料木苷色谱峰为参照峰S,计算各特征峰与S峰的相对保留时间、相对峰面积以及RSD值,计算结果见如表6~表7。[0211] 表6.18批鸡内金药材特征图谱(相对保留时间)[0212][0213][0214] 表7.18批鸡内金药材特征图谱(相对峰面积)[0215][0216] 由表6和表7可见,不同批次的鸡内金药材供试品溶液经超高效液相色谱检测,均能得到相近的特征图谱,且相对保留时间的RSD值均小于1%,表明该方法对鸡内金药材的检测结果准确度高。[0217] 3.10鸡内金标准汤剂样品测定[0218] 分别取鸡内金标准汤剂,参照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别精密吸取上述供试品溶液和鸡内金对照药材参照物溶液,参照“2.3.1”项下色谱条件进样测定,18批样品特征图谱叠加图如图9所示。以染料木苷色谱峰为参照峰S,计算各特征峰与S峰的相对保留时间、相对峰面积以及RSD值,计算结果见如表8~表9。[0219] 表8.18批鸡内金标准汤剂特征图谱(相对保留时间)[0220][0221] 表9.18批鸡内金标准汤剂特征图谱(相对峰面积)[0222][0223][0224] 由表8和表9可见,不同批次的鸡内金标准汤剂供试品溶液经超高效液相色谱检测,均能得到相近的特征图谱,且相对保留时间的RSD值均小于1%,表明该方法对鸡内金标准汤剂的检测结果准确度高。[0225] 实施例2:[0226] 鸡内金药材与其它禽类伪品鸭内金、鸽内金以及鹅内金的鉴别应用:[0227] 分别取伪品鹅内金(6批)、鸭内金(7批)、鸽内金(2批)适量,参照上述实施例1中“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,参照实施例1中“2.3.1”项下色谱条件进样测定,以鸡内金对照药材参照物溶液的特征图谱为参照进行分析。[0228] 结果如图10~图12所示,与鸡内金对照药材的色谱图相比可见,6批鹅内金、7批鸭内金和2批鸽内金的峰5均缺失,其余峰在不同批次或不同禽类内金中均有缺失或响应极低,因此,该方法的特征图谱可用于鸡内金与其他禽类内金(鸽内金、鸭内金和鹅内金)的区分。[0229] 实施例3:[0230] 鸡内金与家鸡的其它不同部位的伪品的鉴别应用:[0231] 取雉科动物家鸡GallusgallusdomesticusBrisson不同部位,分别为鸡骨、鸡肉、鸡皮、鸡胗、鸡内脏适量,参照上述实施例1中“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,参照实施例1中“2.3.1”项下色谱条件进样测定,以鸡内金对照药材参照物溶液的特征图谱为参照进行分析。[0232] 结果如图13所示,与鸡内金对照药材的色谱图相比可见,雉科动物家鸡的其他部位的特征图谱中均无对应特征峰,说明该方法的特征图谱可用于鸡内金与家鸡的其它不同部位的伪品的区分。[0233] 对比例1:[0234] 鸡内金与家鸡的其它不同部位氨基酸特征图谱鉴别方法[0235] 参照申请人的在先申请(申请号:202111042755.4,申请名称:动物类中药标准汤剂氨基酸特征图谱构建及其中药标准汤剂和中药配方颗粒氨基酸含量检测)中的实施例2所记载的方法进行测定。[0236] 结果如图14所示,鸡内金对照药材与家鸡的其他不同部位的氨基酸特征图谱相比,并无较大差异,说明氨基酸类成分专属性较差,难以通过氨基酸类成分鉴别区分鸡内金对照药材与家鸡的其他不同部位。[0237] 实施例3与对比例1相比,可见,本申请的方法以异黄酮类成分作为鸡内金的特征图谱具有专属性,鉴别能力更精准。[0238] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。[0239] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
专利地区:广东
专利申请日期:2022-11-09
专利公开日期:2024-09-03
专利公告号:CN115684450B