一种缓解或治疗霉菌毒素对细胞危害的生物解毒剂

专利名称：一种缓解或治疗霉菌毒素对细胞危害的生物解毒剂

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202010973786.0

专利申请（专利权）人：固原市畜牧技术推广服务中心,河南德邻生物制品有限公司,河南农业大学
权利人地址：宁夏回族自治区固原市原州区古雁西街3号

专利发明（设计）人：尹清强, 王晓敏, 张国坪, 谢建亮, 杨春莲, 常娟, 王平, 党晓伟, 朱群, 刘超齐, 李茂龙, 张瑞

专利摘要：本发明属于生物解毒剂技术领域，具体涉及一种缓解或治疗霉菌毒素对细胞危害的生物解毒剂。所述生物解毒剂由地衣芽孢杆菌1×105~1×107CFU/mL、凝结芽孢杆菌1×105~1×107CFU/mL、丁酸梭菌1×105~1×107CFU/mL组成；所述地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌购自广东省微生物菌种保藏中心；地衣芽孢杆菌保藏号GDMCC1.11，凝结芽孢杆菌保藏号GDMCC1.645，丁酸梭菌保藏号GDMCC1.676；所述霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素。基于一个总的发明构思，本发明还包括绿原酸、复合益生菌作为缓解或治疗霉菌毒素危害的生物解毒剂的应用。本发明通过使用绿原酸、复合益生菌、或绿原酸与复合益生菌的组合物来缓解霉菌毒素对细胞的损伤，从而实现对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的联合解毒。

主权利要求：一种缓解或治疗霉菌毒素对细胞危害的生物解毒剂
技术领域
[0001] 本发明属于生物解毒剂技术领域，具体涉及一种缓解或治疗霉菌毒素对细胞危害的生物解毒剂。
背景技术
[0002] 饲料中的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)和呕吐毒素(DON)等。AFB1对人和动物有明显的肝毒性、致癌性和致畸性，降低人和动物的免疫力及动物的生产性能；因此，被国际癌症研究机构(IARC)定为I类致癌物。ZEA具有类雌激素的作用，它可以提高雌性动物的雌激素水平，从而引起动物的生殖生理和生殖器官的功能和形态发生变化，导致细胞毒性和遗传毒性，易导致繁殖障碍。DON具有很强的细胞毒性和免疫抑制性，易产生动物食欲下降、呕吐和生产性能的降低。目前，全球25％粮食和饲料不同程度地受到霉菌毒素的污染，其中2种以上霉菌毒素共存的几率在70％以上，而且2种以上不超标的毒素的危害可能会远大于某一种超标的毒素，因而开展对多种霉菌毒素降解的研究就变得越来越重要。
[0003] 现有技术条件下，霉菌毒素去除方法主要依靠物理方法、化学方法、生物方法。物理解毒方法包括传统的浸泡、清洗，分拣，挑选，脱皮和碾磨等；以及一般的方法高温灭活、射线辐射处理、吸附以及萃取等。但由于物理吸附法仅对黄曲霉毒素的效果较好，而对其它霉菌毒素的吸附效果较差，吸附剂除吸附霉菌毒素外，还吸附维生素和矿物元素等营养物质，并且还存在着解吸附问题；因而，在生产中逐步被淘汰。化学方法主要是通过有机酸处理、碱处理、氧化剂处理或其它化合物对霉菌毒素进行处理，通过破坏其化学结构，从而降低或消除其毒性；其缺点是使用一些化学试剂的过程中会造成环境污染，对饲料中营养物质造成破坏，造成营养损失，生产成本高且难以产业化。生物学方法包括微生物的降解和酶解两种，具有高效、特异性强、环境友好、污染小的特点，成为消除霉菌毒素的最有效方法；因此，近些年来生物解毒法已成为人们研究的热点。

发明内容
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明的目的是提出一种缓解或治疗霉菌毒素对细胞危害的生物解毒剂，通过使用绿原酸、复合益生菌、或绿原酸与复合益生菌的组合物来缓解霉菌毒素对细胞的损伤，从而实现对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的联合解毒。
[0005] 为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 一种缓解或治疗霉菌毒素对细胞危害的生物解毒剂，所述生物解毒剂由地衣芽孢5 7 5 7 5
杆菌1×10～1×10 CFU/mL、凝结芽孢杆菌1×10～1×10CFU/mL、丁酸梭菌1×10～1×
7
10CFU/mL组成；

[0007] 所述地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌购自广东省微生物菌种保藏中心；地衣芽孢杆菌保藏号GDMCC1.11，凝结芽孢杆菌保藏号GDMCC1.645，丁酸梭菌保藏号GDMCC1.676；

[0008] 所述霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素。
[0009] 优选的，所述黄曲霉毒素B1的浓度范围为10～30μg/L，所述玉米赤霉烯酮的浓度范围为150～450μg/L，所述呕吐毒素的浓度范围为500～1500μg/mL。
[0010] 一种缓解或治疗霉菌毒素对细胞危害的生物解毒剂，与上述生物解毒剂的不同之5 7
处在于，所述生物解毒剂由绿原酸200～600μg/mL、地衣芽孢杆菌1×10～1×10CFU/mL、凝
5 7 5 7
结芽孢杆菌1×10～1×10CFU/mL、丁酸梭菌1×10～1×10CFU/mL组成。

[0011] 优选的，所述生物解毒剂由绿原酸400μg/mL、地衣芽孢杆菌1×105CFU/mL、凝结芽5 5
孢杆菌1×10CFU/mL、丁酸梭菌1×10CFU/mL组成。

[0012] 进一步优选的，所述细胞为猪肠道细胞。
[0013] 基于一个总的发明构思，本发明还包括绿原酸作为缓解或治疗霉菌毒素危害的生物解毒剂的应用。
[0014] 如上所述的应用中，绿原酸的添加量为200～600μg/mL。
[0015] 基于一个总的发明构思，本发明还包括复合益生菌作为缓解或治疗霉菌毒素危害的生物解毒剂的应用，所述复合益生菌由地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌组成。
[0016] 如上所述的应用，所述复合益生菌与绿原酸同时使用。
[0017] 发明人从芽孢杆菌属、酵母菌属、乳杆菌科的十几种微生物中筛选出降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素效果较好的地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌。这三种微生物都是已经证明了的、对促进动物肠道健康具有显著功效的益生菌：地衣芽孢杆菌可调整菌群失调，促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌；能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖；地衣芽孢杆菌作为益生菌添加剂或药剂适用于细菌原因引起的肠道菌群失调症以及肠道需要保健的养殖类动物。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L‑乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖；凝结芽孢杆菌能够形成芽孢，与其他不产乳酸的芽孢杆菌相比有利于恢复胃肠道的微生态平衡。丁酸梭菌又名酪酸菌，具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌，促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长。丁酸梭菌做为饲料添加剂在动物肠道内可体现以下几种生物特性：一、促进动物肠道有益菌群(双歧杆菌,乳酸杆菌)的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生；二、在动物肠道内能产生B族维生素、维生素K、淀粉酶等物质，具有保健作用；三、丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质；四、丁酸梭菌属于厌氧或者兼性厌氧芽孢杆菌，不受胃酸、胆汁酸等影响。

[0018] 本发明通过构建黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素三种霉菌毒素共同作用模型，得出了三种霉菌毒素对于猪肠道细胞最高损伤处理和最低损伤处理的浓度，并以此为基础研究了地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌组成的复合益生菌对三种霉菌毒素的降解效果。本发明的研究结果表明，由地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌组成的复合益生菌能显著降低黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的联合毒力；地衣芽孢杆菌、5 5 5
凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌的菌体浓度分别为1×10 CFU/mL、1×10 CFU/mL、1×10 CFU/mL是降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素联合作用的较佳解毒剂组合。

[0019] 当以IPEC‑J2细胞为代表的肠细胞受到上述三种霉菌毒素损伤的情况下，选用绿原酸或者绿原酸与地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌的组合，在三种霉菌毒素高损伤处理条件下，能够将细胞相对活力由34.56％恢复至45.44％～58.55％；在三种霉菌毒素低损伤处理条件下，能够将细胞相对活力由53.24％恢复至81.51％～110.11％。
[0020] 上述结果表明，绿原酸、益生菌或绿原酸与益生菌的组合能够同时降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素三种霉菌毒素，当动物肠细胞受到三种霉菌毒素的危害时，将绿原酸、益生菌或绿原酸与益生菌的组合作为生物解毒剂，能够治疗或缓解霉菌毒素造成的动物细胞毒性和遗传毒性，是绿色、高效、特异性强生物解毒剂。
具体实施方式
[0021] 以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
[0022] 1、试验材料与方法
[0023] 1.1试验材料
[0024] 1)细胞系与菌株
[0025] 仔猪空肠上皮细胞(IPEC‑J2)由河南农业大学河南省动物源性食品安全重点研究试验室惠赠。所用的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis,GDMCC1.11)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans,GDMCC1.645)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum,GDMCC1.676)购自广东省微生物菌种保藏中心。
[0026] 2)化学试剂
[0027] 毒素纯品：黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)均购于Sigma公司，纯度＞99％。呕吐毒素(DON)购于源叶生物科技有限公司，纯度＞98％。胎牛血清、细胞冻存液、青链霉素混合液、高糖细胞培养基(High‑glucoseDulbecco’sModifiedEagleMedium，HGDMEM)、PBS缓冲液均购于BiologicalIndustries(KibbutzBeit‑Haemek,Israel)，
0.25％胰蛋白酶‑EDTA、thiazolylbluetetrazoliumbromide(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购于北京索莱宝科技有限公司。AFB1定量检测试剂盒(R‑BiopHarm，Germany)、ZEA定量检测试剂盒(R‑BiopHarm，Germany)、DON定量检测试剂盒(江苏苏微微生物研究有限公司)均购自相应的公司。绿原酸由河南德邻生物制品有限公司提供。

[0028] 1.2试验方法
[0029] 1)霉菌毒素试剂配制
[0030] 细胞培养液：10％胎牛血清、1％青链霉素混合液和89％高糖培养液(酚红15mg/L、碳酸氢钠3.7g/L、葡萄糖4.5g/L、谷氨酰胺584.6mg/L)充分混合均匀，4℃保存备用；
[0031] AFB1标准品的稀释：将3mgDON标准品溶解到3mL的甲醇中，混匀后分装于3个棕色瓶中，放于‑20℃冰箱中保存；
[0032] ZEA标准品的稀释：将10mgZEA标准品溶解到10mL的甲醇中，混匀分装到10个棕色瓶中，放于‑20℃冰箱中保存；
[0033] DON标准品的稀释：将1mgDON标准品溶解到1mL的甲醇中，混匀装于棕色瓶中，放于‑20℃冰箱中保存；
[0034] 霉菌毒素不同浓度培养液均现配现用，母液在稀释前用0.22μm一次性过滤器过滤除菌，然后用细胞培养液将霉菌毒素母液按照试验设计梯度稀释成不同的浓度。
[0035] 2)培养基配制
[0036] LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl10,充分搅拌溶解后用蒸馏水定容至5
1L,在121℃，1.035×10Pa条件下高压蒸汽灭菌20min,4℃保存；

[0037] MRS培养基(g/L)：胰蛋白胨15，葡萄糖20，磷酸氢二钾2，柠檬酸铵2，酵母浸粉10，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，无水乙酸钠2，吐温801mL,充分搅拌溶解后用蒸馏水定容至1L,在5
121℃，1.035×10Pa条件下高压蒸汽灭菌20min,4℃保存

[0038] 3)数据分析
[0039] 试验数据采用SPSS24.0软件进行onewayANOVA单因素方差统计分析，利用Duncan进行多重比较检验组别的差异，所有结果均以平均值±标准差表示，以P<0.05表示差异显著性。
[0040] 实施例1
[0041] 首先，利用不同浓度黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)和呕吐毒素(DON)对仔猪空肠上皮细胞(IPEC‑J2)进行毒性研究，具体过程如下：
[0042] 细胞复苏：将‑80℃保存的冻存细胞取出，迅速放进37℃恒温水浴锅中不断摇动，约1min左右细胞溶解完全，立即取出加入先前预热过的新鲜培养基2mL，1000r/min条件下离心5min,去除上清液，再次加入预热过的1mL含10％FBS和1％双抗的高糖培养液重悬细胞然后将1mL细胞悬液转入细胞培养瓶，再加入4mL的新鲜培养液。轻轻划十字将细胞悬液铺匀瓶壁。37℃、5％CO2的条件下培养,刚复苏的细胞24h后需要换液一次，待细胞长至瓶壁的80％‑90％时，进行细胞传代。

[0043] 细胞传代：将PBS缓冲液、细胞培养液，0.25％胰酶蛋白酶‑EDTA放进37℃的恒温水浴锅预热10分钟，弃去培养瓶中的旧培养液，用PBS缓冲溶液2mL冲洗2‑3次，弃去培养瓶中的缓冲液后加入1mL的胰酶胰蛋白酶‑EDTA消化液，转至培养箱中消化3min，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，此时细胞变圆、间隙变大或细胞从瓶壁像细沙般滑落，立即加入2mL培养液终止消化，用1mL移液器将培养瓶底部的细胞轻轻吹打下来，形成细胞悬液，转入5mL离心管中1000r/min条件下离心5min,弃取上清液，加入2mL培养液，重悬细胞，按照1:2的比例传代，每个培养瓶加入1ml细胞悬液再加4mL培养液，轻轻划十字铺匀细胞，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，约24h细胞能够长至瓶壁的80％‑90％。
[0044] 利用Design‑Expert8.0.6软件进行Box‑Behnken(BBD)响应面条件设计，考察不同霉菌毒素组合对IPEC‑J2细胞的损伤程度，具体试验因素及水平见表1；
[0045] 表1.BBD试验设计因素编码水平表
[0046]
[0047] 取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至96孔板，100μL/孔，每孔细胞数为1×4
10个，然后将细胞培养板置于CO2培养箱培养24h，吸弃掉原培养液，加入PBS缓冲液清洗一遍，分别加入不同浓度的用细胞培养液稀释的霉菌毒素(AFB1、ZEA、DON)；以高糖培养液处理的IPEC‑J2为对照组；每个条件做6个重复，结果取平均值。

[0048] 处理24h后每孔加入10μL的MTT(终浓度为0.5mg/mL)，37℃、5％CO2培养箱中共同孵化4h后，小心吸走培养液；加入150μL的DMSO，在低速振荡器上震荡10min使得甲瓒充分溶解。利用酶标仪测定细胞液在490nm和630nm处的吸光度值(OD值)，根据细胞活率计算公式得出细胞相对活力值，细胞活率计算公式为：
[0049] 细胞相对活力(％)＝(试验组OD490‑试验组OD630)/(对照组OD490‑对照组OD630)×100％。
[0050] 不同条件下细胞相对活力的响应面预测结果与实际试验测定结果见表2；
[0051] 表2.Box‑Behnken设计参数的响应值和细胞相对活力值结果对比
[0052]
[0053]
[0054] 注：同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，同列小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，下同。
[0055] 从表2可以看出，处理组1的相对细胞相对活力值最高，为50.05％；处理组17的细胞相对活力值最低，为39.02％；各处理组之间差异显著(P<0.05)。利用Box‑Behnken(BBD)进行数据模型拟合与分析，将模型预测的细胞高损伤处理组和细胞低损伤处理组，与上述实际测定的细胞高损伤处理组(处理组17)和细胞低损伤处理组(处理组1)进行试验验证，预测结果与验证结果对比见表3；
[0056] 表3响应面预测结果验证
[0057]
[0058] 从表中可以看出，模型预测的细胞低损伤处理组(AFB1、ZEA、DON添加量分别为10μg/L、150μg/L、600μg/L)细胞活相对力为53.01％(P＞0.05)，高于处理组1的细胞相对活力52.13％。，而模型预测的细胞高损伤处理组(AFB1、ZEA、DON添加量为30μg/L、150μg/L、1500μg/L)细胞相对活力为32.32％(P＞0.05)，低于处理组17的细胞相对活力36.34％。因此，根据数据模型拟合与分析确定后续试验中AFB1、ZEA、DON添加量分别为30μg/L、150μg/L、1500μg/L作为高损伤组的处理条件，确定AFB1、ZEA、DON添加量分别为10μg/L、150μg/L、600μg/L作为低损伤组的处理条件。

[0059] 实施例2
[0060] 发明人从芽孢杆菌属、酵母菌属、乳杆菌科的十几种微生物中筛选出降解AFB1、ZEA、DON效果较好的地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌。其中，地衣芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌是已报道的能缓解玉米赤霉烯酮(ZEA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)或呕吐毒素(DON)的益生菌，但是通常情况下，地衣芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌的应用仅针对上述三种霉菌毒素中的一种或两种，地衣芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌对上述三种霉菌毒素协同毒力的降解效果如何，之前并无报道。丁酸梭菌被报道可用于缓解DON，但是其在ZEA、AFB1上的解毒作用并无太多披露。
[0061] 发明人首先确定了地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌对三种霉菌毒素联合毒力的降解效果：
[0062] 取地衣芽孢杆菌按照2％的接种量接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃，180r/8
min，震荡培养24h后，测活菌浓度在1×10CFU/mL以上，待用；取凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌按照2％的接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中，37℃，静置培养24h后，测活菌浓度在1×
8
10CFU/mL以上，待用。

[0063] 按照实施例1中高损伤组和低损伤组的条件添加AFB1、ZEA、DON；分别加入1×6
10CFU/mL活化后的地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌或丁酸梭菌，反应体系5mL；于37℃，100r/min恒温摇床中震荡培养24h。每个条件设置三组平行。

[0064] 反应结束后，于10000r/min条件下离心5min，取上清液测定其中AFB1、ZEA、DON含量。不同毒素的降解率按照以下公式计算：
[0065] AFB1降解率(％)＝(对照组AFB1含量‑试验组AFB1含量)/对照组AFB1含量；
[0066] ZEA降解率(％)＝(对照组ZEA含量‑试验组ZEA含量)/对照组ZEA含量；
[0067] DON降解率(％)＝(对照组DON含量‑试验组DON含量)/对照组DON含量。
[0068] 地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌或丁酸梭菌对三种霉菌毒素的降解效果对比见表4和表5。
[0069] 表4三种益生菌对高损伤处理组AFB1、ZEA、DON降解效果的对比
[0070]
[0071] 表5三种益生菌对低损伤处理组AFB1、ZEA、DON降解效果的对比
[0072]
[0073] 从表4和表5可以看出，地衣芽孢杆菌在高损伤组和低损伤组中对三种霉菌毒素的降解效果均优于凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌。而从单一霉菌毒素的降解效果来看，在高损伤组中三种益生菌对于ZEA的降解效果最好，在低损伤组中三种益生菌对于DON的降解效果最佳。
[0074] 为了进一步优化对三种霉菌毒素联合毒力的解毒效果，提高益生菌在霉菌毒素降解上的效力，发明人将地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌进行复配，考察了复配益生菌组合对三种霉菌毒素联合毒力的降解效果：
[0075] 用拉丁方三因素三水平试验设计：以三种益生菌地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁5 6 7
酸梭菌为三因素，以菌体浓度1×10CFU/mL、1×10CFU/mL、1×10CFU/mL为三水平。反应体系为5mL；上述试验条件以相同体积的MRS培养基加等剂量的三种霉菌毒素作为空白对照(空白对照不含菌体)。每个条件设置三组平行；不同益生菌配伍对AFB1、ZEA、DON降解率的影响对比见表6和表7。

[0076] 表6高损伤处理组益生菌不同配伍比例对AFB1、ZEA、DON降解率的影响[0077]
[0078] 表7低损伤处理组益生菌不同配伍比例对AFB1、ZEA、DON降解率的影响[0079]
[0080]
[0081] 注：上表中地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌活菌数用菌体浓度的自然对数(lg)值表示。
[0082] 从表6高损伤处理组的数据可以看出，地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌按照不同比例进行复配，对三种霉菌毒素联合作用时AFB1、ZEA、DON的降解效果是不同的。当按照活菌lg值5:5:5复配后，对三种霉菌毒素联合作用下的AFB1、ZEA、DON降解率分别可以达到40.55％、56.05和47.22％，降解效果最优；且该复配条件下的降解效果优于地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌或丁酸梭菌单一菌种对三种霉菌毒素的降解效果。
[0083] 从表7低损伤处理组的数据可以看出，地衣芽孢杆菌：凝结芽孢杆菌：丁酸梭菌的活菌lg值为5:5:5时，对三种霉菌毒素联合作用时AFB1的降解效果最好，降解率达到43.05％；当地衣芽孢杆菌：凝结芽孢杆菌：丁酸梭菌的活菌lg值为5:7:7时，对三种霉菌毒素联合作用时ZEA和DON的降解效果最好，ZEA和DON的降解率分别为46.66％和97.00％。

[0084] 这里需要说明的是，在低损伤处理组三种益生菌按照活菌lg值5:5:5复配后，对三种霉菌毒素联合作用时AFB1和DON的降解率高于任意一种益生菌单独作用时的降解率，但是对ZEA的降解率略低于地衣芽孢杆菌单独作用时的效果。考虑到地衣芽孢杆菌单独作用6 5 5
时的菌体浓度为1×10 CFU/mL，高于三种益生菌按照1×10 CFU/mL、1×10 CFU/mL、1×
5
10CFU/mL添加后的益生菌浓度，因而总体而言可以得出，地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁
5 5 5
酸梭菌的菌体浓度分别为1×10 CFU/mL、1×10CFU/mL、1×10CFU/mL时是AFB1、ZEA和DON联合作用时的较佳解毒剂组合。

[0085] 实施例3
[0086] 实施例2中考察了不同益生菌或益生菌配伍对三种霉菌毒素联合作用时的降解效果。接着发明人考察上述益生菌组合对三种霉菌毒素联合处理后细胞的具体影响：
[0087] 取对数生长期IPEC‑J2细胞，常规消化计数后接种至96孔板，100μL/孔，每孔细胞4
数为1×10个，然后将细胞培养板置于CO2培养箱培养24h，吸弃掉原培养液，加入PBS缓冲液清洗一遍。

[0088] 加入不同浓度用细胞培养基稀释的霉菌毒素，并用益生菌和益生菌+绿原酸配伍组合分别处理；其中，高损伤组和低损伤组中AFB1、ZEA和DON的添加量参照实施例1，绿原酸的添加量为400μg/mL，益生菌为地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌按照菌体浓度1×5 5 5
10CFU/mL、1×10 CFU/mL、1×10CFU/mL复合而成。所述试验条件以仅加入培养基的处理组为空白组；每个处理条件设置四个平行。

[0089] 不同处理条件下的IPEC‑J2细胞培养24h后，于每个孔内加入10μL的MTT(终浓度为0.5mg/mL)，37℃、5％CO2培养箱中共同孵化4h后，小心吸走培养液，加入150μL的DMSO，在低速振荡器上震荡10min使得甲瓒充分溶解，测定490nm处吸光度，IPEC‑J2细胞相对活力用处理后的细胞OD值与未处理的细胞OD值的比值表示。不同处理条件下，IPEC‑J2细胞相对活力测定结果见表8和表9；

[0090] 表8不同处理条件下IPEC‑J2细胞相对活力测定结果(高损伤组)
[0091]
[0092] 表9不同处理条件下IPEC‑J2细胞相对活力测定结果(低损伤组)
[0093]
[0094]
[0095] 从表8高损伤组的结果可以看出，单独加入绿原酸后，IPEC‑J2细胞活力提高到105.91％(P<0.05)，高于空白组，说明绿原酸可以提高IPEC‑J2细胞活力；而单独加入复合益生菌后，IPEC‑J2细胞活力与空白组相比有所下降，为84.22％(P<0.05)。用AFB1、ZEA、DON分别为30μg/L、150μg/L、1500μg/L处理后，IPEC‑J2细胞活力降为34.56％，细胞活力受到严重影响。当加入霉菌毒素的同时加入绿原酸，IPEC‑J2细胞活力可恢复至58.55％；当加入霉菌毒素的同时加入复合益生菌组合，IPEC‑J2细胞活力能恢复至45.44％；而当加入霉菌毒素的同时加入绿原酸和益生菌组合，IPEC‑J2细胞活力恢复至57.55％。

[0096] 从表9低损伤组的结果可以看出，用AFB1、ZEA、DON分别为10μg/L、150μg/L、600μg/L处理后，IPEC‑J2细胞活力降为53.24％；加入霉菌毒素的同时加入绿原酸，IPEC‑J2细胞活力可以提高到110.11％，高于不用霉菌毒素处理的空白组；加入霉菌毒素的同时加入益生菌组合，IPEC‑J2细胞活力可以恢复至81.51％，低于不用霉菌毒素处理的空白组；而当加入霉菌毒素的同时加入绿原酸和益生菌组合，IPEC‑J2细胞活力能够提高到106.59％，高于不用霉菌毒素处理的空白组。
[0097] 上述试验结果表明，无论是在AFB1、ZEA、DON的低损伤处理组还是高损伤处理组，添加绿原酸均可以显著缓解三种霉菌毒素联合作用造成的IPEC‑J2细胞活力下降；而绿原酸与复合益生菌同时使用虽然从数值上看略低于单独添加绿原酸的条件，但是二者的统计分析差异并不显著(P>0.05)。考虑到该产品将在动物饲料中添加，细胞学试验与动物学试验的效果并不能完全等同，而且地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌都是已经证明了的，对促进动物肠道健康和提高机体免疫力方面具有显著功效的益生菌，因而发明人认为将绿原酸或绿原酸与益生菌的组合作为生物解毒剂，用于治疗或缓解霉菌毒素造成的动物细胞毒性和遗传毒性是有效且可行的。

专利地区：宁夏

专利申请日期：2020-09-16

专利公开日期：2023-09-19

专利公告号：CN112022882B