一种富含黄芪甲苷的黄芪发酵物及其制备方法与应用

一种富含黄芪甲苷的黄芪发酵物及其制备方法与应用

本发明属于植物提取物药物研究技术领域，具体涉及一种富含黄芪甲苷的黄芪发酵提取物，并进一步公开其制备方法与应用。本发明所述黄芪发酵提取物在传统枯草芽孢杆菌发酵黄芪工艺的基础上，通过添加解淀粉芽孢杆菌进行共同发酵，有效提高了黄芪发酵提取物中活性成分的含量，尤其是黄芪甲苷的含量得到明显提高，可获得富含黄芪甲苷的黄芪发酵提取物。

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210710955.0

专利申请（专利权）人：山东中医药大学附属医院
权利人地址：山东省济南市(历下区)文化西路42号

专利发明（设计）人：王宇,李超,李静蔚,姜月华

主权利要求:一种富含黄芪甲苷的黄芪发酵物及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物提取物药物研究技术领域，具体涉及一种富含黄芪甲苷的黄芪发酵提取物，并进一步公开其制备方法与应用。
背景技术
[0002] 黄芪(RadixAstragali)是常用中药之一，是豆科植物膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fischer)Bunge和蒙古黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bungevar.mongholicus(Bunge)P.K.Hsiao的干燥根。黄芪的药用迄今已有2000多年的历史，黄芪性甘、微温，归肺、脾、肝、肾经，具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。

[0003] 黄芪甲苷(AstragalosidesⅣ，ASI)是从黄芪中分离得到的一种具有多种药理活性的皂苷类化合物，为黄芪制剂质量鉴定的指标成分。研究显示，黄芪甲苷在心血管、免疫、神经、消化、泌尿、循环和内分泌系统等均具有广泛的药理作用。据报道，黄芪甲苷能减轻脑缺血再灌注引起的血脑屏障渗透性增加；对缺血性脑损伤具有保护作用；通过调节癌基因的表达发挥抗癌活性；对糖尿病小鼠具有降血糖作用；具有强的抗乙肝病毒活性；能有效的抑制或逆转PS诱导的小鼠模型的肝纤维化；其药制剂被开发为心肌保护剂用于冠心病心绞痛的治疗。但黄芪的工业提取中也发现，黄芪甲苷在黄芪中含量极低，并且受产地和季节影响较大，影响了黄芪提取物的效用。
[0004] 如中国专利CN102559828A公开了一种通过微生物转化黄芪总皂苷制备黄芪甲苷的方法，该方法以黄芪总皂苷为底物，在细菌、霉菌或酵母菌为微生物作用下，通过含有去乙酰酶和糖苷酶的微生物水解黄芪总皂苷中的乙酰基和糖基，提高黄芪甲苷含量。该方法可有效提高发酵液中黄芪甲苷的含量。但是，该方法需要以黄芪总皂苷为底物进行微生物转化处理，还需要提取并纯化获得黄芪总皂苷的步骤，工艺步骤较为复杂。因此，本领域技术人员期待开发一种可直接基于黄芪为底物进行发酵并获得高黄芪甲苷含量发酵产物的方法，对于黄芪的应用及开发具有积极的意义。
发明内容
[0005] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种富含黄芪甲苷的黄芪发酵提取物的制备方法，所述方法以黄芪为底物进行发酵，可获得高黄芪甲苷含量的发酵提取物；
[0006] 本发明所要解决的第二个技术问题在于提供所述富含黄芪甲苷的黄芪发酵提取物用于制备预防及治疗心血管疾病药物的用途。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明所述一种富含黄芪甲苷的黄芪发酵提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0008] (1)取粉碎后的黄芪粉末配制发酵培养基，备用；
[0009] (2)取保存的枯草芽孢杆菌接种至第一种子液培养基中进行培养，得到第一种子液，备用；
[0010] (3)取保存的解淀粉芽孢杆菌接种至第二种子液培养基中进行培养，得到第二种子液，备用；
[0011] (4)分别将所述第一种子液和第二种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，收集发酵产物，即得。
[0012] 具体的，所述步骤(1)中，所述发酵培养基包括如下组分：黄芪粉150‑250g/L、葡萄糖30‑80g/L、蛋白胨30‑80g/L、鸡蛋清5‑15g/L、磷酸氢二钾0.4‑0.6g/L、乙酸钠0.8‑1.2g/L，pH7.0‑7.2。
[0013] 优选的，所述发酵培养基包括如下组分：黄芪粉200g/L、葡萄糖50g/L、蛋白胨50g/L、鸡蛋清10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、乙酸钠1g/L，pH7.0‑7.2。
[0014] 具体的，所述步骤(2)中，所述第一种子液培养基包括如下组分：葡萄糖20‑40g/L、牛肉膏10‑20g/L、蛋白胨5‑15g/L、氯化钠0.5‑1.0g/L、磷酸二氢钠0.5‑1.0g/L，pH7.0‑7.2。
[0015] 优选的，所述第一种子液培养基包括如下组分：葡萄糖30g/L、牛肉膏15g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠0.8g/L、磷酸二氢钠0.8g/L，pH7.0‑7.2。
[0016] 具体的，所述步骤(2)中，所述第一种子液培养步骤的温度为32‑38℃，100‑150rpm培养12‑24h。
[0017] 具体的，所述步骤(3)中，所述第二种子液培养基包括如下组分：葡萄糖20‑40g/L、牛肉膏10‑20g/L、尿素5‑15g/L、磷酸氢二钾0.5‑1.0g/L、磷酸二氢钾0.5‑1.0g/L，pH7.0‑7.2。

[0018] 优选的，所述第二种子液培养基包括如下组分：葡萄糖30g/L、牛肉膏15g/L、尿素10g/L、磷酸氢二钾0.8g/L、磷酸二氢钾0.8g/L，pH7.0‑7.2。

[0019] 具体的，所述步骤(3)中，所述第二种子液培养步骤的温度为22‑28℃，50‑100rpm培养24‑36h。
[0020] 具体的，所述步骤(4)中，所述第一种子液和所述第二种子液基于所述发酵液的接种量彼此独立的为5‑15v/v％；
[0021] 优选的，所述第一种子液和所述第二种子液基的接种量比例为2：1。
[0022] 具体的，所述步骤(4)中，所述发酵培养步骤的温度为30‑32℃，培养时间为48‑72h。

[0023] 本发明还公开了由所述方法制备得到的富含黄芪甲苷的黄芪发酵提取物。
[0024] 本发明还公开了所述富含黄芪甲苷的黄芪发酵提取物用于制备预防及治疗心血管疾病药物的用途。
[0025] 本发明所述黄芪发酵提取物在传统枯草芽孢杆菌发酵黄芪工艺的基础上，通过添加解淀粉芽孢杆菌进行共同发酵，有效提高了黄芪发酵提取物中活性成分的含量，尤其是黄芪甲苷的含量得到明显提高，由于解淀粉芽孢杆菌具有较强的产酶特征，推测解淀粉芽孢杆菌利用产酶体系辅助枯草芽孢杆菌发酵黄芪的代谢，可获得富含黄芪甲苷的黄芪发酵提取物；而解淀粉芽孢杆菌自身发酵代谢黄芪产黄芪甲苷的效率并不理想，也从侧面证明了其有助于辅助枯草芽孢杆菌发酵黄芪的性能和效果。
[0026] 本发明所述黄芪发酵提取物中黄芪甲苷的含量较高，可用于制备治疗心血管疾病的药物制剂。
具体实施方式
[0027] 制备例1
[0028] 本制备例用于获得第一种子液，所述第一种子液的组成包括如下组分：葡萄糖30g/L、牛肉膏15g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠0.8g/L、磷酸二氢钠0.8g/L，pH7.0‑7.2，121℃灭菌。

[0029] 取斜面保存的枯草芽孢杆菌ATCC6633一环，接种至上述第一种子液中，摇瓶装液量40ml/250ml，置于35℃、150rpm培养过夜，得到第一种子液。
[0030] 制备例2
[0031] 本制备例用于获得第二种子液，所述第二种子液包括如下组分：葡萄糖30g/L、牛肉膏15g/L、尿素10g/L、磷酸氢二钾0.8g/L、磷酸二氢钾0.8g/L，pH7.0‑7.2，121℃灭菌。
[0032] 取斜面保存的解淀粉芽孢杆菌ATCC23350一环，接种至上述第二种子液中，摇瓶装液量40ml/250ml，置于25℃、80rpm培养24h。
[0033] 实施例1
[0034] 取清洗、干燥后的黄芪进行粉碎，得到黄芪粉，并按照如下成分配制所需发酵培养基：黄芪粉200g/L、葡萄糖50g/L、蛋白胨50g/L、鸡蛋清10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、乙酸钠1g/L，pH7.0‑7.2，121℃灭菌。

[0035] 分别将上述制备例1‑2中获得的第一种子液和第二种子液，按照10v/v％和5v/v％的接种量，接种至上述发酵培养基中，于30℃、100rpm进行培养72h，收集发酵产物，即得。
[0036] 实施例2
[0037] 取清洗、干燥后的黄芪进行粉碎，得到黄芪粉，并按照如下成分配制所需发酵培养基：黄芪粉200g/L、葡萄糖50g/L、蛋白胨50g/L、鸡蛋清10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、乙酸钠1g/L，pH7.0‑7.2，121℃灭菌。

[0038] 分别将上述制备例1‑2中获得的第一种子液和第二种子液，按照10v/v％和10v/v％的接种量，接种至上述发酵培养基中，于30℃、100rpm进行培养72h，收集发酵产物，即得。
[0039] 实施例3
[0040] 取清洗、干燥后的黄芪进行粉碎，得到黄芪粉，并按照如下成分配制所需发酵培养基：黄芪粉200g/L、葡萄糖50g/L、蛋白胨50g/L、鸡蛋清10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、乙酸钠1g/L，pH7.0‑7.2，121℃灭菌。

[0041] 分别将上述制备例1‑2中获得的第一种子液和第二种子液，按照10v/v％和15v/v％的接种量，接种至上述发酵培养基中，于30℃、100rpm进行培养72h，收集发酵产物，即得。
[0042] 对比例1
[0043] 本对比例所述黄芪发酵提取物的制备方法同实施例1，其区别仅在于，仅接种所述枯草芽孢杆菌进行相同条件的发酵。
[0044] 对比例2
[0045] 本对比例所述黄芪发酵提取物的制备方法同实施例1，其区别仅在于，仅接种所述解淀粉芽孢杆菌进行相同条件的发酵。
[0046] 对比例3
[0047] 本对比例所述黄芪发酵提取物的制备方法同实施例1，其区别仅在于，所述发酵培养基中不添加所述鸡蛋清，而加入等量的牛肉膏。
[0048] 实验例
[0049] 本实验例分别对上述实施例1‑3及对比例1‑3中收集的发酵产物中的黄芪甲苷含量进行检测，并以发酵前所述发酵培养基中黄芪甲苷的含量为对照，检测结果见下表1。
[0050] 黄芪甲苷的测定方法：高效液相色谱法。取发酵产物10g，60℃水浴蒸干，放入索氏提取器中，加甲醇40mL，冷浸过夜；再加甲醇适量，80℃水浴加热回流4h，提取液浓缩至干；残渣加水10mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40mL，弃去氨液，正丁醇层挥干后用甲醇定容至5mL，供测试用。另取黄芪甲苷配成0.5mg/mL浓度，为对照样品。色谱条件及系统适用性：经预试，选择C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈：水＝32：68进行等度洗脱，检测波长为202nm，流速为0.8mL/min，柱温30℃，进样量为10μL，采用外标法定量。

[0051] 表1发酵产物中黄芪甲苷的含量
[0052] 编号 黄芪甲苷含量(mg/g)实施例1 0.140
实施例2 0.142
实施例3 0.145
对比例1 0.078
对比例2 0.054
对比例3 0.122
对照 0.043

[0053] 可见，本发明所述黄芪发酵提取物在传统枯草芽孢杆菌发酵黄芪工艺的基础上，通过添加解淀粉芽孢杆菌进行共同发酵，有效提高了黄芪发酵提取物中活性成分尤其是黄芪甲苷的含量。
[0054] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

专利地区：山东

专利申请日期：2022-06-22

专利公开日期：2023-11-28

专利公告号：CN115154498B