负载艾片的PD-L1细胞纳米囊泡药物及其制备和应用

专利名称：负载艾片的PD-L1细胞纳米囊泡药物及其制备和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210703973.6

专利申请（专利权）人：广东药科大学
权利人地址：广东省云浮市云安区西江新城文华路368号

专利发明（设计）人：庞玉新,祝小凤,田鑫慧,苏丹丹,陈红波,程芳,袁媛

专利摘要：本发明提供了一种负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物及其制备和应用。本发明构建稳定表达PD‑L1基因的HEK 293T转染细胞株，以此制备PD‑L1细胞纳米囊泡，再负载低剂量的艾片并制备成水凝胶。本发明工艺简单，目的蛋白表达高效稳定，制备的纳米药物具有生物相容性良好、毒性低、药物利用率高等优点；比单独使用药效更显著；将纳米药物嵌入温敏水凝胶，便于应用且纳米药物可持续且稳定地释放。体外实验显示其可以抑制免疫细胞增殖和促进皮肤细胞迁移，烫伤模型则证实了PD‑L1蛋白和艾片的纳米药物具有协同抗炎、促进整体药物吸收的作用，加速了伤口的愈合。本发明为皮肤创伤等疾病的有效治疗开拓了一种新的途径。

主权利要求：
1.一种负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物在制备烫伤皮肤治疗药物中的应用，其特征在于，所述负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物包含PD‑L1细胞纳米囊泡，所述PD‑L1细胞纳米囊泡上负载艾片；所述负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物由10:10重量比的PD‑L1细胞纳米囊泡和艾片制成；
所述负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物通过以下方法制备：取1mg/ml的PD‑L1细胞纳米囊泡与1mg/ml的艾片溶液混合，使用MicroPulser电穿孔仪在300V、150μF的参数下使艾片负载到细胞纳米囊泡的中，冰上孵育30min后，以13500rpm，4℃，离心10min去除未负载的艾片，PBS重悬即得负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物溶液；
所述PD‑L1细胞纳米囊泡的制备方法包括：使用PEI转染试剂、鼠/人CD274基因慢病毒cDNA表达质粒和包装质粒制备重组慢病毒载体，感染目的细胞以构建稳定过表达PD‑L1基因的转染细胞株；培养扩增后使用HM裂解液裂解细胞，用组织研磨器充分研磨破碎细胞，
5000rpm，4℃离心10min去除细胞核和其他杂质；12000rpm，4℃，离心10min获得细胞膜沉淀；再通过0.45μm、0.22μm和0.11μm孔径的滤膜过滤压缩成囊泡状的细胞膜结构，即得PD‑L1细胞纳米囊泡；使用Bradford蛋白定量试剂测定蛋白量并调整浓度为1mg/ml的PD‑L1细胞纳米囊泡；所述1mg/mL的艾片溶液的制备方法包括：将所述艾片研磨成粉末，称量10mg艾片，溶解于10μLDMSO中，分次加入1mLPBS，将离心管超声5分钟帮助溶解，至总体积为
10mL，得1mg/mL的艾片溶液；
所述治疗烫伤皮肤创伤的药物中还含有PluronicF‑127温敏型水凝胶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗烫伤皮肤创伤的药物中PluronicF‑127温敏型水凝胶浓度20％。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗烫伤皮肤创伤的药物的制备过程包括称量温敏型水凝胶PluronicF‑127粉末30g，加入100mLPBS，置4℃冰箱中的搅拌器上搅拌过夜，使温敏型水凝胶完全溶解，温敏型水凝胶的终浓度为30％；4℃条件下，在温敏型水凝胶加入适量的负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物溶液，搅拌均匀，使得水凝胶的终浓度为20％。 说明书 : 负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物及其制备和应用
发明领域：[0001] 本发明属于医药技术领域中的皮肤创伤治疗领域，具体地，本发明提供了一种负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物及其制备和应用。背景技术：[0002] 创面愈合是一个代谢复杂的过程，依赖于一系列炎症细胞、趋化因子、细胞因子、基质分子和营养物质复杂的相互作用和协同工作，才能使受伤的皮肤恢复到完好的屏障功能。在创面愈合的修复过程中，止血期和炎症期的炎症有效地防止了伤口感染，但在增殖期和重塑期，持续且过度的炎症反应，会延缓组织创口的愈合过程，还容易导致组织纤维化，甚至形成增生性疤痕。因此，皮肤免疫环境的调节以及免疫抑制治疗在伤口愈合的增殖期中起到关键的作用。我们尝试通过抑制伤口中免疫细胞的过度活跃，以抑制过度的炎症反应来实现理想的伤口愈合和表皮修复。[0003] 程序化死亡‑配体1(ProgrammedDeathLigand‑1，PD‑L1)是一种负调节因子，通过激活PD‑1/PD‑L1免疫检查点通路，一定程度上可抑制T细胞的增殖和活化，起到免疫抑制作用，有效抑制炎症因子的产生。目前已有多个研究证明，PD‑L1在减弱皮肤、肝脏和心脏等移植手术后的免疫排斥反应方面发挥显著的疗效。而且有报道基因工程细胞或IFN‑γ刺激细胞后分泌的PD‑L1外泌体可以作为一种新型的免疫抑制剂，促进皮肤切除创面模型的创面愈合，充分证明了PD‑L1在皮肤修复的潜力。但PD‑L1外泌体存在难以产量化、PD‑L1含量难以把控等缺点。本发明通过慢病毒载体构建过表达PD‑L1基因的细胞转染株，以此为来源制备的类外泌体的细胞膜囊泡结构，称作细胞纳米囊泡(NVs)，其制备工艺更高效、方便、快捷，且可稳定地过表达PD‑L1蛋白。[0004] 艾片(BO)是从菊科植物艾纳香属艾纳香(Blumeabalsamifera(L.)DC)的新鲜叶中提取加工制成的具有挥发性的结晶，其为艾片的唯一植物来源。本课题组前期针对艾纳香在皮肤药理学方面积累了一定的科研基础，发现艾纳香油可以降低烧伤组织的含水量以缩短结痂时间，并且降低了血清中IL‑1、TNF‑α和MDA等因子的含量，增加了SOD的活性，上调了生长因子的表达，以及有效促进创口处胶原纤维的形成，加速烫伤创口的愈合(Fan,Z.W., Pang,Y.X.,Wang,K.,etal.BlumeabalsamiferaOilfortheAccelerationofHealingofBurnInjuries[J].Molecules,2015,20(9):17166‑17179.)；进一步也发现了艾纳香油可以减少炎症细胞数量，并显著增加羟脯氨酸的含量，有效地改善皮肤缺损小鼠的伤口收缩和闭合，提高创面愈合率(Pang,Y.,Wang,D.,Hu,X.,etal.EffectofvolatileoilfromBlumeaBalsamifera(L.)DC.leavesonwoundhealinginmice[J].JournalofTraditionalChineseMedicine,2014,34(6):716‑724.)；我们曾报道了艾纳香的主要成分可通过促进光产物8‑OHdG的排出，下调光损伤组织中IL‑6的mRNA水平，发挥抗炎作用以促进UVB辐射光损伤小鼠的伤口愈合(李小婷,王丹,庞玉新,等.左旋龙脑对UVB辐射后小鼠皮肤光损伤的影响[J].中国现代中药,2017,19(04):518‑524.)。以上均证实艾片抗炎抑菌的药效十分显著，是极具潜力的可促进深Ⅱ度烫伤等炎症创口的组织再生与修复治疗的药物。[0005] 然而，目前未见两者联合制备的药物。发明内容：[0006] 申请人联合PD‑L1蛋白和艾片制备纳米药物，一方面维持艾片的稳定性，促进整体药物的吸收和提高生物利用度，另一方面，可发挥协同抗炎的作用，促进组织的再生和理想修复。为了方便纳米药物的应用，需要结合一种可稳定包裹该细胞纳米囊泡的载体材料。温敏型水凝胶在药物递送、3D细胞培养等方面有显著的优越性，能够将分子药物稳定包裹、持续释放并保持其活性。相比于传统水凝胶，温敏型水凝胶其优势是可以感应环境温度变化而发生溶胶‑凝胶转变，在低温流动状态时更好地与纳米囊泡药物均匀混合，且能更好地维持其活性和便于保存运输。在涂抹于创口处时，温度升高而发生凝胶化，形成的凝胶网络可作为良好的生物支架包裹纳米药物。再者，水凝胶涂敷于创口处一定程度隔绝了外界环境，预防感染，避免水和热量流失，保持伤口湿润并减轻疼痛的效果，有利于伤口的修复。[0007] 一方面，本发明提供了一种负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡药物，所述药物包含PD‑L1细胞纳米囊泡，所述PD‑L1细胞纳米囊泡上负载艾片。[0008] 进一步地，所述药物由10:1‑10，优选10:10重量比的PD‑L1细胞纳米囊泡和艾片组成。[0009] 进一步地，所述PD‑L1细胞纳米囊泡是通过构建的PD‑L1基因转染细胞株，扩增，裂解，组织研磨，离心，梯度过滤后得到的囊泡状细胞膜结构获得。[0010] 进一步地，所述PD‑L1细胞纳米囊泡的制备方法包括：使用PEI转染试剂、鼠/人CD274基因慢病毒cDNA表达质粒和包装质粒制备重组慢病毒载体，感染目的细胞以构建稳定过表达PD‑L1基因的转染细胞株；培养扩增后使用HM裂解液裂解细胞，用组织研磨器充分研磨破碎细胞，5000rpm，4℃离心10min去除细胞核和其他杂质；12000rpm，4℃，离心10min获得细胞膜沉淀；再通过0.45μm、0.22μm和0.11μm孔径的滤膜过滤压缩成囊泡状的细胞膜结构，即得PD‑L1细胞纳米囊泡；使用Bradford蛋白定量试剂测定蛋白量并调整浓度为1mg/ml的PD‑L1细胞纳米囊泡。[0011] 进一步地，制备过程中所述艾片研磨成粉末，称量10mg艾片，溶解于10μLDMSO中，逐次加入1mLPBS，将离心管超声5分钟帮助溶解，至总体积为10mL，得1mg/mL的艾片溶液。[0012] 进一步地，所述药物通过以下方法制备取1mg/ml的PD‑L1细胞纳米囊泡与1mg/ml的艾片溶液混合，使用MicroPulser电穿孔仪在300V、150μF的参数下使艾片负载到细胞纳米囊泡的中，冰上孵育30min后，以13500rpm，4℃，离心10min去除未负载的艾片，PBS重悬即得。[0013] 进一步地，所述药物中还含有药学上可接受的赋形剂，优选涂敷或涂抹的载体，更优选温敏型水凝胶，再优选PluronicF‑127温敏型水凝胶；优选纳米药物溶液与30％温敏水凝胶体积比例为1:2。[0014] 另一方面，本申请提供了上述药物在制备促进伤口愈合或治疗皮肤创伤的药物中的应用。[0015] 进一步地，所述伤口或创伤为烫伤、糖尿病足或者切割伤。[0016] 另一方面，本申请提供了上述药物的制备方法，所述方法包括：[0017] (1)使用PEI转染试剂、鼠/人CD274基因慢病毒cDNA表达质粒、psPAX2和VSVG包装质粒制备重组慢病毒，以此感染HEK293T细胞，构建稳定过表达PD‑L1基因的转染细胞株；[0018] (2)转染细胞株培养扩增后使用HM裂解液裂解细胞，用组织研磨器充分研磨使细胞破碎，再进行两次离心，超声和梯度过滤；[0019] (3)使用MicroPulser电穿孔仪使艾片负载到细胞纳米囊泡中，孵育，离心，重悬；[0020] (4)在温敏型水凝胶中加入适量体积含负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡的PBS，混合均匀；[0021] 其中步骤(4)中优选水凝胶浓度20％，更优选步骤(4)为：称量温敏型水凝胶PluronicF‑127粉末30g，加入100mLPBS，置4℃冰箱中的搅拌器上搅拌过夜，使温敏型水凝胶完全溶解，温敏型水凝胶的终浓度为30％；4℃条件下，在温敏型水凝胶加入适量的纳米药物溶液，搅拌均匀，使得水凝胶的终浓度为20％。[0022] 本申请中的艾片是指从菊科植物艾纳香属艾纳香(Blumeabalsamifera(L.)DC)的新鲜叶中提取加工制成的具有挥发性的结晶，为白色晶体；其可以市购获得或者通过本领域已知的方法制备获得。[0023] 本申请中的PD‑L1细胞纳米囊泡的粒径为100‑220nm，其中的内部的疏水性空间负载可用于负载艾片。[0024] 本申请中涂敷或涂抹的载体、温敏型水凝胶等赋形剂本领域技术人员可以根据药剂学常规知识选用，不局限具体型号。[0025] 本申请的药物使用时优选连续使用，优选连续施用三日以上。[0026] 有益效果：[0027] (1)生物安全性：所得的负载艾片PD‑L1细胞纳米囊泡的纳米药物是以细胞为来源的细胞膜磷脂结构，生物相容性良好。[0028] (2)生物利用率：药物大小为100‑220nm，纳米粒径更易穿过生理屏障，具有更好的透皮吸收效果，且艾片可促进整体药物的吸收；水凝胶可以维持纳米药物的活性使其持续稳定地释放。[0029] (3)靶向性：纳米药物富含PD‑L1蛋白，更易于靶向皮肤组织中的免疫细胞，起到免疫抑制和抗炎的作用。[0030] (4)治疗机制互补：PD‑L1细胞纳米囊泡负载艾片后，发挥药物之间的联合作用，减少单一治疗方式的局限性，增强疗效。附图说明：[0031] 图1.负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡制备与表征。图1A.PD‑L1蛋白在细胞中的亚细胞定位观察。图1B.PD‑L1mRNA过表达水平结果。图1C‑E.不同细胞纳米囊泡的透射电镜图片(C)，粒径分布(D)与Zeta电势(E)结果。图1F.细胞和细胞纳米囊泡样品中的PD‑L1蛋白表达情况.数据以三个独立实验的平均值±标准误差(Mean±SEM)表示。(*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示P＞0.05，不显著)。[0032] 图2.负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡体外活性研究。图2A.Jurkat细胞对细胞纳米囊泡的摄取情况(标尺：5μm)。图2B‑E.PD‑L1细胞纳米囊泡抑 制PBMC和T细胞的增殖。(B：抑制T细胞与PBMC增殖的流式代表图，D‑E： 抑制T细胞(D)与PBMC(E)增殖的数据统计图，C：比较细胞纳米囊泡对 PBMC和T细胞的增殖抑制作用)图2F‑G.PD‑L1细胞纳米囊泡促进HaCaT细胞 的迁移(F：量化划痕面积后的数据统计图，G：各组划痕试验结果的代表图， 标尺：100μm)。数据以三个独立实验的平均值±标准误差(Mean±SEM) 表示。(*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示 P＞0.05，不显著)。[0033] 图3.嵌入纳米药物的温敏型水凝胶的制备和表征。图3A.温敏型水凝胶 的凝胶化情况(AⅠ：室温放置后的凝胶化情况；A II:4℃时的温敏型水凝 胶；A III：涂抹于小鼠皮肤伤口处的凝胶化情况；图3B.扫描电镜拍摄的内部 微观形态图片(标尺5μm)。图3C.温敏型水凝胶流变性检测结果。图3D‑E. HaCaT细胞对温敏型水凝胶中细胞纳米囊泡的摄取情况(标尺：5μm，D：激光 共聚焦显微镜拍摄的不同时间孵育后细胞摄取图片；E：荧光定量后的数据统计 图)。数据以三个独立实验的平均值±标准误差(Mean±SEM)表示。(* 表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示P＞ 0.05，不显著)。[0034] 图4.包裹纳米药物的温敏型水凝胶促进了伤口愈合。图4A‑B.经不同纳米药 物水凝胶处理后小鼠的伤口愈合情况(A)及愈合率的计算结果(B)。图4C. 病理学分析结果(标尺：200nm，白箭头：角囊肿，黑箭头：皮肤附属器)。[0035] (**表示P<0.01)。[0036] 图5.包裹纳米药物的温敏型水凝胶可发挥协同炎症作用。图5A‑B.包裹纳米 药物+的温敏型水凝胶处理后淋巴结中CD8T细胞的活化情况(A：流式分析代 表图，B：数据统计+图)。图5C.包裹纳米药物的温敏型水凝胶处理后脾脏中 CD8T细胞的活化情况。图5D.包裹纳米药物的温敏型水凝胶处理后创口皮肤 中炎症因子水平的变化。数据以三个独立实验的平均值±标准误差(Mean± SEM)表示。(*表示P＜0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001， ns表示P＞0.05，不显著)。具体实施方式：[0037] 实施例1基本实验过程[0038] 一、方法与材料[0039] 1.构建过表达PD‑L1的HEK 293T细胞株[0040] 1.1PD‑L1(OFP‑tag)慢病毒质粒的构建[0041] 人CD274基因慢病毒cDNA表达质粒(C‑OFP Spark标签，Sino Biologocal Inc.)(Genebank Ref.ID：NM_014143.2)、鼠CD274基因慢病 毒cDNA表达质粒(C‑OFP Spark标签,Sino Biologocal Inc.)(Genebank Ref.ID：NM_021893.2)、包装质粒psPAX2、包装质粒VSVG，其中药物的体外 活性研究部分和HaCaT细胞对温敏型水凝胶中细胞纳米囊泡的摄取情况实验使 用的是人PD‑L1细胞纳米囊泡，其他实验使用的是鼠PD‑L1细胞纳米囊泡。[0042] 将OFP载体与鼠/人CD274基因慢病毒cDNA表达质粒同时用限制性内切 酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，37℃水浴4h，酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离并对相关片段进行凝胶回收，采用T4 DNA快速连接酶在25℃水 浴1h，将连接产物转化到DH5α感受态细胞，接种至含氨苄青霉素(Amp)的 LB平板培养基中,过夜培养。从平板培养基中挑取单个菌落，摇床培育过夜，使用大提质粒试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒。[0043] 1.2转染[0044] 将人CD274基因慢病毒cDNA表达质粒(C‑OFPSpark标签)或者鼠CD274基因慢病毒cDNA表达质粒(C‑OFPSpark标签)使用PEI试剂转染HEK293T细胞。在基因操作48h后，5对细胞进行富集：在4×10个/mL的HEK293T细胞中加入10μg鼠/人CD274基因慢病毒cDNA表达质粒，5μg包装质粒psPAX2和5μg包装质粒VSVG，每2μg的质粒加5μLPEI储存液；感染5细胞时，在1×10个/mL的HEK293T细胞中加入以PBS梯度稀释的重组慢病毒液和8μg/mL的Polybrene，再以5μg/mL嘌呤霉素进行筛选。[0045] 1.3表征[0046] 使用WGA350染料对细胞膜染色，通过激光共聚焦显微镜对PD‑L1蛋白定位。使用标准的TRIzol方案提取细胞总mRNA，确定RNA浓度和纯度。使用逆转录试剂盒制备cDNA，通‑ΔΔCT过qPCR试剂盒和PCR仪进行qPCR反应。使用2 方法分析相对定量数据，检测mPD‑L1RNA的过表达。引物序列如下：[0047][0048] 2.制备PD‑L1细胞纳米囊泡负载艾片的纳米药物与表征[0049] 2.1分离PD‑L1细胞纳米囊泡[0050] 使用HM裂解缓冲液裂解细胞，将细胞悬液加入组织研磨器中充分研磨，5000rpm离心10min，4℃去除细胞核和蛋白质，将上清13500rpm，4℃离心10min，沉淀用PBS重悬，将细胞纳米囊泡超声5s得到分散均匀的囊泡悬液，使用多孔滤膜将细胞纳米囊泡依次进行0.45μm、0.22μm、0.11μm过滤。[0051] 每10cm皿的细胞加入1‑2mL的HM裂解液(250mM蔗糖，1.02mM EDTA，20.02mMHEPES，pH＝7.4)。离心参数依次为5000rpm，10min，4℃，取上清；13500rpm，10min，4℃，取沉淀。超声参数为50％功率，5s。梯度过滤的滤膜孔径依次为0.45μm、0.22μm、0.11μm。[0052] 2.2配制艾片母液[0053] 使用研钵将艾片研磨成粉后，称量10mg艾片，溶解于10μLDMSO中，逐次加入1mLPBS至总体积10mL，每次加入PBS后将离心管超声5分钟帮助溶解，最后得1mg/mL的艾片溶液。超净工作台中以0.22μm滤膜过滤2次。[0054] 2.3PD‑L1细胞纳米囊泡负载艾片[0055] 取1mg/ml的PD‑L1细胞纳米囊泡与1mg/ml的艾片溶液混合，使用MicroPulser电穿孔仪在300V、150μF的参数下使艾片负载到细胞纳米囊泡中，冰上30min后，以13500rpm，4℃，离心10min去除未负载的艾片，PBS重悬即得PD‑L1细胞纳米囊泡负载艾片的纳米药物。[0056] 2.4表征[0057] 使用扫描透射电镜对纳米囊泡进行形态学考察，使用纳米粒度及Zeta电位分析仪检测囊泡的粒径分布和Zeta电势，RIPA裂解液提出细胞总蛋白，定量加热变性后，使用8％SDS‑PAGE分离目的蛋白，鉴定PD‑L1蛋白的过表达。用于蛋白质印迹分析的主要抗体有Anti‑OFP抗体(1:1000，15214‑1‑AP，ChromoTek)和Anti‑PD‑L1抗体(1:1000，8478，Invitrogen)。[0058] 3.细胞实验[0059] 3.1细胞系[0060] 人类永生化表皮细胞系(HaCaT)使用10％FBS的DMEM培养，人外周血白血病细胞系(Jurkat)使用10％FBS的RPMI‑1640培养基培养。[0061] 3.2观察Jurkat细胞对纳米药物的摄取[0062] 使用WGA350染料对细胞膜染色，通过激光共聚焦显微镜观察Jurkat细胞对细胞纳米囊泡的摄取。[0063] 3.3检测纳米药物对免疫细胞的作用[0064] 使用常规方法从新鲜血液中分离PBMC和T细胞，5μM的CFSE标记细胞，使用流式细胞术分析PBMC和T细胞的增殖情况。[0065] 3.4检测纳米药物对皮肤细胞的影响[0066] 使用HaCaT细胞进行划痕实验，检测纳米药物对皮肤细胞迁移的影响。加入纳米药物后，孵育36h，用光学显微镜拍摄，使用ImageJ软件量化无细胞的面积，迁移率的计算公式如下：[0067] 迁移率(％)＝划痕面积t＝0‑划痕面积t＝36/划痕面积t＝0x100％(1)[0068] 4.将纳米药物嵌入温敏型水凝胶并表征[0069] 4.1将纳米药物嵌入温敏型水凝胶[0070] 称量温敏型水凝胶(PluronicF‑127)粉末30g，加入100mLPBS，置4℃冰箱中的搅拌器上搅拌过夜，使温敏型水凝胶PF‑127完全溶解，温敏型水凝胶PF‑127的终浓度为30％；在温敏型水凝胶PF‑127中分别加入适量的纳米药物溶液，搅拌均匀，使得水凝胶的终浓度为20％。[0071] 4.2表征[0072] 将温敏型水凝胶加到西林瓶中，在室温放置5min，与刚从4℃取出的温敏型水凝胶对比，观察其流动状态。使用扫描电镜观测水凝胶的内部微观形态。使用利用流变仪测定5～40℃内的弹性模量(G’)和粘性模量(G”)，检测其流变性。WGA‑CF‑594染料对纳米药物染色，与HaCaT细胞梯度时间孵育，使用激光共聚焦显微镜观察温敏型水凝胶中细胞纳米囊泡的释放和被细胞摄取的情况。[0073] 5.动物实验[0074] 5.1深II度烫伤小鼠模型的建立[0075] 20克的砝码置100℃的水中加热10分钟，用镊子夹起置脱毛的背部皮肤上烫10秒钟，形成大小相当的圆形烫伤创口。将小鼠随机分为6组(n＝5/ 组)，分组如下：i)模型组(Model)、ⅱ)空白水凝胶组(Control)、ⅲ) 空白囊泡水凝胶组(Free NVs，27mg/kg)、ⅳ)PD‑L1囊泡水凝胶组(PD‑L1 NVs，27mg/kg)、ⅴ)艾片水凝胶组(BO，10μg/kg)、ⅵ)PD‑L1囊泡负载 艾片水凝胶组(BO@PD‑L1 NVs，27mg/kg)；烫伤部位从第3天开始每天涂抹 给药1次，每天记录小鼠的体重变化和拍照记录皮肤创伤面积的变化(以圆形 模具作为对照)，然后采用Image J软件测量创面面积，愈合率计算公式如下：[0076] 相对面积(A)＝创面面积/圆形模具面积(2)[0077] 愈合率(％)＝A第一天‑A第n天/A第一天x100％(3)[0078] 第9天时，对所有小鼠实施安乐死并进一步分析。所有动物手术均经广东 药科大学实验动物伦理委员会批准(编号SYXK(广东)2017‑0215)。[0079] 5.2组织病理学分析[0080] 将皮肤样品固定在4％多聚甲醛溶液中48小时。以常规方式处理组织以进 行组织学评价，分别进行苏木精和伊红染色，Masson染色。另外，针对α‑SMA 和CD3蛋白进行免疫组织化学染色，使用数字切片扫描系统观察切片并拍摄。[0081] 5.3检测脾脏和淋巴结中T细胞的活化情况[0082] 脾脏和颈部淋巴结制成单细胞悬液，分别加入100μL细胞染色缓冲液、1 μL APC anti‑mouse CD4抗体、1μL Brilliant Violet 421TM anti‑mouse CD8a抗体、1μL FITC anti‑mouse CD3流式抗体，避光冰上孵育15min，随 后1500×g离心，4℃，5min；弃上清，重+ +悬，用流式细胞仪测定颈部淋巴 结和脾脏中的CD4、CD8T细胞的活化情况。[0083] 5.4检测愈合处皮肤的炎症因子水平[0084] 使用标准的TRIzol方案提取细胞总mRNA，确定RNA浓度和纯度。使用逆 转录试剂‑ΔΔCT盒制备cDNA，通过qPCR试剂盒和PCR仪进行qPCR反应。使用2 方法分析相对定量数据。检测mPD‑L1 RNA的过表达。引物序列如下：[0085][0086] 6.统计学分析[0087] 采用GraphPad Prism 7软件对本研究的所有数据进行统计分析作图。实验 结果以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示。每组至少包含三个重复数据。两组之间差异统计分析采用t检验，多组别之间的单因素方差分析采用 Turkey检验。P<0.05，表示差异有统计学意义。(*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示P＞0.05，不显著)。[0088] 实施例2实验结果[0089] 1.发现PD‑L1细胞纳米囊泡可作为负载艾片的理想纳米载体[0090] 我们成功构建了稳定过表达PD‑L1蛋白的细胞系，分别从mRNA水平(图1.B)和蛋白质水平(图1.F)证实了PD‑L1过表达的稳定性，并发现PD‑L1蛋白稳定表达于细胞膜上(图1.A)。进一步地，从过表达PD‑L1蛋白的细胞系中分离获得PD‑L1细胞纳米囊泡。通过对比PD‑L1细胞纳米囊泡与其来源细胞上的PD‑L1蛋白水平(图1.F)，发现PD‑L1细胞纳米囊泡能够对PD‑L1蛋白起到了富集的作用，预示其免疫抑制的疗效优于其来源细胞。利用通过电穿孔法使PD‑L1细胞纳米囊泡负载低剂量的艾片，获得目的纳米药物。通过透射电镜观察和动态光散射(DLS)分析该纳米粒为脂质双分子层膜包裹的圆形结构(图1.C)，粒径为90～160nm(图1.E)，Zeta电位为‑16.19±2.95Mv(图1.D)，具备合适的粒径大小和稳定的结构。[0091] 该纳米药物与未负载的PD‑L1纳米囊泡在形态(图1.C)、粒径(图1.E)、Zeta电位(图1.D)和PD‑L1蛋白量(图1.F)上均无显著性差异，说明制备工艺不会影响其先天的物理特征和PD‑L1表达的稳定性。[0092] 总的来说，PD‑L1细胞纳米囊泡可作为负载艾片的理想纳米载体。[0093] 2.负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡在体外可抑制免疫细胞的增殖[0094] 为了初步验证PD‑L1细胞纳米囊泡的生物活性，将内源性表达PD‑1蛋白的Jurkat细胞分别与PD‑L1细胞纳米囊泡、负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡共孵育，观察可知Jurkat细胞对该两种囊泡均能有效摄取，且摄取囊泡的数量相当(图2.A)。证明了PD‑L1细胞纳米囊泡能够与表达PD‑1的靶细胞相互结合。另外，也说明了PD‑L1细胞纳米囊泡经电穿孔负载艾片后，其被细胞摄取的活性没有受到影响，PD‑L1与表达PD‑1的靶细胞的相互结合可以正常进行。[0095] 考虑到深II度烫伤中机体内主要是健康的免疫细胞，我们将分离的PBMC和T细胞用于试验PD‑L1细胞纳米囊泡是否同样起到显著的抑制作用。从流式细胞术分析结果中证实了PD‑L1蛋白能显著够抑制PBMC和T细胞的增殖(图2.B‑E)。由于PBMC中包含了淋巴细胞(T细胞，B细胞和自然杀伤细胞)和单核细胞，所以PD‑L1对T细胞的增殖抑制作用强于PBMC(图2.C)。通过该实验发现了负载艾片后的PD‑L1仍然能发挥增殖抑制的作用，但艾片组的结果为阴性。[0096] 3.负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡在体外可促进皮肤细胞的迁移[0097] 既已证实PD‑L1细胞纳米囊泡可以抑制免疫细胞增殖从而发挥抗炎作用，其是否能促进深II度烫伤的伤口愈合，仍需要观察其对皮肤相关细胞的影响，因此选取了人永生化角质形成细胞(HaCaT)作为研究的目标细胞，对其进行划痕试验。结果发现HaCaT经过与不同处理后，相对于Ctrl组或FreeNVs组，PD‑L1细胞囊米囊泡组(PD‑L1NVs)、艾片组(BO)和负载艾片的PD‑L1细胞囊米囊泡组(BO@PD‑L1NVs)的无细胞区域在视觉上有明显的缩小(图2.G)，数据统计结果发现PD‑L1NVs组、BO组和BO@PD‑L1NVs组显著促进了HaCaT细胞的迁移，且BO@PD‑L1NVs比单独的BO和PD‑L1NVs更能促进HaCaT细胞的迁移(图2.F)。一方面可以说明PD‑L1和艾片均能够抑制细胞生长环境中的免疫因子，两者具有协同增效的作用，另一方面也可能是艾片具有促进细胞摄取药物的作用，提高了整体药物的疗效，减少过度的免疫调节因子对划痕后细胞迁移的影响，这将有助于皮肤创口的修复。[0098] 4.温敏型水凝胶可作为本发明中纳米药物的理想给药载体[0099] 制备所得的负载艾片的PD‑L1细胞囊米囊泡为液体流动状态，若要通过涂抹给药用于深Ⅱ度烫伤的治疗，需要结合一种可稳定包裹该细胞纳米囊泡的载体材料。温敏型水凝胶在药物递送、3D细胞培养等方面有显著的优越性，能够将分子药物稳定包裹且持续释放并保持其活性。[0100] 首先对温敏型水凝胶的物理性质进行考察。从形态学考察结果(图3.A‑B)可知，温敏型水凝胶可在短时间内凝胶化(图AI,II)，将其涂抹于小鼠背部伤口部位，30s内即可凝胶化于伤口上(图AIII)，使用扫描电镜观察到温敏型水凝胶的内部呈现多孔而疏松的孔洞结构(图3.B)，孔洞直径为50～120μm，该结构有利于细胞纳米囊泡这类小分子药物的包裹和释放，同时也便于水分子自由通过，对伤口愈合过程有利。对温敏型水凝胶的流变性进行考察，结果(图3.C)发现在弹性模量(G’)＝粘性模量(G”)时，达到溶胶‑凝胶临界点，发生大规模的物理网状凝胶化，凝胶化温度为25.1℃，证实该水凝胶在接触到体温时能够凝结在伤口处，可作为隔绝外部环境的一道屏障。[0101] 为了探究细胞纳米囊泡被嵌入温敏型水凝胶后是否能正常释放，并被HaCaT细胞摄取，以及研究负载艾片后细胞摄取的变化，我们使用共聚焦显微镜在梯度孵育时间点观察并拍摄HaCaT细胞摄取温敏型水凝胶的情况。我们发现随着孵育时间延长，细胞的荧光摄取量均逐渐上升，在24h达到细胞摄取的最大值，36h细胞的荧光摄取量都有一定程度的下降(图3.D‑E)。实验结果证明温敏型水凝胶能够将细胞纳米囊泡缓慢并持续地释放。温敏型水凝胶可以作为细胞纳米囊泡的理想包裹载体，将其释放到伤口环境中发挥治疗伤口的作用，并且在外界环境和创口内部环境之间作为屏障。[0102] 且我们发现了负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡组在每一个时间点的相对荧光摄取量均高于未负载组(PD‑L1NVs)，该结果说明艾片能够有效地促进细胞摄取小分子药物，促进药物吸收和提高生物利用度。[0103] 5.负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡加速了深Ⅱ度烫伤的伤口愈合[0104] 我们进一步在生理环境中验证纳米药物是否也能发挥抗炎的疗效，将嵌入纳米药物的温敏水凝胶从第三天开始每天涂抹与创口处。从伤口图片可观察得PD‑L1细胞纳米囊泡(PD‑L1NVs)、艾片(BO)和负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡(BO@PD‑L1NVs)对伤口愈合均有一定的促进作用(图4.A)。通过计算伤口愈合率(图4.B)，发现在伤口修复9天后，对照组(Control)的愈合率为30.64±5.38％，PD‑L1NVs组和BO组的愈合率分别为40.10±6.07％和36.99±9.18％，而BO@PD‑L1NVs组的伤口愈合率达50.66±10.68％，证明PD‑L1细胞纳米囊泡和艾片均有一定程度加快皮肤创面收缩的作用，而PD‑L1细胞纳米囊泡负载艾片后起到协同增效的作用，具有更好的促进效果。[0105] 组织学上，BO@PD‑L1NVs凝胶治疗可防止发生角化过度、角囊肿，并促进皮肤附属器的恢复，具有更理想的胶原重塑和表皮纤维化效果，且能够抑制表皮T细胞活化，防止表皮炎症过度浸润(图4.C)，疗效比单独使用艾片或PD‑L1细胞纳米囊泡更佳。[0106] 以上结果表明，BO@PD‑L1NVs凝胶加速了深II度烫伤的伤口愈合，且具有更理想的愈合效果。[0107] 7.负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡可发挥协同抗炎的作用[0108] 考察纳米药物治疗后小鼠体内T细胞的活化情况，发现相比于Model组(27.17±0.58％)、Control组(25.13±1.25％)或FreeNVs组(25.47±0.57％)，PD‑L1NVs组(18.40±2.22％)、BO组(19.20±3.48％)和BO@PD‑L1NVs组(16.90±4.29％)颈部淋巴结中的CD8+T细胞明显更少(图5.A‑C)。BO@PD‑L1NVs组的降低效果最显著。但是各组脾脏中的CD8+T细胞无显著性差异。说明在损伤的组织环境中，PD‑L1细胞纳米囊泡和艾片均能对于附近的颈部淋巴组织起到负向调节T细胞活化的作用，但是并不能影响类似于脾脏的远端淋巴器官，这证实了PD‑L1细胞纳米囊泡负载只对于伤口环境中的T细胞起到负向调控的作用，并不会影响机体中的正常的免疫功能，能够针对性地抑制伤口处的过度免疫反应而促进皮肤修复。[0109] 我们进一步探讨纳米药物治疗后小鼠烫伤皮肤中炎症因子的变化。发现PD‑L1NVs组、BO组和BO@PD‑L1NVs组中的IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的mRNA水平显著下降，这表明PD‑L1蛋白和艾片均能起到抑制炎症的作用。且BO@PD‑L1NVs组中的TNF‑α的mRNA水平较PD‑L1NVs组和BO组的下降更为显著，说明负载艾片的PD‑L1细胞纳米囊泡可以协同降低创口皮肤中炎症因子的水平(图5.D)[0110] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

专利地区：广东

专利申请日期：2022-06-21

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN114903977B