一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法和应用

一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法和应用

本发明公开一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。本发明提供的重组菌在酿酒酵母中对β‑酮酰辅酶A硫解酶基因进行敲除或失活，或降低该基因的表达或活性，可以产生甲基酮。配合过表达内源酰基辅酶A氧化酶基因，或(3R)‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶/2‑烯酰辅酶A水合酶2基因，或酰基辅酶A硫酯酶基因，或脂酰辅酶A转运蛋白编码基因，或外源β‑酮酸脱羧酶基因中的一种或多种，大大提高产生甲基酮的能力。进一步配合过表达外源氧化酶基因，或水合酶基因，或脱氢酶基因，或硫酯酶基因，或脱羧酶基因中的一种或多种，可进一步提高产生甲基酮的能力。本发明通过实验证明获得的重组菌具有较大实际应用价值。

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210439994.1

专利申请（专利权）人：中国科学院天津工业生物技术研究所
权利人地址：天津市滨海新区空港经济区西七道32号

专利发明（设计）人：戴宗杰,张歌,张媛媛,张超,王钦宏

主权利要求:一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。
背景技术
[0002] 甲基酮是一类甲基直接与羰基相连的化合物的统称，包括丙酮，2‑丁酮，2‑戊酮，2‑己酮，2‑庚酮，2‑辛酮，2‑壬酮，2‑癸酮，2‑十一烷酮，2‑十二烷酮，2‑十三烷酮，2‑十四烷酮，2‑十五烷酮，2‑十六烷酮，2‑十七烷酮，2‑十八烷酮，2‑十九烷酮，2‑二十烷酮，等等。甲基酮具有多种重要的天然和商业作用，其在植物中可以充当信息素和天然杀虫剂，而商业化生产的甲基酮可作为香料，为精油提供香气，并在奶酪和其他乳制品中起到调味剂的作用，也可作为化学合成中间体或者柴油调和剂。

[0003] 利用合成生物学原理，通过对脂肪酸β‑氧化途径进行遗传改造，已经在多种微生物中实现了甲基酮的重组生产。2012年Goh等(GohEB,BaidooEE,KeaslingJD,BellerHR.Engineeringofbacterialmethylketonesynthesisforbiofuels.ApplEnvironMicrobiol2012,78(1):70‑80.)在工程化的大肠杆菌DH1菌株中对β‑氧化途径进行了重新设计，过表达了来源于Micrococcusluteus的酰基辅酶A氧化酶基因ACO，大肠杆菌自身编码脂肪酸氧化复合体α亚基的FadB基因以及编码天然硫酯酶的FadM基因，证明了利用葡萄糖可以生产链长为C11‑C15的甲基酮。2013年（MüllerJ,MacEachranD,BurdH,SathitsuksanohN,BiC,YehYC,LeeTS,HillsonNJ,ChhabraSR,SingerSW,BellerHR.EngineeringofRalstoniaeutrophaH16forautotrophicandheterotrophicproductionofmethylketones.ApplEnvironMicrobiol2013,
79(14):4433‑4439.），该甲基酮合成途径被引入到RalstoniaeutrophaH16菌株中，首次进行了自养型细菌以CO2作为唯一碳源生产甲基酮的报道。2018年，Hanko等人(HankoEKR,DenbyCM,SànchezINoguéV,LinW,RamirezKJ,SingerCA,BeckhamGT,
KeaslingJD.Engineeringβ‑oxidationinYarrowialipolyticaformethylketoneproduction.MetabEng2018,48:52‑62.)将同样的甲基酮合成途径导入解脂耶氏酵母中，使其在过氧化物酶体中表达，实现了C13‑C23甲基酮在真菌中的重组生产。

[0004] 酿酒酵母作为模式菌株，遗传背景清晰，可操作性强，具有良好的鲁棒性和稳定性。与原核生物相比，酿酒酵母具有蛋白质翻译后修饰功能，并且具有过氧化物酶体、内质网、高尔基体等细胞器，可以为目标产物的合成提供合适的内环境，实现亚细胞代谢工程改造。但针对酿酒酵母生产甲基酮的研究不多，例如文献（ZhuZ,ZhouYJ,KrivoruchkoA,GriningerM,ZhaoZK,NielsenJ.ExpandingtheproductportfoliooffungaltypeIfattyacidsynthases.NatChemBiol2017,13(4):360‑362.），文中主要是对I型脂肪酸合成酶进行改造，通过删除或融合不同来源的结构域，拓宽产物谱，其中获得的酿酒酵母甲基酮的产量最高为10μg/gDCW，主要包括2‑十一烷酮，2‑十三烷酮和2‑十五烷酮。
发明内容
[0005] 本发明研究表明，在酿酒酵母中敲除β‑酮酰辅酶A硫解酶基因POT1，可以生产甲基酮；尤其是研究表明，强化过氧化物酶体途径，即过表达（优选为内源的）酰基辅酶A氧化酶基因POX1，(3R)‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶/2‑烯酰辅酶A水合酶2基因POX2，酰基辅酶A硫酯酶基因TES1，脂酰辅酶A转运蛋白编码基因PXA1/PXA2和外源β‑酮酸脱羧酶基因ADC，可以提高甲基酮产量；同时引入细胞质途径即过表达外源酰基辅酶A氧化酶基因ACO，烯酰辅酶A水合酶基因HTD，3‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶基因KR，酰基辅酶A硫酯酶基因FadM和β‑酮酸脱羧酶基因MKS1，可进一步提高甲基酮产量。其中，本发明筛选了不同来源的酶基因，重新设计组合了一条新的细胞质途径。其中HTD和KR的使用是本发明发现的。MKS1在大肠杆菌中也是没有作用的，但是本发明发现其在酿酒酵母中的脱羧作用很明显，能显著提高甲基酮产量。由此完成本发明。
[0006] 因此，本发明的目的是提供生产甲基酮的酿酒酵母重组菌株及其构建方法。
[0007] 具体来说，本发明提供一种生产甲基酮的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，在酿酒酵母中对β‑酮酰辅酶A硫解酶基因POT1进行敲除或失活，或降低该基因的表达或活性。
[0008] 优选地，进一步在所述酿酒酵母中过表达内源酰基辅酶A氧化酶基因POX1，或(3R)‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶/2‑烯酰辅酶A水合酶2基因POX2，或酰基辅酶A硫酯酶基因TES1，或脂酰辅酶A转运蛋白编码基因PXA1/PXA2，或外源β‑酮酸脱羧酶基因ADC中的一种或多种。优选地，所述外源β‑酮酸脱羧酶基因来源于Clostridiumacetobutylicum，更优选地其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

[0009] 更优选地，进一步在所述酿酒酵母中过表达外源酰基辅酶A氧化酶基因ACO，或烯酰辅酶A水合酶基因HTD，或3‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶基因KR，或酰基辅酶A硫酯酶基因FadM，或β‑酮酸脱羧酶基因MKS1中的一种或多种。
[0010] 优选地，所述外源酰基辅酶A氧化酶基因ACO来源于Micrococcusluteus，更优选地其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
[0011] 所述外源烯酰辅酶A水合酶基因HTD的氨基酸序列包括如SEQIDNO：7所示的氨基酸序列；
[0012] 所述外源3‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶基因KR的氨基酸序列包括如SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。
[0013] 所述外源烯酰辅酶A水合酶基因HTD来源于Yarrowialipolytica，更优选地其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；
[0014] 所述外源3‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶基因KR来源于Yarrowialipolytica，更优选地其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
[0015] 另外优选地，进一步将所述酿酒酵母中的半乳糖调节基因GAL80进行敲除或失活，或降低该基因的表达或活性。
[0016] 在一个具体实施方式中，所述酿酒酵母的出发菌株的基因型为MATaMAL2‑8cSUC2ura3‑52。
[0017] 在另一个具体实施方式中，所述酿酒酵母的出发菌株的基因型为CEN.PK113‑5D。
[0018] 本发明还提供所述的构建方法获得的生产甲基酮的重组酿酒酵母。
[0019] 本发明进一步所述的重组酿酒酵母在生产甲基酮中的应用。
[0020] 本发明提供的重组菌在酿酒酵母中对β‑酮酰辅酶A硫解酶基因POT1进行敲除或失活，或降低该基因的表达或活性，可以产生甲基酮。进一步配合过表达酰基辅酶A氧化酶基因POX1，或(3R)‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶/2‑烯酰辅酶A水合酶2基因POX2，或酰基辅酶A硫酯酶基因TES1，或脂酰辅酶A转运蛋白编码基因PXA1/PXA2，或外源β‑酮酸脱羧酶基因ADC中的一种或多种，大大提高产生甲基酮的能力。本发明通过实验证明表明所获得的重组菌具有较大实际应用价值。
附图说明
[0021] 图1为重组菌的甲基酮产量。
具体实施方式
[0022] 实施例一、DNA片段及gRNA质粒的构建
[0023] 本发明中所使用的PCR扩增体系及扩增程序如下：
[0024] PCR扩增体系：使用PrimeSTARHSDNApolymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PSBuffer10μL，dNTPMix4μL，引物F和R各1μL，DNA模板1μL，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。
[0025] PCR扩增程序：98℃预变性1分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸x分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。PrimeSTARHSDNApolymerase的扩增速率为1kb/分钟，故x视片段长度而定。
[0026] 一、Cas9整合元件的构建
[0027] Cas9及标记基因KanMX均为人工合成的序列，已按照酿酒酵母的密码子偏好性进行优化，Cas9（含核定位信号序列）的序列同GenBank:KY825143.1(Range2647‑6783)，KanMX序列同GenBank:MN555460.1(Range3324‑4133)。启动子PTEF和终止子TTEF和TCYC均扩增自酿酒酵母基因组，其在GenBank中的序列分别为CP020138.1(Range700422‑700824)，CP014738.1(Range114659‑114923)和CP063267.1(Range660625‑660861)。
[0028] （1）Cas9表达盒的构建
[0029] 以酿酒酵母的基因组为模板进行PCR，分别扩增PTEF和TCYC片段。同时，用引物Cas9‑F和Cas9‑R扩增Cas9基因。利用引物PTEF‑F和TCYC‑R进行重叠PCR，将片段PTEF、TCYC和Cas9进行融合，获得Cas9表达盒PTEF‑Cas9‑TCYC。所用引物如下：
[0030] PTEF‑F：atagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttcc
[0031] PTEF‑R：ctagaaaacttagattagattgctatgctttctttctaatg
[0032] TCYC‑F：gtcatgtaattagttatgtcacgcttacattcac
[0033] TCYC‑R：agagtaaaaaaggagtagaaacattttgaagctatcttcgagcgtcccaaaaccttctc[0034] Cas9‑F：cattagaaagaaagcatagcaatctaatctaagttttctagatggacaagaagtactccattgggc
[0035] Cas9‑R：gtgaatgtaagcgtgacataactaattacatgactcacaccttcctcttcttcttgggg。
[0036] （2）KanMX表达盒的构建
[0037] 以CEN.PK113‑5D基因组为模板进行PCR，分别扩增PTEF和TTEF片段。用引物KanMX‑F和KanMX‑R扩增KanMX基因。利用引物PTEF‑F和TTEF‑R进行重叠PCR，将片段PTEF、TTEF和KanMX进行融合，获得KanMX表达盒PTEF‑KanMX‑TTEF。所用引物如下：
[0038] TTEF‑F：tcagtactgacaataaaaagattcttgttttcaag
[0039] TTEF‑R：attaagggttctcgagagctcgttttc
[0040] KanMX‑F：cattagaaagaaagcatagcaatctaatctaagttttctagatgggtaaggaaaagactcacgtttc
[0041] KanMX‑R：cttgaaaacaagaatctttttattgtcagtactgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactg
[0042] （3）Cas9整合元件的构建
[0043] 以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增X‑2位点上游序列X‑2‑UP(GenBank:CP020132.1,Range194931‑195600)和下游序列X‑2‑DW(GenBank:CP020132.1,Range195613‑196019)，利用引物X‑2‑UP‑F和X‑2‑DW‑R进行重叠PCR，将X‑2‑UP、X‑2‑DW与Cas9表达盒和KanMX表达盒进行融合，获得Cas9整合元件X‑2‑UP‑PTEF‑Cas9‑TCYC‑PTEF‑KanMX‑TTEF‑X‑2‑DW。

[0044] 扩增X‑2‑UP所用引物
[0045] X‑2‑UP‑F：ggtgcaggggcagaaaatgc
[0046] X‑2‑UP‑R：gaagagtaaaaaaggagtagaaacattttgaagctatacgtgaccacttcgagagcaag[0047] 扩增X‑2‑DW所用引物
[0048] X‑2‑DW‑F：gaaaacgagctctcgagaacccttaatctgcataatcggcctcacagagg
[0049] X‑2‑DW‑R：agaaaagtagtgaggacaggcttaattgagc
[0050] 二、POT1敲除片段的构建
[0051] 以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增POT1基因ORF区上游序列POT1‑UP(GenBank:CP020131.1,Range41525‑41874)和下游序列POT1‑DW (GenBank:CP020131.1,Range39921‑40270)，随后利用引物POT1‑UP‑F和POT1‑DW‑R进行重叠PCR，将POT1‑UP和POT1‑DW进行融合，获得敲除POT1所需的同源修复片段Δpot1。

[0052] 扩增POT1‑UP所用的引物
[0053] POT1‑UP‑F：ttttgtgtcacgatcatcatcactatgtaatcttc
[0054] POT1‑UP‑R：tgcttttatgtagtgttatattcactctgtactcag
[0055] 扩增POT1‑DW所用的引物
[0056] POT1‑DW‑F：gtgaatataacactacataaaagcattttaatacttgataatagttaatattctccctttttattatgc
[0057] POT1‑DW‑R：tatggctatcgaatctcccccatg
[0058] 三、GAL80敲除片段的构建
[0059] 以酿酒酵母基因组为模板，扩增GAL80基因ORF区上游序列GAL80‑UP(GenBank:CP020135.1,Range171137‑171637)和下游序列GAL80‑DW(GenBank:CP020135.1,Range172946‑173271)，随后利用引物GAL80‑UP‑F和GAL80‑DW‑R进行重叠PCR，将GAL80‑UP和GAL80‑DW进行融合，获得敲除GAL80所需的同源修复片段Δgal80。

[0060] 扩增GAL80‑UP所用的引物
[0061] GAL80‑UP‑F：ccagatggaatcccttccatagagagaagg
[0062] GAL80‑UP‑R：caagcacagggcaagatgcttgacgggagtggaaagaacgggaaac
[0063] 扩增GAL80‑DW所用的引物
[0064] GAL80‑DW‑F：gtttcccgttctttccactcccgtcaagcatcttgccctgtgcttg
[0065] GAL80‑DW‑R：cgggtatgaagatcaggaacgc
[0066] 四、POX1和POX2表达元件的构建
[0067] 以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，分别扩增POX1和POX2基因CDS区及其下游终止子序列POX1‑TPOX1(GenBank:CP020129.1,Range108324‑110790)和POX2‑TPOX2(GenBank:CP020133.1,Range454085‑457060)；同时扩增双向启动子PGAL1‑GAL10(GenBank:CP020124.1,Range278744‑279411)，利用引物POX1‑TPOX1‑R和POX2‑TPOX2‑R进行重叠PCR，将POX1‑TPOX1、POX2‑TPOX2和启动子PGAL1‑GAL10进行融合，获得长片段TPOX1‑POX1‑PGAL1‑GAL10‑POX2‑TPOX2。与此同时，扩增IntA位点上游序列IntA‑UP(GenBank:CP020132.1,Range242421‑242777)和下游序列IntA‑DW(GenBank:CP020132.1,Range242778‑243122)。随后利用引物IntA‑UP‑F和IntA‑DW‑R进行重叠PCR，将IntA‑UP和IntA‑DW与长片段TPOX1‑POX1‑PGAL1‑GAL10‑POX2‑TPOX2进行融合，获得POX1和POX2表达元件IntA‑UP‑TPOX1‑POX1‑PGAL1‑GAL10‑POX2‑TPOX2‑IntA‑DW。

[0068] 扩增POX1‑TPOX1序列所用引物
[0069] POX1‑TPOX1‑F：atgacgagacgtactactattaatcccgattc
[0070] POX1‑TPOX1‑R：atttttttactactatacattggtaaatgtagtcatgtcattg
[0071] 扩增POX2‑TPOX2序列所用引物
[0072] POX2‑TPOX2‑F：atgcctggaaatttatccttcaaagatagag
[0073] POX2‑TPOX2‑R：tgactatctctctcttcatagtcttcccatc
[0074] 扩增PGAL1‑GAL10序列所用引物
[0075] PGAL1‑GAL10‑F：cgaatcgggattaatagtagtacgtctcgtcatttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttggatggacgc
[0076] PGAL1‑GAL10‑R：ctctatctttgaaggataaatttccaggcattatagttttttctccttgacgttaaagtatagaggtatattaac
[0077] 扩增IntA‑UP序列所用引物
[0078] IntA‑UP‑F：cgattgctccactcataagaggc
[0079] IntA‑UP‑R：catgactacatttaccaatgtatagtagtaaaaaaatgctgctcttgaatggcgacag[0080] 扩增IntA‑DW序列所用引物
[0081] IntA‑DW‑F：gatgggaagactatgaagagagagatagtcaaacaggcatgggaagattcgc
[0082] IntA‑DW‑R：ctttcacagggttctctttgatcacctc
[0083] 五、TES1表达元件的构建
[0084] 以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增TES1基因CDS区(GenBank:CP020132.1,Range473150‑474199)，同时扩增GAL7上游启动子序列PGAL7(GenBank:CP020124.1,Range275919‑276643)和下游终止子序列TGAL7(GenBank:CP020124.1,Range274316‑274817)。然后，利用引物PGAL7‑F和TGAL7‑R进行重叠PCR，将TES1，PGAL7和TGAL7进行融合，获得TES1表达元件PGAL7‑TES1‑TGAL7。

[0085] 扩增TES1序列所用引物
[0086] TES1‑F：gataaaaaaaaacagttgaatattccctcaaaaatgagtgcttccaaaatggccatgtc[0087] TES1‑R：gaaaaaatatgatatgaatgaatattccactttcttttcagaacttggctcgaatgtctcg[0088] 扩增PGAL7序列所用引物
[0089] PGAL7‑F：tttgccagcttactatccttcttgaaaatatgc
[0090] PGAL7‑R：ttttgagggaatattcaactgtttttttttatcatgttg
[0091] 扩增TGAL7序列所用引物
[0092] TGAL7‑F：aaagaaagtggaatattcattcatatcatattttttctattaactgcc
[0093] TGAL7‑R：cgacaatgagccttgctgcaac
[0094] 六、ADC表达元件的构建
[0095] ADC为来源于Clostridiumacetobutylicum的乙酰乙酰盐脱羧酶编码基因，按照酿酒酵母的密码子偏好性进行优化，其序列如下(SEQIDNO：1)：atgttgaaagacgaagtcataaagcaaatatccacaccattgacaagtccagcattcccaagaggtccttacaagttccataatagagaatacttcaacatcgtttacagaactgatatggatgcattgagaaaagttgttccagaaccattggaaatcgatgaaccattagttagattcgaaatcatggcaatgcatgatacttcaggtttaggttgttatacagaatcaggtcaagctattccagtttcttttaatggtgttaagggtgactatttgcatatgatgtacttagataacgaaccagctattgcagttggtagagaattgtcagcttatccaaagaaattgggttacccaaagttgttcgttgattctgatactttggttggtacattggattacggtaaattgagagttgctactgcaacaatgggttacaagcataaggctttggatgcaaacgaagctaaggatcaaatctgtagaccaaactacatgttgaagatcatcccaaactacgatggttctccaagaatctgtgaattgattaatgcaaagattactgatgttacagttcatgaagcttggactggtccaacaagattgcaattgttcgatcatgctatggcaccattgaacgatttgccagttaaggaaatcgtttcttcatctcatattttagcagacattattttaccaagagcagaagtcatctacgattatttgaagtccaagttgtga。
[0096] 扩增ADC序列所用引物
[0097] ADC‑F：gattaacataataaaaaaaataattctttcataatgttgaaagacgaagtcataaagc[0098] ADC‑R：gcgtctcacttcaaacgcatcacaacttggacttcaaataatcg。
[0099] 以人工合成的质粒为模板，利用引物ADC‑F和ADC‑R进行PCR，扩增ADC序列；同时以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增GAL2启动子PGAL2(GenBank:CP020134.1,Range289546‑290250)和终止子序列TGAL2(GenBank:CP020134.1,Range291976‑292319)，利用引物PGAL2‑F和TGAL2‑R进行重叠PCR，将ADC，PGAL2和TGAL2进行融合，获得ADC表达元件PGAL2‑ADC‑TGAL2。

[0100] 扩增PGAL2所用引物
[0101] PGAL2‑F：ctgtactaatccaaggaggtttacggacc
[0102] PGAL2‑R：tatgaaagaattattttttttattatgttaatcttgtgtttacttaactattac
[0103] 扩增TGAL2所用引物
[0104] TGAL2‑F：tgcgtttgaagtgagacgctcc
[0105] TGAL2‑R：gaccccccagagataagtctgg。
[0106] 七、PXA1表达元件的构建
[0107] 以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，分别扩增PXA1基因及其终止子序列PXA1‑TPXA1(GenBank:CP020138.1,Range273493‑276399)，JEN1启动子序列PJEN1(GenBank:CP020133.1,Range21282‑22238)及IntB位点上游序列IntB‑UP(GenBank:CP020133.1,Range93660‑93988)和下游序列IntB‑DW(GenBank:CP020133.1,Range93989‑94360)，通过重叠PCR技术，利用引物IntB‑UP‑F和IntB‑DW‑R将上述片段进行融合，获得PXA1表达元件IntB‑UP‑PJEN1‑PXA1‑TPXA1‑IntB‑DW。

[0108] 扩增PXA1‑TPXA1所用的引物
[0109] PXA1‑F：caaagagattaaatactgctactgaaaatatgtcaacaacattagcagcaccagc
[0110] PXA1‑R：cccaatcctcaaaaataaaatggcccttcagttttttgttttacagtatatgtttccatgaaaagg
[0111] 扩增PJEN1所用的引物
[0112] PJEN1‑F：cattgtcttccattcagagtctaatcgaacg
[0113] PJEN1‑R：attttcagtagcagtatttaatctctttg
[0114] 扩增IntB‑UP序列所用的引物
[0115] IntB‑UP‑F：gagatctaccacccaaccggc
[0116] IntB‑UP‑R：caaaattagagacatatcgtagaaatcagacgc
[0117] 扩增IntB‑DW序列所用的引物
[0118] IntB‑DW‑F：gaagggccattttatttttgaggattggg
[0119] IntB‑DW‑R：gagcaggagccaatagtagtcgg。
[0120] 八、PXA2表达元件的构建
[0121] 以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，分别扩增PXA2基因及其终止子序列PXA2‑TPXA2(GenBank:CP020133.1,Range85913‑88795)，JEN1启动子序列PJEN1及IntC位点上游序列IntC‑UP(GenBank:CP020134.1,Range830290‑830742)和下游序列IntC‑DW(GenBank:CP020134.1,Range830743‑831160)。然后通过重叠PCR技术，用引物IntC‑UP‑F和IntC‑DW‑R将上述片段进行融合，获得PXA2表达元件IntC‑UP‑PJEN1‑PXA2‑TPXA2‑IntC‑DW。
[0122] PJEN1序列及扩增该片段所用引物见（7）PXA1表达元件的构建部分。
[0123] 扩增PXA2‑TPXA2所用的引物
[0124] PXA2‑F：caaagagattaaatactgctactgaaaatatgatctcaacagcttctgcattttatcag[0125] PXA2‑R：ctataaaacttggttcactttataaaaaatggaaagttctcaggc
[0126] 扩增IntC‑UP所用的引物
[0127] IntC‑UP‑F：cctgacagttggaccaacgcaac
[0128] IntC‑UP‑R：cgttcgattagactctgaatggaagacaatgaacggggaaggaatagtacaaagttgg[0129] 扩增IntC‑DW所用的引物
[0130] IntC‑DW‑F：tactcaattcttgaagccaatttgtacaattcc
[0131] IntC‑DW‑R：ctggaggaatagccgctccc。
[0132] 九、ACO表达元件的构建
[0133] ACO为来源于Micrococcusluteus的酰基辅酶A氧化酶基因，按照酿酒酵母的密码子偏好性进行优化，其序列如下(SEQIDNO：2)：atgaccgtccacgaaaagttagcaccacaatccccaacacactccaccgaagttccaaccgatgtagccgaaatagcaccagaaagaccaactccaggttctttggatgctgcagctttagaagaagctttgttaggtagatgggcagctgaaagaagagaatcaagagaattggctaaagatccagcattatggagagatccattgttgggtatggatgaacatagagctagagttttgagacaattaggtgttttggttgaaagaaatgctgttcatagagcatttccaagagaatttggtggtgaagataatcatggtggtaatatttctgcatttggtgacttggttttagctgatccatcattgcaaattaaagctggtgttcaatggggtttattttcttcagcaattttgcatttgggtactgctgaacatcatagaagatggttgccaggtgctatggatttgtctgttccaggtgcttttgcaatgacagaaattggtcatggttctgatgttgcttcaattgcaactacagctacttacgatgaagcaacacaagaattcgttatccatactccttttaaaggtgcttggaaagattacttgggtaatgcagctttacatggtagagcagctactgtttttgcacaattgattacacaaggtgttaaccatggtgttcattgtttctacgttccaatcagagatgaaaaaggtgcatttttgccaggtgttggtggtgaagatgatggtttgaaaggtggtttaaacggtatcgataacggtagattgcatttcactcaagttagaatcccaagaacaaatttgttgaacagatacggtgacgttgcagaagatggtacatactcttcaccaattgcttctccaggtagaagatttttcactatgttgggtacattggttcaaggtagagtttctttgtcattagcagctactacagcatcatttttgggtttacatggtgctttagcatacgctgaacaaagaagacaattcaatgcttcagatccacaaagagaagaagttttgttggattaccaaaaccatcaaagaagattgatcgatagattggcaagagcttacgcagatgctttcgcatcaaacgaattggttgttaagttcgatgatgttttctctggtagatcagatactgatgttgatagacaagaattggaaacattggcagctgcagttaaaccattaactacatggcatgctttagatactttgcaagaagcaagagaagcttgtggtggtgctggtttcttggcagaaaatagagttacacaaatgagagctgatttggatgtttacgttactttcgaaggtgacaacacagttttgttgcaattggttggtaaaagattgttgactgattactctaaggaatttggtagattaaatgttggtgctgtttctagatacgttgttcatcaagcatcagatgctattcatagagctggtttgcataaagcagttcaatcagttgctgatggtggttctgaaagaagatcagcaaattggtttaaagatccagctgttcaacatgaattgttgactgaaagagttagagcaaagactgctgatgttgcaggtacattatctggtgctcgtggtaaaggtcaagctgcacaagctgaagcttttaatacaagacaacatgaattgatcgaagctgcaagaaatcatggtgaattgttacaatgggaagcttttactagagcattggaaggtatcacagatgaaactacaaagactgttttgacatggttgagagatttgttcgcattgagattgatcgaagatgatttgggttggtttgttgctcatggtagagtttcttcacaaagagctagagcattaagaggttacgttaatagattggctgaaagattaagaccatttgcattggaattagttgaagcttttggtttggaaccagaacatttgagaatggctgttgcaactgatgcagaaacacaaagacaagaagaagctcatgcatggtttacagctagaagagctgcaggtgaagaaccagaagatgaaaaagcagtaagagcaagagaaaaagcagcaagaggtagaagaggttga。
[0134] 扩增ACO所用引物
[0135] ACO‑F：atgaccgtccacgaaaagttagc
[0136] ACO‑R：tcaacctcttctacctcttgctgc
[0137] 以人工合成的质粒为模板，PCR扩增ACO序列；同时以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增GAL1启动子区PGAL1(GenBank:CP020124.1,Range279023‑279411)和终止子序列TGAL1(GenBank:CP020124.1,Range280999‑281348)，利用引物PGAL1‑F和TGAL1‑R进行重叠PCR，将ACO，PGAL1和TGAL1进行融合，获得ACO表达元件PGAL1‑ACO‑TGAL1。
[0138] 扩增PGAL1所用引物如下：
[0139] PGAL1‑F：tcttcaccggtcgcgttcc
[0140] PGAL1‑R：gctaacttttcgtggacggtcattatagttttttctccttgacgttaaagtatagaggtatattaac
[0141] 扩增TGAL1所用引物如下：
[0142] TGAL1‑F：gcagcaagaggtagaagaggttgagtatacttcttttttttactttgttcagaacaacttctc
[0143] TGAL1‑R：cgtcagttggcaacttgccaag。
[0144] 十、HTD表达元件的构建
[0145] 烯酰辅酶A水合酶基因HTD来源于解脂耶氏酵母，其核苷酸序列如下(SEQIDNO：3)：atgcagaccacccctttctcttcctctgctcccgcccagacctttggtgacaagaagtacgagcacatcctgacctccacccccgtccccaaggtcgctctcgtcaccctcaaccggcccaaggccctcaacgccctgtgcactcctctcattaaggagctgaacgaggctctccaggctgctgatgccgaccccaccattggcgccatcgttctcaccggatccgagaagtcctttgctgccggcgccgacatcaaggagatgaaggacaagaccgtcacttccgtgctcaacgagaacttcatcgaggagtggggcaacatggccaacatcaagaaacccatcattgctgccgtcaacggctttgccctcggtggtggatgcgagcttgccatgatggccgacatcatctacgccggcgccaaggccaagtttggccagcccgagatcaagcttggtgtcattcccggagctggaggaacccagcgactcacccgagccattggcctctaccgagctaaccactacattcttaccggagagatgttcactgctcagcaggctgctgactggggtctggccgccaaggtctacgagcccgcccagctcgttgacgagtccgtcaaggctgctgctcagatcgcctcttacggccagttggctgtccaggccgccaaggcttctgtccaccagtccgctgaggtcggtctccgagccggtctcgagtttgagcgagtccgattccacggtctctttggcacccacgaccagaaggagggcatggctgcttttgccgagaagcgagagcccaacttcaagaacgagtaa。去掉信号肽后氨基酸序列如下(SEQIDNO：7)：MQTTPFSSSAPAQTFGDKKYEHILTSTPVPKVALVTLNRPKALNALCTPLIKELNEALQAADADPTIGAIVLTGSEKSFAAGADIKEMKDKTVTSVLNENFIEEWGNMANIKKPIIAAVNGFALGGGCELAMMADIIYAGAKAKFGQPEIKLGVIPGAGGTQRLTRAIGLYRANHYILTGEMFTAQQAADWGLAAKVYEPAQLVDESVKAAAQIASYGQLAVQAAKASVHQSAEVGLRAGLEFERVRFHGLFGTHDQKEGMAAFAEKREPNFKNE。

[0146] 以解脂耶氏酵母菌株W29基因组为模板扩增HTD及其终止子THTD(GenBank:CP028449.1,Range1398832‑1400080)；同时以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增GAL2启动子PGAL2和IntD位点的上游序列IntD‑UP(GenBank:CP020134.1,Range
803152‑803422)和下游序列IntD‑DW(GenBank:CP020134.1,Range803438‑803816)。利用引物IntD‑UP‑F和IntD‑DW‑R进行重叠PCR，将HTD‑THTD，PGAL2，IntD‑UP和IntD‑DW进行融合，获得HTD表达元件IntD‑UP‑PGAL2‑HTD‑THTD‑IntD‑DW。

[0147] PGAL2序列及扩增该片段所用引物见（6）ADC表达元件的构建部分。
[0148] 扩增HTD‑THTD序列（不含信号肽）所用引物
[0149] HTD‑THTD‑F：gtaaacacaagattaacataataaaaaaaataattctttcataatgcagaccacccctttctcttcctctg
[0150] HTD‑THTD‑R：acgcagtacaaggacgcgttaagaaaaatttcgagagagtcgccgatattactctaaactggactgcacattttgttaag
[0151] 扩增IntD‑UP序列所用引物
[0152] IntD‑UP‑F：gcgggccaagaactggttcc
[0153] IntD‑UP‑R：ccgtaaacctccttggattagtacagcataacgcgttacacggaaggagagc
[0154] 扩增IntD‑DW序列所用引物
[0155] IntD‑DW‑F：tatcggcgactctctcgaaatttttcttaac
[0156] IntD‑DW‑R：cggttaaaacagctgtagtgttctgg。
[0157] 十一、KR表达元件的构建
[0158] 3‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶基因KR来源于解脂耶氏酵母，其核苷酸序列如下(SEQIDNO：4)：atgaagaaggtcgactctctctccgtaattggcgccggccagatgggtctgggaatcgctctggtggctgccaacaaggccggtctccaggtcaacctcattgacgccaaccagggcgccctggacaagggtctcaagttcatggacaagctgcttgagaaggacgttggcaaaggccgtctgaccagcgacgaggcccaggccgtgcgaggccgggtcactggtcacaccaacctgcagtctgccgtggccgacgtggacatgatcattgaggcagtccccgagatccccaagctcaagtttgacatcttccgagacctcaacgagtggacccagaaggataccatcctggccaccaacacctcgtccatctccatcaccaagattgctgctgctgccggcgctggtgccccccgagtcatttctgcccacttcatgaaccccgtgcccgtccagaagggtgtcgagatcatcaccggcctgcagacctctcccgagaccctcgccaccaccctggaggttgtgaagcgaatgggcaagatcccttccatctccaaggactcccctggcttcctggctaaccgaatcctcatgccctacatcaacgaggccatcatcaccctcgagaccggtgttggagaaaaggaggacattgacaacattctcaagaacggctgtgccatgcccatgggaccccttgctctcgccgacttcattggtctcgatacttgtctcgccatcatgcgagtgctgtacgaggacactggtgactccaagtaccgaccctccgtcctgcttaacaagtacgtcgatgctggctggctcggaaagaagtctggaaagggcttctatgactactaa。去掉信号肽后的氨基酸序列如下(SEQIDNO：8)：MKKVDSLSVIGAGQMGLGIALVAANKAGLQVNLIDANQGALDKGLKFMDKLLEKDVGKGRLTSDEAQAVRGRVTGHTNLQSAVADVDMIIEAVPEIPKLKFDIFRDLNEWTQKDTILATNTSSISITKIAAAAGAGAPRVISAHFMNPVPVQKGVEIITGLQTSPETLATTLEVVKRMGKIPSISKDSPGFLANRILMPYINEAIITLETGVGEKEDIDNILKNGCAMPMGPLALADFIGLDTCLAIMRVLYEDTGDSKYRPSVLLNKYVDAGWLGKKSGKGFYDY。
[0159] 以解脂耶氏酵母菌株W29基因组为模板扩增KR及其终止子TKR(GenBank:CP028450.1,Range1171996‑1173279)；同时以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增GAL2启动子PGAL2和IntE位点的上游序列IntE‑UP(GenBank:CP020132.1,Range
229773‑230100)和下游序列IntE‑DW(GenBank:CP020132.1,Range230116‑230373)。利用引物IntE‑UP‑F和IntE‑DW‑R进行重叠PCR，将KR‑TKR，PGAL2，IntE‑UP和IntE‑DW进行融合，获得KR表达元件IntE‑UP‑PGAL2‑KR‑TKR‑IntE‑DW。

[0160] PGAL2序列及扩增该片段所用引物见（6）ADC表达元件的构建部分。
[0161] 扩增KR‑TKR序列所用引物
[0162] KR‑TKR‑F：gtaaacacaagattaacataataaaaaaaataattctttcataatgaagaaggtcgactctctctccgtaattgg
[0163] KR‑TKR‑R：gagctcgtccttttactagcatatcaatatccgtttcattgaaaagtggccttagtgcggttcagtattgagagttggcg
[0164] 扩增IntE‑UP序列所用引物
[0165] IntE‑UP‑F：tggaaaagctcactgtgaggttcc
[0166] IntE‑UP‑R：ggtccgtaaacctccttggattagtacagagtctcgtatgtcggctctcg
[0167] 扩增IntE‑DW序列所用引物
[0168] IntE‑DW‑F：ctaaggccacttttcaatgaaacggatattg
[0169] IntE‑DW‑R：agcgtaacagagtttcaacaacatgc。
[0170] 十二、FadM表达元件的构建
[0171] FadM为来源于大肠杆菌的酰基辅酶A硫酯酶编码基因，按照酿酒酵母的密码子偏好性进行优化，其序列如下(SEQIDNO：5)：atgcaaactcaaatcaaagtcagaggttaccacttggatgtatatcaacacgtcaataatgccagatacttagaatttttagaagaagcaagatgggatggtttggaaaactctgactcatttcaatggatgacagcccataatattgctttcgttgtcgtaaacataaacatcaactacagaagaccagctgtcttgtctgatttgttgactatcacatcccaattgcaacaattgaacggtaaatccggtatcttgagtcaagtaattaccttagaacctgaaggtcaagttgtcgctgatgcattgatcaccttcgtttgtatcgacttaaagactcaaaaagccttggcattggaaggtgaattgagagaaaagttagaacaaatggtaaagtga。
[0172] 扩增FadM所用的引物
[0173] FadM‑F：cctctatactttaacgtcaaggagaaaaaactataatgcaaactcaaatcaaagtcagagg[0174] FadM‑R：caatactcattaaaaaactatatcaattaatttgaattaactcactttaccatttgttctaacttttctctcaattc。
[0175] 以人工合成的质粒为模板，PCR扩增FadM序列；同时以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增GAL1启动子区PGAL1(GenBank:CP020124.1,Range278812‑279411)和FBA1终止子序列TFBA1(GenBank:CP020133.1,Range326217‑326416)，利用引物PGAL1‑F和TFBA1‑R进行重叠PCR，将FadM，PGAL1和TFBA1进行融合，获得长片段PGAL1‑FadM‑TFBA1。
[0176] 同时以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增IntF位点的上游序列IntF‑UP(GenBank:CP020134.1,Range839333‑839646)和下游序列IntF‑DW(GenBank:CP020134.1,Range839661‑839909)。利用引物IntF‑UP‑F和IntF‑DW‑R进行重叠PCR，将其与PGAL1‑FadM‑TFBA1进行融合，获得FadM表达元件IntF‑UP‑PGAL1‑FadM‑TFBA1‑IntF‑DW。

[0177] 扩增PGAL1序列所用引物
[0178] PGAL1‑F：acatggcattaccaccatatacatatccatatc
[0179] PGAL1‑R：tatagttttttctccttgacgttaaagtatagagg
[0180] 扩增TFBA1序列所用引物
[0181] TFBA1‑F：gttaattcaaattaattgatatagttttttaatgagtattg
[0182] TFBA1‑R：ctagttcgaatgatgaacttgcttgctgtcaaacttctgagttgccgctgaaagatgagctaggcttttgtaaaaatatc
[0183] 扩增IntF‑UP序列所用引物
[0184] IntF‑UP‑F：caaacaaggaaagggaaaatactgggtg
[0185] IntF‑UP‑R：ggatatgtatatggtggtaatgccatgtcaataaattcaaaccggttatagcggtctc[0186] 扩增IntF‑DW序列所用引物
[0187] IntF‑DW‑F：cagcggcaactcagaagtttgac
[0188] IntF‑DW‑R：gcgtgaacaccttatataacttagcccg。
[0189] 十三、MKS1表达元件的构建
[0190] MKS1为来源于Solanumhabrochaites的β‑酮酸脱羧酶编码基因，按照酿酒酵母的密码子偏好性进行优化，其序列如下(SEQIDNO：6)：atggaaaaatctatgtcaccattcgttaagaaacatttcgttttggttcatactgcatttcatggtgcttggtgttggtacaagatcgttgcattgatgagatcatctggtcataatgttacagctttggatttgggtgcttctggtattaatccaaagcaagcattgcaaatcccaaacttctctgattacttatcaccattgatggagtttatggcatctttgccagctaacgaaaagattatcttggttggtcatgctttaggtggtttggcaatttcaaaagctatggaaacttttccagaaaagatttctgttgcagttttcttgtcaggtttgatgccaggtccaaacatcgatgctactacagtttgtacaaaagcaggttctgctgttttgggtcaattggataactgtgttacttatgaaaacggtccaacaaatccaccaactacattgatcgcaggtccaaagttcttggctactaacgtttaccatttgtcaccaattgaagatttggctttagcaacagctttggttagaccattgtatttgtacttggcagaagatatctctaaggaagttgttttatcttcaaagagatacggttcagttaagagagtttttattgttgcaactgaaaacgatgctttgaagaaagaatttttgaaattgatgattgaaaagaatccaccagatgaagttaaggaaatcgaaggttctgatcatgttacaatgatgtcaaagccacaacaattgtttactacattgttatctattgctaataagtacaaataa。
[0191] 扩增MKS1所用的引物
[0192] MKS1‑F：atgataaaaaaaaacagttgaatattccctcaaaaatggaaaaatctatgtcaccattcgttaag
[0193] MKS1‑R：ttatttgtacttattagcaatagataacaatgtagtaaac。
[0194] 以人工合成的质粒为模板，PCR扩增MKS1序列；同时以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，扩增GAL7启动子区PGAL7和ADH1终止子序列TADH1(GenBank:CP020137.1,Range159411‑159702)，利用引物PGAL7‑F和TADH1‑R进行重叠PCR，将MKS1，PGAL7和TADH1进行融合，获得长片段PGAL7‑MKS1‑TADH1。

[0195] 同时以酿酒酵母CEN.PK113‑5D基因组为模板，IntG位点的上游序列IntG‑UP(GenBank:CP022976.1,Range67825‑68136)和下游序列IntG‑DW(GenBank:CP022976.1,Range68151‑68404)。利用引物IntG‑UP‑F和IntG‑DW‑R进行重叠PCR，将其与PGAL7‑MKS1‑TADH1进行融合，获得MKS1表达元件IntG‑UP‑PGAL7‑MKS1‑TADH1‑IntG‑DW。

[0196] PGAL7序列及扩增PGAL7所用引物见（5）TES1表达元件的构建部分。
[0197] 扩增TADH1序列所用引物
[0198] TADH1‑F：gtttactacattgttatctattgctaataagtacaaataattaattaacaattcttcgccagaggtttgg
[0199] TADH1‑R：tttccgtctgtacgcagcatttagcagagatttgccaatgccaagaaactccactagagcgacctcatgctatacctgag
[0200] 扩增IntG‑UP序列所用引物
[0201] IntG‑UP‑F：caggacgtctcgagcgctgatatc
[0202] IntG‑UP‑R：gcatattttcaagaaggatagtaagctggcaaatgcaatgggcttggtattccgtg[0203] 扩增IntG‑DW序列所用引物
[0204] IntG‑DW‑F：tagtggagtttcttggcattggcaaatc
[0205] IntG‑DW‑R：gtcttctcaggttccggcttcg。
[0206] 十四、gRNA质粒的构建
[0207] gRNA质粒的构建方法详见中国发明专利申请202110934151.4。本发明仅列出所用的gRNA质粒名称及其所含有的靶序列，如下：
[0208]
[0209] 实施例二、生产甲基酮的重组菌株的构建
[0210] 本发明中涉及的培养基及配方如下：
[0211] YPD培养基，每L体积YPD培养基包含：20g蛋白胨，10g酵母提取物，20g葡萄糖，20g琼脂粉(YPD固体培养基添加)。
[0212] 含卡那霉素的YPD平板，每L体积含卡那霉素的YPD培养基包含：20g蛋白胨，10g酵母提取物，20g葡萄糖，20g琼脂粉，50mg卡那霉素。
[0213] 无尿嘧啶添加的SD平板，每L体积无尿嘧啶添加的SD培养基含：8gUraminusmeida(北京泛基诺科技有限公司)，20g琼脂粉，20g葡萄糖。
[0214] 含5‑氟乳清酸的SD平板，每L体积含5‑氟乳清酸的SD含：8gUraminusmeida(北京泛基诺科技有限公司)，20g琼脂粉，20g葡萄糖，尿嘧啶60mg，5‑氟乳清酸1g。
[0215] Delft液体培养基，每L体积Delft液体培养基包含：20g葡萄糖，7.5g硫酸铵，0.5g七水硫酸镁，14.4g磷酸二氢钾，2ml微量金属盐母液(1L体积中含3.0g七水硫酸铁，4.5g七水硫酸锌，4.5g二水氯化钙，0.84g二水氯化锰，0.3g六水氯化钴，0.3g五水硫酸铜，0.4g二水钼酸钠，1.0g硼酸，0.1g碘化钾，19.0g乙二胺四乙酸二钠盐)，1ml维他命母液(1L体积中含0.05gD‑生物素，1.0gD‑泛酸，1.0g维生素B1，1.0g吡哆醇，1.0g烟酸，0.2g4‑氨基苯酸，25.0g肌醇)，40mg尿嘧啶。
[0216] 酿酒酵母感受态细胞的制备及转化：
[0217] 将出发菌单菌落于YPD培养基中30℃，250rpm过夜培养，计数过夜培养物细胞密度，以最终OD600nm=0.15的浊度转接至20mlYPD培养基。30℃，250rpm培养至OD600nm=1.2~2.4。使用无菌离心管3000g离心5分钟，收集细胞。弃培养液，把细胞悬浮于无菌水中，再同上离心。弃水，把细胞悬浮于1mL100mM醋酸锂中，转悬浮物到无菌离心管中；高速短时沉淀细胞，去除醋酸锂；悬浮细胞到4倍体系的100mM醋酸锂中并分装获得感受态细胞。

[0218] 取感受态细胞，3000g离心15秒，弃上清，依次加入240μLPEG(50％,w/v)，36μL1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因表达元件的混合物，剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃培养箱，温浴30分钟，随后置于42℃水浴20分钟；以
6000‑8000rpm离心15秒，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布至相应的筛选平板。

[0219] （1）重组菌株TMK01的构建
[0220] 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株CEN.PK113‑5D为常用的工程菌株，基因型为MATaMAL2‑8cSUC2ura3‑52。
[0221] 为了便于利用CRISPR/Cas9系统对菌株CEN.PK113‑5D进行遗传操作，首先将Cas9编码基因整合到其染色体上。以酿酒酵母CEN.PK113‑5D为出发菌株，制作感受态细胞，加入Cas9整合元件X‑2‑UP‑PTEF‑Cas9‑TCYC‑PTEF‑KanMX‑TTEF‑X‑2‑DW进行转化，涂布至含卡那霉素的YPD平板上筛选阳性克隆，将得到的菌株命名TMK01，并保存。
[0222] （2）重组菌株TMK02的构建
[0223] 以重组菌株TMK01为出发菌株，制作感受态细胞，加入gRNA质粒01及敲除POT1所需的同源修复片段Δpot1后进行转化，将转化后细胞涂布至无尿嘧啶添加的SD平板上筛选阳性克隆，然后挑选阳性克隆到含5‑氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为TMK02，并保存。
[0224] （3）重组菌株TMK03的构建
[0225] 为了避免在培养过程中添加半乳糖，并提高目的基因的表达水平，对半乳糖调节基因GAL80进行敲除。以重组菌株TMK02为出发菌株，制作感受态细胞，加入gRNA质粒02及敲除GAL80所需的同源修复片段Δgal80后进行转化，将转化后细胞涂布至无尿嘧啶添加的SD平板上筛选阳性克隆，然后挑选阳性克隆到含5‑氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为TMK03，并保存。
[0226] （4）重组菌株TMK04的构建
[0227] 以重组菌株TMK03为出发菌株，制作感受态细胞，加入gRNA质粒03及POX1和POX2表达元件IntA‑UP‑TPOX1‑POX1‑PGAL1‑GAL10‑POX2‑TPOX2‑IntA‑DW后进行转化，将转化后细胞涂布至无尿嘧啶添加的SD平板上筛选阳性克隆，然后挑选阳性克隆到含5‑氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为TMK04，并保存。
[0228] （5）重组菌株TMK05的构建
[0229] 以重组菌株TMK04为出发菌株，制作感受态细胞，加入gRNA质粒04及TES1表达元件PGAL7‑TES1‑TGAL7和ADC表达元件PGAL2‑ADC‑TGAL2后进行转化，将转化后细胞涂布至无尿嘧啶添加的SD平板上筛选阳性克隆，然后挑选阳性克隆到含5‑氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为TMK05，并保存。
[0230] （6）重组菌株TMK06的构建
[0231] 以重组菌株TMK05为出发菌株，制作感受态细胞，加入gRNA质粒05及PXA1表达元件IntB‑UP‑PJEN1‑PXA1‑TPXA1‑IntB‑DW和PXA2表达元件IntC‑UP‑PJEN1‑PXA2‑TPXA2‑IntC‑DW后进行转化，将转化后细胞涂布至无尿嘧啶添加的SD平板上筛选阳性克隆，然后挑选阳性克隆到含5‑氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为TMK06，并保存。
[0232] （7）重组菌株TMK07的构建
[0233] 以重组菌株TMK06为出发菌株，制作感受态细胞，加入gRNA质粒06及ACO表达元件PGAL1‑ACO‑TGAL1后进行转化，将转化后细胞涂布至无尿嘧啶添加的SD平板上筛选阳性克隆，然后挑选阳性克隆到含5‑氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为TMK07，并保存。
[0234] （8）重组菌株TMK08的构建
[0235] 以重组菌株TMK07为出发菌株，制作感受态细胞，加入gRNA质粒07及HTD表达元件IntD‑UP‑PGAL2‑HTD‑THTD‑IntD‑DW和KR表达元件IntE‑UP‑PGAL2‑KR‑TKR‑IntE‑DW后进行转化，将转化后细胞涂布至无尿嘧啶添加的SD平板上筛选阳性克隆，然后挑选阳性克隆到含5‑氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为TMK08，并保存。
[0236] （9）重组菌株TMK09的构建
[0237] 以重组菌株TMK08为出发菌株，制作感受态细胞，加入gRNA质粒08及FadM表达元件IntF‑UP‑PGAL1‑FadM‑TFBA1‑IntF‑DW和MKS1表达元件IntG‑UP‑PGAL7‑MKS1‑TADH1‑IntG‑DW后进行转化，将转化后细胞涂布至无尿嘧啶添加的SD平板上筛选阳性克隆，然后挑选阳性克隆到含5‑氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为TMK09，并保存。
[0238] 实施例三、重组菌株在生产甲基酮中的应用
[0239] （1）重组菌培养及产物提取
[0240] 在Delft液体培养基中分别活化重组菌株TMK02、TMK03、TMK04、TMK05、TMK06、TMK07、TMK08和TMK09。于Delft液体培养基中制备种子液(30℃，250rpm，24h)，以适当的接种量接种于含20mLDelft液体培养基的100mL三角瓶中，使转接后初始OD600nm=0.1，30℃，250rpm培养24h，然后加入2ml含有2‑十六烷酮的正十二烷，继续培养72h。最后，收集三角瓶中的正十二烷层，于12000rpm离心1min，收集上层有机相备用。

[0241] （2）菌体生产甲基酮的定性定量分析
[0242] 将收集的有机相物质用正己烷稀释50倍，用GC‑MS检测。GC‑MS测定条件：进样口温度280℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时4min；色谱柱：HP‑5ms(30m*0.25mM)；色谱条件：50℃，2min，30℃/min到140℃，10℃/min到300℃，保温1min；MS条件：FullScan：50‑
650。用甲基酮的标准品(sigma)进行定性定量。甲基酮的标准品为2‑壬酮，2‑十一烷酮，2‑十三烷酮和2‑十五烷酮的混合物，出峰时间分别为5.71min，7.176min，8.955min，和
10.941min。步骤（1）收集的有机相物质相应时间有出峰，表明步骤（1）收集的有机相物质均含有甲基酮。

[0243] 结果如图1所示，TMK02、TMK03、TMK04、TMK05、TMK06、TMK07、TMK08和TMK09的发酵4天时总甲基酮产量分别为2.45mg/L，3.41mg/L，2.26mg/L，12.41mg/L，13.70mg/L，11.5mg/L，15.29mg/L，21.03mg/L。

[0244] 该实施例证明，在酿酒酵母中敲除β‑酮酰辅酶A硫解酶基因POT1，可以生产甲基酮；强化过氧化物酶体途径，即过表达内源酰基辅酶A氧化酶基因POX1，(3R)‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶/2‑烯酰辅酶A水合酶2基因POX2，酰基辅酶A硫酯酶基因TES1，脂酰辅酶A转运蛋白编码基因PXA1/PXA2和外源β‑酮酸脱羧酶基因ADC，可以提高甲基酮产量；同时引入细胞质途径，即过表达外源酰基辅酶A氧化酶基因ACO，烯酰辅酶A水合酶基因HTD，3‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶基因KR，酰基辅酶A硫酯酶基因FadM和β‑酮酸脱羧酶基因MKS1，可进一步提高甲基酮产量。

专利地区：天津

专利申请日期：2022-04-25

专利公开日期：2023-11-10

专利公告号：CN114752516B