朱顶红组培繁育方法发明专利

朱顶红组培繁育方法

本发明公开了一种朱顶红组培繁育方法，包括以下步骤：(a)提供外植体：以基部带有鳞茎盘的鳞片为外植体；(b)不定芽诱导：将消毒后的所述外植体转移至诱导培养基中，培养25～30天获得不定芽苗；(c)增殖培养：c1、将所述不定芽苗先在固体培养基中进行继代培养；c2、培养3～4周后对步骤c1得到的种球进行切割，将切割体转入半固体培养基中进行培养；c3、培养3～4周后对步骤c2得到的种球进行切割，将切割体转入所述固体培养基；(d)移栽成苗：将增殖培养得到的幼苗移栽到基质中进行培养。

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202110571408.4

专利申请（专利权）人：广东省林业科学研究院
权利人地址：广东省广州市天河区广汕一路233号

专利发明（设计）人：廖焕琴,杨会肖,杨晓慧,徐放,陈新宇,潘文,朱报著,徐斌,张卫华

主权利要求:朱顶红组培繁育方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种朱顶红组培繁育方法。
背景技术
[0002] 朱顶红(Hippeastrum rutilum)，别名孤挺花、华胄兰等，为石蒜科(Amaryllidaceae)朱顶红属(Hippeastrum)多年生草本植物，原产于秘鲁巴西一带，花茎挺拔，花朵硕大，花色艳丽，观赏价值高，深受国内外消费者喜爱。相关研究表明朱顶红及其分离的化学成分具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等功效，药理作用丰富。
[0003] 朱顶红常用的繁殖方法主要有自然分球、扦插和播种等，但是繁殖速度慢，难以满足市场的需求。而采用组织培养技术进行离体快繁，具有繁殖系数高、成苗时间短和便于商品化和产业化生产的优势。近年来研究者利用朱顶红花梗和叶片等器官作为外植体成功获得无菌苗，且就培养基类型、生长调节物质含量等方面进行组培体系的优化。但朱顶红种球仍供不应求，组培效率仍有待提高，且内生菌污染、褐化、玻化问题是制约朱顶兰组培繁育效率的关键因素，现有技术未对解决方法进行详细阐述。因此探讨制约朱顶红快繁的关键因素，总结一套高效快速培育技术对朱顶红工厂化生产具有十分重要的意义。
发明内容
[0004] 基于此，有必要提供一种朱顶红组培繁育方法，解决传统的朱顶红组培繁育效率低的问题。
[0005] 本发明的目的在于提高一种朱顶红组培繁育方法，包括以下步骤：
[0006] (a)提供外植体：以基部带有鳞茎盘的鳞片为外植体；
[0007] (b)不定芽诱导：将消毒后的所述外植体转移至诱导培养基中，培养25～30天获得不定芽苗；
[0008] (c)增殖培养：
[0009] c1、将所述不定芽苗先在固体培养基中进行继代培养；
[0010] c2、培养3～4周后对步骤c1得到的种球进行切割，将切割体转入半固体培养基中进行培养；
[0011] c3、培养3～4周后对步骤c2得到的种球进行切割，将切割体转入所述固体培养基；
[0012] 所述固体培养基包括：MS培养基中添加2.0mg/L～2.5mg/L的6‑BA、25g/L～35g/L的蔗糖和5.5g/L～6.5g/L的卡拉胶；
[0013] 所述半固体培养基包括：1/2MS培养基中添加0.8mg/L～1.2mg/L的6‑BA、25g/L～35g/L的蔗糖和2.5g/L～3.5g/L的卡拉胶；

[0014] (d)移栽成苗：将增殖培养骤中得到的幼苗移栽到基质中进行培养。
[0015] 优选地，步骤c)还包括c4：
[0016] 将切割体转入所述固体培养基培养之后，然后继续交替进行切割、半固体培养培养、切割、固体培养基培养的步骤至少一次，且重复时可于半固体培养培养、切割、固体培养基培养的任意步骤终止并进入步骤d)。
[0017] 优选地，所述诱导培养基包括：MS培养基中添加3.5mg/L～4.5mg/L的6‑BA、25g/L～35g/L的蔗糖和5.5g/L～6.5g/L的卡拉胶。
[0018] 优选地，所述诱导培养基中包括40mg/L～60mg/LStr或90mg/L～110mg/LAmp。
[0019] 优选地，所述不定芽诱导的培养环境包括：培养温度22℃～24℃，光照强度3000lux～3500lux，每天的光照时间12h～16h。

[0020] 优选地，步骤c中在所述固体培养基的培养环境包括：培养温度22℃～24℃，光照强度3500lux～5000lux，每天的光照时间12h～16h。
[0021] 优选地，步骤c中在所述半固体培养基的培养环境包括：培养温度22℃～24℃，光照强度3500lux～5000lux，每天的光照时间12h～16h。
[0022] 优选地，步骤d所用的基质包括椰糠、泥炭土和蛭石，椰糠、泥炭土和蛭石的质量比为3:(0.8～1.2):(0.8～1.2)。
[0023] 优选地，步骤c3的切割方式为沿顶部向基部的方向。
[0024] 优选地，步骤c3的切割方式为二等分。
[0025] 优选地，步骤c之后不转入生根培养基中培养，直接进行移栽。
[0026] 本发明在继代培养和增殖培养时采用特定的固体培养基与半固体培养基交替培育的方法。该半固体培养基可促进球茎对营养物质的吸收，快速成苗，同时可稀释鳞茎切割后产生的次生代谢产物，从而有效缓解褐化反应；该固体培养基可降低半固体培养基培养时间过长而产生的玻化现象。通过该固体培养基与半固体培养基的交替培育，可促进球茎壮大，快速成苗，同时可有效解决鳞茎切割后产生的褐化反应和玻化现象，大大提高成苗率。在交替培养中伴随的切割方式使得繁育规模不断扩大，由原始的一例外植体繁育为最终的无数株幼苗，建立了快速成苗体系，效率高，周期短，有利于朱顶红的工业化大规模繁育。另外，相对于传统的朱顶红的组培方法，采用本发明的培育方法，在增殖培养之后不需要进行额外的生根培养即可将苗株进行移植培养，节省了步骤，节约了成本，提高了经济效益。
附图说明
[0027] 图1为本发明一实施例的朱顶兰组织培养体系的建立图，其中a为种球选用步骤；b为鳞片诱导(4周)步骤；c为增殖培养(4周)步骤；d为移栽成苗(8周)步骤；
[0028] 图2为本发明一实施例的移栽成苗步骤图；
[0029] 图3为本发明一实施例的移栽后生长状态图。
具体实施方式
[0030] 为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0031] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0032] 术语“外植体”，指的是植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。在继代培养时，将培养的组织切段移入新的培养基时，这种切段也称外植体。外植体通常选择生长健壮的无病虫的植株上正常的器官或组织，因为它代谢旺盛，再生能力强。

[0033] 术语“继代培养”，指的是继代培养是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。对来自于外植体所增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，也称为继代培养。
[0034] 术语“鳞茎”和“鳞片”，鳞茎为地下变态茎的一种。变态茎非常短缩，呈盘状，其上着生肥厚多肉的鳞叶(或称鳞片)，内贮藏极为丰富的营养物质和水分。能适应干旱炎热的环境条件。鳞茎也具顶芽和腋芽，可从其上发育出地上的花茎，开花结实。从鳞茎盘的下部可生出不定根，每年可从腋芽中形成一个或数个新的鳞茎，称为子鳞茎，可供繁殖用。
[0035] 术语“褐化”，褐化的现象是指在植物组织培养中，外植体由于自身分泌的酚类化合物的影响导致外植体褐变褐化，是植物组织培养中一种常见的现象，直接影响到组织培养能否取得成功。
[0036] 术语“玻化”，即玻璃化，是指试管苗呈半透明水渍状，叶片脆弱易破碎，发生玻璃化的试管苗，难以移栽成活。
[0037] 本发明实施例提供一种朱顶红组培繁育方法，包括以下步骤：
[0038] (a)提供外植体：以基部带有鳞茎盘的鳞片为外植体；
[0039] (b)不定芽诱导：将消毒后的所述外植体转移至诱导培养基中，培养25～30天获得不定芽苗；
[0040] (c)增殖培养：
[0041] c1、将所述不定芽苗先在固体培养基中进行继代培养；
[0042] c2、培养3～4周后对步骤c1得到的种球进行切割，将切割体转入半固体培养基中进行培养；
[0043] c3、培养3～4周后对步骤c2得到的种球进行切割，将切割体转入所述固体培养基；
[0044] 所述固体培养基包括：MS培养基中添加2.0mg/L～2.5mg/L的6‑BA、25g/L～35g/L的蔗糖和5.5g/L～6.5g/L的卡拉胶；
[0045] 所述半固体培养基包括：1/2MS培养基中添加0.8mg/L～1.2mg/L的6‑BA、25g/L～35g/L的蔗糖和2.5g/L～3.5g/L的卡拉胶；

[0046] (d)移栽成苗：将增殖培养步骤中得到的幼苗移栽到基质中进行培养。
[0047] 本发明在继代培养和增殖培养时采用特定的固体培养基与半固体培养基交替培育的方法。该半固体培养基可促进球茎对营养物质的吸收，快速成苗，同时可稀释鳞茎切割后产生的次生代谢产物，从而有效缓解褐化反应(在植物的组织培养中，容易出现褐化现象，褐化是影响组培成功的关键难题。褐化是由于外植体在切口释放出的酚类物质氧化使培养基变褐，随之外植体也会变褐，进而导致其死亡)；该固体培养基可降低半固体培养基培养时间过长而产生的玻化现象。通过该固体培养基与半固体培养基的交替培育，可促进球茎壮大，快速成苗，同时可有效解决鳞茎切割后产生的褐化反应和玻化现象，大大提高成苗率。
[0048] 在交替培养中伴随的切割方式使得繁育规模不断扩大，由原始的一例外植体繁育为最终的无数株幼苗，建立了快速成苗体系，效率高，周期短，有利于朱顶红的工业化大规模繁育。
[0049] 另外，相对于传统的朱顶红的组培方法，采用本发明的培育方法，在增殖培养之后不需要进行额外的生根培养即可将苗株进行移植培养，节省了步骤，节约了成本，提高了经济效益。
[0050] 优选地，步骤c)还包括c4：
[0051] 将切割体转入所述固体培养基培养之后，然后继续交替进行切割、半固体培养培养、切割、固体培养基培养的步骤至少一次(例如交替重复次数为2次、3次、4次……n次)，且重复时可于半固体培养培养、固体培养基培养的任意步骤终止并进入步骤d)。
[0052] 步骤a中，外植体的获得方法为以健康无病害的种球为材料，减去根系，将种球鳞茎上部约1/3～1/2削去，剥除外层皱褶、不饱满的鳞片，然后沿种球径向将种球分割开。
[0053] 在一些实施方式中，外植体选用的鳞片的宽度大于或等于1cm。
[0054] 在一些实施方式中，步骤b中，不定芽诱导步骤的诱导培养基包括：MS培养基中添加3.5mg/L～4.5mg/L的6‑BA、25g/L～35g/L的蔗糖和5.5g/L～6.5g/L的卡拉胶。该诱导培养基为固体培养基。
[0055] 在一些实施方式中，所述诱导培养基中包括链霉素(Str)或氨苄霉素(Amp)。优选的，Str浓度为40mg/L～60mg/L。优选地，Amp浓度为90mg/L～110mg/L。通过添加该抗生素可明显降低诱导过程中的内生菌污染，提高诱导效果。
[0056] 在一些实施方式中，所述不定芽诱导的培养环境包括：培养温度22℃～24℃，光照强度3000lux～3500lux，每天的光照时间12h～16h。可选的，不定芽诱导的光照强度可以为3000lux、3100lux、3200lux、3300lux、3400lux、3500lux。

[0057] MS培养基为传统的可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养的培养基组分。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。MS培养基含有大量元素、微量元素、铁盐等组分，可以为任意商用的MS培养基或者自行配置，其具体组成不再赘述。
[0058] 而1/2MS培养基是将MS培养基的大量元素减半其他不变而配置的培养基，这主要是降低无机盐浓度，作用和MS培养基大致相同只是不同植物不同要求而已。
[0059] 优选的，步骤c中在所述固体培养基的培养环境包括：培养温度22℃～24℃，光照强度3500lux～5000lux，每天的光照时间12h～16h。可选的，在该固体培养基中的光照强度可以为3500lux、3600lux、3700lux、3800lux、3900lux、4000lux、4100lux、4200lux、4300lux、4400lux、4500lux、4600lux、4700lux、4800lux、4900lux、5000lux。

[0060] 在一些实施方式中，步骤c中在所述半固体培养基的培养环境包括：培养温度22℃～24℃，光照强度3500lux～5000lux，每天的光照时间12h～16h。可选的，在该半固体培养基中的光照强度可以为3500lux、3600lux、3700lux、3800lux、3900lux、4000lux、4100lux、4200lux、4300lux、4400lux、4500lux、4600lux、4700lux、4800lux、4900lux、5000lux。

[0061] 在固体培养基和半固体培养基中的光照条件可以相同或不同。
[0062] 发明人发现，采用本发明的繁育方式，过弱光照下朱顶兰易玻化，过强光照下朱顶兰生长受到抑制，不萌芽，且叶片由叶尖变枯黄，植株随培养时间延长甚至死亡。因此朱顶兰组培苗在强光照3500‑5000lux下增殖率高，且生长状况良好。
[0063] 在一些实施方式中，步骤c3的切割方式为沿顶部向基部的方向，采用该种切割方式，能够保留基部的鳞茎盘，并且使得切割得到的鳞片的器官更完整，有利于组织的更快愈合和更优生长。
[0064] 在一些实施方式中，步骤c3的切割方式为分隔为2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份。优选的，切割为2份、3份、4份。更有选为切割为2份。最优选为切割为二等份。

[0065] 在一些实施方式中，步骤c之后不转入生根培养基中培养，直接进行移栽。
[0066] 在一些实施方式中，步骤d所用的基质包括椰糠、泥炭土和蛭石，椰糠、泥炭土和蛭石的质量比为3:(0.8～1.2):(0.8～1.2)。
[0067] 以下为具体实施例。
[0068] 实施例1：朱顶兰组织培养体系的建立(图1)实施步骤：
[0069] 1、外植体准备：
[0070] 以直径5cm左右、健壮无病害的种球为材料，用细毛刷去除材料表面的泥土，剪去根系，蘸取洗洁精清洁，流水冲洗30min，用滤纸吸干水分放置于超净工作台备用。接种前先用75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，然后用0.1％的升汞消毒8min，无菌水冲洗3次。将种球鳞茎上部约1/2用消毒后的手术刀削去，剥除外层1‑3层皱褶、不饱满的鳞片，然后沿种球径向将种球分割开，每组宽度至少1cm，且基部必须带有鳞茎盘。
[0071] 2、不定芽诱导：
[0072] 选择MS+4.0mg/L6‑BA+30g/L蔗糖+6.0g/L卡拉胶作为诱导培养基，接种后放入23℃、光照强度3500Lux、每天16h光照的条件下培养。2周后即可观察到新芽萌出，且叶色鲜绿，第4周芽体抽长，种球壮大。
[0073] 诱导过程中部分材料出现不同程度的内生菌污染现象，试验采用链霉素(Str)、氨苄霉素(Amp)和利福平(Rif)3种抗生素及不同浓度组合对朱顶兰内生菌进行控制。具体处理组合及生长情况如下表1。结果表明，在培养基中添加Str50mg/L或Amp100mg/L时无内生菌生长，处理效果最好。
[0074] 表1不同抗生素种类、浓度及组合下朱顶兰生长状态
[0075]组号 处理(mg/L) 菌落生长情况 植株生长情况
1 CK ++++ 生长良好，增殖缓慢
2 Str25 ++‑‑ 生长良好
3 Str50 ‑‑‑‑ 生长良好，增殖良好
4 Str100 ‑‑‑‑ 叶尖黄，长势差
5 Amp25 ++‑‑ 生长良好
6 Amp50 +‑‑‑ 生长良好
7 Amp100 ‑‑‑‑ 生长良好，增殖良好
8 Rif25 ++++ 生长良好
9 Rif50 ++‑‑ 生长良好
10 Rif100 +‑‑‑ 生长良好，但不增殖
11 Str25+Amp25 +‑‑‑ 生长良好
12 Str25+Rif25 ++‑‑ 生长良好
13 Rif25+Amp25 ++‑‑ 生长良好

[0076] 注：表1中，+代表有内生菌；‑代表无内生菌。
[0077] 3、增殖培养：
[0078] 采用固体培养基与半固体培养基交替使用的方法进行增殖培养。固体培养基为MS+2.0mg/L6‑BA+30g/L蔗糖+6.0g/L卡拉胶，半固体培养基为1/2MS+1.0mg/L6‑BA+30g/L蔗糖+3.0g/L卡拉胶。采用固体‑固体、固体‑半固体、半固体‑液体、液体‑液体培养基四种交替培养方式(表2)，结果表明固体‑半固体交替培养模式下生长良好，增殖系数可达4.0，丛芽多，叶片鲜绿，球茎粗壮。在固体培养中培养3‑4周后，种球切割为二等分转入半固体培养基，培养3‑4周后，种球切割为二等分转入固体培养基。如此反复，固体和半固体培养基交替使用，效果最佳。
[0079] 光照对植株生长具有重要作用。将朱顶红置于2000，3500，5000，6500，8000，10000lux下培养，生长状态差异明显(表3)。结果表明过弱光照下朱顶兰易玻化，过强光照下朱顶兰生长受到抑制，不萌芽，且叶片由叶尖变枯黄，植株随培养时间延长甚至死亡。因此朱顶兰组培苗在强光照3500‑5000lux下增殖率高，且生长状况良好。

[0080] 表2不同培养基内朱顶兰生长状态
[0081] 培养方式 增殖系数 生长状态固体+固体 2.25 长势良好，叶片舒展，丛芽较少，部分苗褐化，根系着生
固体+半固体 4.00 长势良好，叶片舒展，丛芽多，球茎粗壮
半固体+液体 1.44 部分植株产生玻化现象，丛芽较多，叶片颜色深，叶缘卷曲液体+液体 1.00 植株玻化现象明显，丛芽少，叶片颜色深，叶缘卷曲

[0082] 表3不同光照下朱顶兰生长状态
[0083]光强/lux 生长状态
2000(普通培养室) 增殖较好，长势良好，叶片舒展，部分苗玻化
3500(普通培养室) 增殖快，长势良好，叶片舒展
5000(玻璃房低层) 增殖快，长势良好，叶片舒展
6500(玻璃房中层) 增殖较快，长势良好，叶片舒展
8000(玻璃房中高层) 增殖慢，叶片黄化
10000(玻璃房高层) 不增殖，叶片黄化，部分植株死亡

[0084] 4、移栽成苗：
[0085] 采用基质培进行瓶外生根的方法。经继代培养后种球无需进行生根培养即可直接移栽，移栽成活率可达100％，缩短育苗周期，节省育苗成本。
[0086] 育苗基质用4.5*8cm无纺布袋，基质配方为椰糠︰泥炭土︰蛭石＝3︰1︰1，移栽前一周将基质淋透水，施用500倍多菌灵溶液进行消毒。10月‑次年4月大棚室内移栽可不用覆盖透明膜和阴网，其他月份移栽时应加盖遮光率为70％的阴网，及时浇水保持基质湿润。育苗袋置于离地的塑料托盘，苗木进行空气切根，可有效避免苗木穿根。
[0087] 移栽1周后种球长出1‑2条新根，用0.2％的兰花专用肥喷施叶面，每周一次。第4周植株直立挺拔，抽出新叶，参阅图2，从左至右，依次为第四周种球直径约1.0cm，第6周种球直径约1.5cm，第8周种球直径约2.0cm，即可出圃。
[0088] 污染的增殖幼苗可经500倍多菌灵消毒10min，自来水冲洗后直接移栽入袋，减少瓶苗损耗，且成活率不因污染受影响。
[0089] 继代苗因增殖状态不同移栽后可发育为单球或多球(2‑8个)，多球壮大后可分株，大大提高育苗效率，参阅图3，从左至右依次为2、4、8个球茎。
[0090] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0091] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

专利地区：广东

专利申请日期：2021-05-25

专利公开日期：2022-06-07

专利公告号：CN113243295B