一株可产甘露醇和二烯丙基二硫醚的耐乙醇片球菌

一株可产甘露醇和二烯丙基二硫醚的耐乙醇片球菌

摘要：本发明公开了一株可产甘露醇和二烯丙基二硫醚的耐乙醇片球菌，属于微生物技术领域。本发明筛选出了一株耐乙醇片球菌，此耐乙醇片球菌生长速度快，可抑制霉菌和酵母菌，并且，可高产有机酸、甘露醇和二烯丙基二硫醚，具体体现在：将此耐乙醇片球菌接种至泡菜原料中发酵，发酵12h，即可使泡菜中乳酸菌的活菌数达8.5lgCFU/mL，发酵24h，即可使泡菜中霉菌和酵母菌的总活菌数低至1.6lgCFU/mL，发酵48h，即可使泡菜的pH值低至3.5，发酵96h，即可使泡菜中总酸的含量达0.6g/100g、甘露醇的含量达565.18mg/100g、二烯丙基二硫醚的含量达793.10μg/kg。

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202010817401.1

专利申请（专利权）人：江南大学
权利人地址：江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号

专利发明（设计）人：毛丙永,崔树茂,云琳,唐鑫,翟齐啸,陆文伟,赵建新,张灏,陈卫

主权利要求:一株可产甘露醇和二烯丙基二硫醚的耐乙醇片球菌
技术领域
[0001] 本发明涉及一株可产甘露醇和二烯丙基二硫醚的耐乙醇片球菌，属于微生物技术领域。
背景技术
[0002] 泡菜是以新鲜蔬菜为原料，添加调味料，利用蔬菜自身附着的微生物或额外添加的乳酸菌发酵剂，在厌氧环境下进行乳酸发酵而制得的发酵食品。一般来说，只要是纤维丰富的蔬菜，都可以被制成泡菜，例如，卷心菜、大白菜、红萝卜、白萝卜、大蒜、青葱、小黄瓜、洋葱、高丽菜等。
[0003] 泡菜的生产主要依靠乳酸菌的发酵作用。研究表明，在泡菜的发酵过程中，肠膜明串珠菌、变形链球菌、耐乙醇片球菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌等泡菜发酵优势菌株会产生有机酸等物质，抑制霉菌和酵母菌等其他杂菌的生长，同时产生甘露醇和二烯丙基二硫醚等对泡菜特有风味的行程起决定性作用的风味物质(具体可见参考文献“WisselinkH，WeusthuisR，EgginkG，etal.Mannitolproductionbylacticacidbacteria:Areview[J].InternationalDairyJournal，2002，12(2):151‑161.”和“赵谋明，蔡宇，曹永等.10种市售鸡肉香精的挥发性风味化合物分析[J].现代食品科技，2016，32(9):275‑287.”)。

[0004] 因此，获得可高产有机酸和甘露醇、二烯丙基二硫醚等风味物质的乳酸菌对保证泡菜生产的成功率以及提升泡菜风味来说，十分关键。
[0005] 但是，肠膜明串珠菌、变形链球菌、耐乙醇片球菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌等泡菜发酵优势菌株中，可高产有机酸和甘露醇、二烯丙基二硫醚等风味物质的并不多，例如，Loesche等人发现变形链球菌在含1.5％(w/v)蔗糖反应物中仅可产生0.1～0.3mg甘露醇(具体可见参考文献“Loesche WJ，KornmanKS.Productionofmannitolbystreptococcusmutans[J].ArchivesofOralBiology，1976，21:551‑553”)。
[0006] 因此，急需找到更多可高产有机酸和甘露醇、二烯丙基二硫醚等风味物质的泡菜发酵优势菌株以保证泡菜生产的成功率以及提升泡菜风味。
发明内容
[0007] [技术问题]
[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一株可高产有机酸、甘露醇和二烯丙基二硫醚的耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)。
[0009] [技术方案]
[0010] 为解决本发明的技术问题，本发明提供了一株耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)VCQWZ3‑L7，所述耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)VCQWZ3‑L7已于2020年07月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61112，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0011] 所述耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)VCQWZ3‑L7是从来源于重庆市的泡菜水样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为耐乙醇片球菌，命名为耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)VCQWZ3‑L7。
[0012] 本发明还提供了一种生产甘露醇和/或二烯丙基二硫醚的方法，所述方法为先将上述耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，然后从发酵液中提取甘露醇和/或二烯丙基二硫醚。
[0013] 本发明还提供了上述耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7或上述方法在生产甘露醇和/或二烯丙基二硫醚中的应用。
[0014] 本发明还提供了一种发酵剂，所述发酵剂含有上述耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7接种到培养基中进行培养，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用缓冲液和冷冻保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液真空冷冻干燥，得到发酵剂。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂为泡菜发酵剂。
[0017] 本发明还提供了一种生产泡菜的方法，所述方法为将上述耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7或上述发酵剂接种至蔬菜中进行无氧发酵，得到泡菜。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为20～30℃、时间为3～4d。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述蔬菜为白萝卜、辣椒、蒜和姜。
[0020] 本发明还提供了一种泡菜，所述泡菜是使用上述方法生产得到的。
[0021] 本发明还提供了上述耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7或上述发酵剂或上述方法在生产泡菜中的应用。
[0022] 本发明还提供了一种真菌抑制剂，所述真菌抑制剂含有上述耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述真菌为霉菌和/或酵母菌。
[0024] 本发明还提供了一种抑制真菌的方法，所述方法为将上述耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7或上述真菌抑制剂添加至含有真菌或真菌孢子的培养体系中进行培养。
[0025] 在本发明的一种实施方式中，所述真菌为霉菌和/或酵母菌。
[0026] 本发明还提供了上述耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7或上述发酵剂或上述方法在抑制真菌方面不以疾病的诊断和治疗为目的的应用。
[0027] 在本发明的一种实施方式中，所述真菌为霉菌和/或酵母菌。
[0028] [有益效果]
[0029] 本发明筛选出了一株耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)VCQWZ3‑L7，此耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7生长速度快，可抑制霉菌和酵母菌，并且，可高产有机酸、甘露醇和二烯丙基二硫醚，具体体现在：
[0030] (1)将此耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7接种至泡菜原料中发酵，发酵12h，即可使泡菜中乳酸菌的活菌数高达8.5lgCFU/mL；
[0031] (2)将此耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7接种至泡菜原料中发酵，发酵24h，即可使泡菜中霉菌和酵母菌的总活菌数由5.5lgCFU/mL降低至1.6lgCFU/mL；
[0032] (3)将此耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7接种至泡菜原料中发酵，发酵48h，即可使泡菜的pH值降低至3.5，发酵96h，即可使泡菜中总酸的含量高达0.6g/100g；
[0033] (4)将此耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7接种至泡菜原料中发酵，发酵96h，即可使泡菜中甘露醇的含量高达565.18mg/100g；
[0034] (5)将此耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7接种至泡菜原料中发酵，发酵96h，即可使泡菜中二烯丙基二硫醚的含量高达793.10μg/kg，
[0035] 因此，本发明的耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7在生产甘露醇和/或二烯丙基二硫醚、生产泡菜以及抑制真菌等方面均具有极高的应用前景。
[0036] 生物材料保藏
[0037] 一株耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)VCQWZ3‑L7，分类学命名为Pediococcusethanolidurans，已于2020年07月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61112，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
[0038] 图1：耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7的菌落特征。
[0039] 图2：耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7的菌体特征。
[0040] 图3：不同耐乙醇片球菌发酵得到的泡菜的pH值。
[0041] 图4：不同耐乙醇片球菌发酵得到的泡菜中总酸的含量。
[0042] 图5：不同耐乙醇片球菌发酵得到的泡菜中乳酸菌的活菌数。
[0043] 图6：不同耐乙醇片球菌发酵得到的泡菜中霉菌和酵母菌的总活菌数。
[0044] 图7：不同耐乙醇片球菌发酵得到的泡菜中甘露醇的含量。
[0045] 图8：不同耐乙醇片球菌发酵得到的泡菜中二烯丙基二硫醚的含量。
具体实施方式
[0046] 下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
[0047] 下述实施例中涉及的白萝卜、辣椒、蒜、姜、食盐、香辛料购自无锡欧尚超市。
[0048] 下述实施例中涉及的培养基如下：
[0049] MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O2.6g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、MnSO4·H2O0.05g/L、吐温801mL/L、琼脂粉15g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。

[0050] MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O2.6g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、MnSO4·H2O0.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。

[0051] 下述实施例中涉及的检测方法如下：
[0052] pH值的检测方法：称取5g泡菜样品，在泡菜样品中加入15mL蒸馏水后匀浆过滤，得到汁液；取5mL汁液，用pH计测定泡菜pH。
[0053] 总酸含量的检测方法：称取5g泡菜样品，在泡菜样品中加入15mL蒸馏水后匀浆过滤，得到汁液；取5mL汁液，参照国标GB/T12456—2008《食品中总酸的测定》测定泡菜总酸含量。
[0054] 乳酸菌活菌数的检测方法：称取5g泡菜样品，在泡菜样品中加入15mL蒸馏水后匀浆过滤，得到汁液；取5mL汁液，参照国标GB4789.35‑2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》测定泡菜乳酸菌活菌数。
[0055] 霉菌和酵母菌活菌数的检测方法：称取5g泡菜样品，在泡菜样品中加入15mL蒸馏水后匀浆过滤，得到汁液；取5mL汁液，用孟加拉红培养基对泡菜中的霉菌和酵母菌进行计数，根据霉菌酵母菌的形态特征不同进行区分，具体操作参照国标GB4789.15‑2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》。
[0056] 甘露醇含量的检测方法：
[0057] 称取5g泡菜样品，在泡菜样品中加入15mL蒸馏水后匀浆过滤，得到汁液；取1mL汁液，10000g离心10min后取上清液待用；取20μL上清液，在上清液中加入15μL浓度为0.2mg/mL的核糖醇作为内标物，得到样品；将样品在真空冷冻浓缩仪中干燥2h，待样品中水分完全挥发后进行衍生化处理，得到待测样品；取100μL待测样品，将待测样品加入到GC进样瓶中进行GC‑MS检测；由GC‑MS测得的谱图在NIST2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，用面积归一化法定量，得到泡菜样品中甘露醇的含量；
[0058] 其中，衍生化处理：将样品添加至离心管中，在离心管中加入80μL浓度为20mg/mL的甲氧胺盐酸盐溶液，将离心管在金属浴中37℃保温90min，在离心管中加入40μL含1％(v/v)三甲基氯硅烷的N‑甲基‑N‑(三甲基硅)‑三氟乙酰胺(MSTFA)，将离心管在金属浴中40℃保温30min，将离心管在10000g离心5min，得到待测样品；
[0059] 气相色谱条件：使用Rtx‑5MScapillarycolumn(30m×0.25mm×0.25μm)进行分离，进样体积为1μL，分流比为10:1，载气为氦气，流速为1mL/min，进样口温度为240℃，柱初始温度为70℃，以5℃/min升至230℃，以90℃/min升至320℃，保持5min。
[0060] 质谱条件：传输线和离子源温度分别为280℃和320℃，四级杆温度150℃，质谱扫描范围m/z33～600。
[0061] 二烯丙基二硫醚含量的检测方法：
[0062] 取5g泡菜样品，将泡菜样品加入20mL螺口进样瓶中后，在螺口进样瓶中加入2μL浓度为0.05mg/mL的庚酸甲酯的甲醇溶液作为内标，得到样品；将样品加入进样瓶中，将进样瓶于50℃下孵育5min，将萃取头(DVB/CAR/PDMS)插入到进样瓶中，先于50℃萃取30min，然后在240℃解吸附2min，最后进行GC‑MS分析；由GC‑MS测得的谱图在NIST2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，用面积归一化法定量，得到泡菜样品中二烯丙基二硫醚的含量；
[0063] 其中，气相色谱条件：使用Rtx‑WAX毛细管(30m×0.25mm×0.25μm)进行分离，进样体积为1μL，分流比为10:1，流速1mL/min，氦气为载气，进样口温度240℃，柱初始温度为40℃并保持3min，以5℃/min升温至130℃，保持5min，以25℃升至155℃，最后以5℃/min升至220℃并保持5min。

[0064] 质谱条件：传输线和离子源温度分别为220℃和230℃，离子化方式EI，四级杆温度150℃，质谱扫描范围m/z30～500。

[0065] 实施例1：耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7的筛选、鉴定和保存
[0066] 具体步骤如下：
[0067] 1、筛选
[0068] 以来源于重庆市的泡菜水为样本，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10‑6，然后‑4 ‑5 ‑6分别取100μL稀释倍数为10 、10 、10 的稀释液于MRS固体培养基上进行平板涂布，37℃倒置培养48h，观察并记录菌落形态；挑取MRS固体培养基上不同形态的菌落进行划线分离，经
37℃静置培养48h后，再次挑取MRS固体培养基上不同形态的单菌落进行划线分离，直至得到形态一致的纯的单菌落；观察单菌落的菌落形态，并对所得菌落进行镜检、革兰氏染色以及生理生化特性考察，选取菌落形态为小、圆、乳白、凸起、光滑，菌体形态呈球状，革兰氏染色结果为阳性，以及过氧化氢酶实验呈阳性的菌株，此处获得了两株可能为耐乙醇片球菌的菌株，将它们分别命名为VCQWZ3‑L7(VCQWZ3‑L7的菌落特征见图1、VCQWZ3‑L7的菌体特征见图2)和SCYAPCZN19；

[0069] 其中，镜检方法为：取洁净载玻片一张，在火焰上微微加热后冷却；待冷却后，在洁净载玻片中央部位滴加一小滴无菌水，用接种环在火焰旁挑取单菌落上的少量菌体与水混合；烧去接种环上多余菌体，在用接种环将菌体涂成直径1cm的均匀薄层；待洁净载玻片上的均匀薄层自然干燥后，在微火上加热3～4次固定；在涂片处滴加1～2滴结晶紫溶液，染色1min；用水轻轻洗去染液，用吸水纸轻轻吸去载玻片上水分；在涂片处滴加1～2滴碘液，染色1min，用水轻轻洗去染液，用吸水纸轻轻吸去载玻片上水分；在涂片处滴加1～2滴95％(v/v)乙醇溶液，脱色5～15s，用水轻轻冲洗，用吸水纸轻轻吸去载玻片上水分；在涂片处滴加1～2滴番红溶液，染色2min，干燥后以显微镜进行镜检以观察菌体形态；

[0070] 革兰氏染色方法参考教科书《工业微生物育种学》(作者：诸葛健)；
[0071] 生理生化特性考察方法参考教科书《常见细菌系统鉴定手册》(作者：东秀珠)。
[0072] 2、鉴定
[0073] 提取菌株VCQWZ3‑L7和SCYAPCZN19的基因组，将菌株VCQWZ3‑L7和SCYAPCZN19的16SrDNA进行扩增和测序(测序由华大基因进行，其中，菌株VCQWZ3‑L7的16SrDNA扩增的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，扩增所用引物为核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的27F和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示1492R)，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株VCQWZ3‑L7和SCYAPCZN19均为耐乙醇片球菌，分别命名为耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)VCQWZ3‑L7和耐乙醇片球菌(Pediococcus
ethanolidurans)SCYAPCZN19(耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7送至保藏机构保藏时重新编号为耐乙醇片球菌CCFM1136)。

[0074] 3、保存
[0075] 挑取耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7和耐乙醇片球菌SCYAPCZN19的单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养20～24h，得到菌液；取1mL菌液于保菌管中，6000rpm离心3min后弃去上清，菌泥重悬于30％(v/v)甘油溶液中置于‑80℃中保藏。
[0076] 实施例2：泡菜的生产
[0077] 具体步骤如下：
[0078] 将实施例1获得的耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7和耐乙醇片球菌SCYAPCZN19分别划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液分别按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；准备白萝卜100g、辣椒4g、蒜6g、姜6g、食盐6g、白砂糖4g和水100mL；将白萝卜、辣椒、蒜和姜清洗干净去除表皮杂质，用沸水瞬时热烫，用无菌水清洗3遍，切成约1cm×1cm块状，得到蔬菜块；将蔬菜块、食盐、白砂糖和水混合，得到泡菜原料；先将泡菜原料装入泡菜坛，然后将耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7和耐乙醇片球菌SCYAPCZN19培养得到的菌液分别按2％的接种量接种至泡菜原料中，再将泡菜坛密封，最后将泡菜坛于25℃下静置发酵96h，得到泡菜。
[0079] 发酵过程中，每隔24h对泡菜进行取样，检测泡菜的pH值(检测结果见图3)，以及，泡菜中总酸的含量(检测结果见图4)、乳酸菌的活菌数(检测结果见图5)、霉菌和酵母菌的总活菌数(检测结果见图6)。
[0080] 发酵96h时，对泡菜进行取样，检测泡菜中甘露醇的含量(检测结果见图7)以及二烯丙基二硫醚的含量(检测结果见图8)。
[0081] 由图3可知，与耐乙醇片球菌SCYAPCZN19相比，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7发酵得到的泡菜的pH下降较快，发酵48h时，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7发酵得到的泡菜的pH值下降至3.5，而耐乙醇片球菌SCYAPCZN19发酵得到的泡菜的pH值仅下降到3.85。

[0082] 由图4可知，与耐乙醇片球菌SCYAPCZN19相比，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7发酵得到的泡菜中总酸的含量较高，发酵96h时，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7发酵得到的泡菜中总酸的含量高达0.6g/100g，而耐乙醇片球菌SCYAPCZN19发酵得到的泡菜中总酸的含量仅有0.5g/100g。

[0083] 由图5可知，与耐乙醇片球菌SCYAPCZN19相比，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7在泡菜中的生长速度更快，发酵12h时，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7发酵得到的泡菜中乳酸菌的活菌数可高达8.5lgCFU/mL，而耐乙醇片球菌SCYAPCZN19发酵得到的泡菜中乳酸菌的活菌数仅有7.7lgCFU/mL。

[0084] 由图6可知，与耐乙醇片球菌SCYAPCZN19相比，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7抑制泡菜中霉菌和酵母菌的能力更强，发酵24h时，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7发酵得到的泡菜中霉菌和酵母菌的总活菌数从发酵前的5.5lgCFU/mL迅速降至1.6lgCFU/mL，而耐乙醇片球菌SCYAPCZN19发酵得到的泡菜中霉菌和酵母菌的总活菌数仍有3.8lgCFU/mL。
[0085] 由图7可知，与耐乙醇片球菌SCYAPCZN19相比，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7产甘露醇的能力更强，发酵96h时，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7发酵得到的泡菜中甘露醇的含量高达565.18mg/100g，而耐乙醇片球菌SCYAPCZN19发酵得到的泡菜中甘露醇的含量仅有
274.10mg/100g。

[0086] 由图8可知，与耐乙醇片球菌SCYAPCZN19相比，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7产二烯丙基二硫醚的能力更强，发酵96h时，耐乙醇片球菌VCQWZ3‑L7发酵得到的泡菜中二烯丙基二硫醚的含量高达793.10μg/kg，而耐乙醇片球菌SCYAPCZN19发酵得到的泡菜中二烯丙基二硫醚的含量仅有308.70μg/kg。
[0087] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

专利地区：江苏

专利申请日期：2020-08-14

专利公开日期：2022-05-10

专利公告号：CN111925962B